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1、本章主要内容一、分子诊断概述二、肿瘤的分子诊断三、分子诊断在肿瘤研究中的应用四、分子诊断发展前景及存在的问题分子诊断（moleculardiagnosis)概念：概念：一种疾病的发生常伴有相关基因变化，分子诊断是在分子水平上研究和探索疾病发生的分子基础的方法。分子诊断的特点：分子诊断的特点：灵敏度高特异性强适用范围广取材一般不受组织或时相限制分子诊断目前主要应用于分子诊断目前主要应用于人类遗传病的基因诊断和产前诊断人类遗传病的基因诊断和产前诊断肿瘤肿瘤感染性疾病病原体（细菌、病毒）感染性疾病病原体（细菌、病毒）多基因病多基因病组织器官移植配型组织器官移植配型性别鉴定性别鉴定法医学法医学医学分子
2、生物学基础研究应用医学分子生物学基础研究应用肿瘤的分子诊断肿瘤的分子诊断与肿瘤相关的基因n癌基因n抑癌基因nDNA错配修复基因癌基因：癌基因：是存在于致瘤病毒、人和动物细胞中能导致细胞恶性转化，促进细胞生长和增殖的一类基因。RasC-MetMycMdm2NeuBcl-2抑癌基因：抑癌基因：是正常细胞内存在的能够抑制细胞恶性转化，对正常细胞的增殖起负性调节作用的基因，抑癌基因失活后正常细胞增殖失控，转化形成肿瘤细胞。RbPTENAPCMCCVHLP53FHITWTIDPC4P16BRCANF1NF2nm23P15DCCHNPCC肿瘤分子诊断的基础肿瘤分子诊断的基础 基因改变基因改变 n点突变点突
3、变n基因扩增基因扩增n基因缺失、易位或重排基因缺失、易位或重排nDNADNA甲基化甲基化nDNA多态多态原癌基因恶性肿瘤激活方式abl慢性粒细胞白血病易位bcl2B细胞淋巴瘤 易位bcl3慢性粒细胞白血病易位cerbB鳞状细胞癌、星形细胞瘤扩增cerbB2乳腺癌、卵巢癌、胃癌扩增lym1B细胞淋巴瘤 易位pml急性前髓白血病 易位mycBurkitt淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、子宫癌易位Lmyc肺癌 扩增Nmyc神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤扩增Hras膀胱癌、胃癌、鼻咽癌、宫颈癌、黑素瘤、点突变Kras肠癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、胆囊癌、甲状腺癌、黑素瘤点突变Nras急性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白
4、血病、点突变生殖泌尿道癌、甲状腺癌、肝癌、黑素瘤ret甲状腺癌 重排Ksam胃癌 扩增sis星形细胞瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤？src、fes肠癌、急性早幼粒细胞白血病？tal1急性淋巴细胞白血病易位trk甲状腺癌 重排ros急性粒细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病？fms绒癌、外阴癌、畸胎瘤扩增常见原癌基因的激活方式和人类肿瘤常见原癌基因的激活方式和人类肿瘤点突变指基因在特定位置发生一个核苷酸的改变，使相应蛋白质的一个氨基酸改变，继而改变了蛋白质的空间构型和生物学功能。点突变1234567891011121314蛋苏谷酪赖亮缬缬缬甘丙甘甘甘缬ATGACGGAATATAAGCTGGTGGTGGTGG
5、GCGCCGGCGGTGTGGTC缬缬H-H-rasras基因的点突变基因的点突变正常P21蛋白细胞H-ras基因EJ/24膀胱癌H-ras基因肿瘤H-ras编码的P21蛋白Ras基因点突变及导致的肿瘤基因点突变及导致的肿瘤基因密码子点突变氨基酸改变肿瘤Hras12GGCGTC甘氨酸缬氨酸膀胱癌、胃癌、鼻咽癌、宫颈癌GGCGAC甘氨酸门冬氨酸乳腺癌、肠癌61CAGCTG谷氨酰胺亮氨酸膀胱癌、肺癌、黑素瘤CAGCGG甘氨酸精氨酸肾癌Kras12GGTCGT甘氨酸精氨酸膀胱癌GGTAGT甘氨酸丝氨酸胃腺癌、胆囊癌GGTTGT甘氨酸半胱氨酸肺癌、肠癌、慢性粒细胞白血病GGTGAT甘氨酸门冬氨酸胰腺癌
6、GGTGTT甘氨酸缬氨酸结肠癌、卵巢癌13GGCGAC甘氨酸门冬氨酸乳腺癌61CAACAT谷氨酰胺组氨酸肺癌CAACTA谷氨酰胺亮氨酸肺癌Nras12GGTAGT甘氨酸丝氨酸髓样增生综合征GGTGTT甘氨酸缬氨酸急性粒细胞白血病GGTGAT甘氨酸门冬氨酸急性粒细胞白血病、畸胎瘤13GGTCGT甘氨酸精氨酸肺腺癌GGTGTT甘氨酸缬氨酸急性粒细胞白血病GGTGAT甘氨酸门冬氨酸急性粒细胞白血病61CAAAAA谷氨酰胺赖氨酸神经母细胞瘤、纤维肉瘤、黑素瘤CAACAT谷氨酰胺组氨酸横纹肌肉瘤CAACTA谷氨酰胺亮氨酸早幼粒细胞白血病基因扩增是细胞原癌基因在细胞基因组内拷贝数的增加及其表达水平的增高。
7、n基因扩增是由于基因DNA的过度复制所致，常引起细胞核型改变，表现为出现无着丝点的双微粒体(DMs)和缺乏正常明暗交替染色带的均匀染色区（HSRs)。基因扩增8c-mycHSRDMs扩增原癌基因的扩增激活与人类肿瘤原癌基因的扩增激活与人类肿瘤扩增的原癌基因肿瘤cmyc白血病、乳腺癌、胃癌、肺癌、肠癌、神经母细胞瘤、胶质细胞瘤Nmyc神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、肺癌Lmyc肺癌erbB胶质细胞瘤、鳞状细胞癌erbB2乳腺癌、唾液腺癌、卵巢癌int2乳腺癌、膀胱癌、胃鳞状细胞癌hst乳腺癌、膀胱癌、胃癌abl慢性粒细胞白血病myb肠癌、白血病ets1淋巴瘤Hras膀胱癌Kras肺癌、卵巢癌、膀胱
8、癌Nras乳腺癌基因缺失基因片段的缺失是另一种主要的基因变异形式，缺失的范围差别较大，可以是1-2个碱基，也可以是一个片段或一个外显子的缺失。*杂合型缺失杂合型缺失 杂合型缺失杂合型缺失(lossofheterozygosity,LOH)同一患者正常细胞同一患者正常细胞DNA存在两个等位基因，而肿存在两个等位基因，而肿瘤组织瘤组织DNA中仅存在一个等位基因，因为肿瘤细胞单中仅存在一个等位基因，因为肿瘤细胞单条染色体中一个等位条染色体中一个等位基因基因缺失，把这种改变称为杂合型缺失，把这种改变称为杂合型缺失。缺失。图 13p25 LOH电泳图Fig 1LOH at 3p25 by electro
9、phoresis1：癌旁肺组织；26：NSCLC组织。其中3、4、6存在LOH。1:paracancerous lung tissue;26:NSCLC tissues.LOH at 3p25 occur in lane 3,4 and 6.图 23p14 LOH电泳图Fig 2LOH at 3p14 by electrophoresis1：癌旁肺组织；26：NSCLC组织。36存在LOH。1:paracancerous lung tissue;26:NSCLC tissues.LOH at 3p14 occur in lane 36.n正常组织杂合状态下等位基因有两条电泳带，当肿瘤组织等位D
10、NA两条带中的一条较正常等位基因带明显减弱(70)则认定为LOH(图1)。*杂合型缺失杂合型缺失用PCR微卫星多态性分析检测肝癌LOH。图1肝癌肿瘤组织等位基因杂合性丢失图例。方框下方示微卫星Marker名称，上方N-癌旁正常肝组织，T-肿瘤组织，箭头示肿瘤组织DNA其中一条等位基因条带丢失或明显减弱，即发生LOH。图示1号HCC病人在D10S1220，D10S1223，D10S2327和D16S539等位点发生LOH，35号病例在D1S482，D1S165，D16S2624和D16S413等位点发生LOH。某一基因在肿瘤细胞中从染色体的正常位置转移到其他染色体的某个位置上称为易位或重排。基因
11、易位、重排基因易位、重排n在一些肿瘤中可以见到异常的染色体，有的长些，有的短些。通过基因部分定位研究，证明在这些异常的染色体中发生了某些基因的易位和重排。n由于基因基因的易位和重排，原来无活性的原癌基因被移到某些强的启动基因或增强子附近而被活化，以致原癌基因表达增强，导致肿瘤的发生。基因易位、重排相互易位c-mycIgH814814正常染色体重排染色体IgH/c-mycBurkittBurkitt淋巴瘤淋巴瘤C-C-mycmyc基因的易位基因的易位人肿瘤中细胞癌基因的易位人肿瘤中细胞癌基因的易位细胞癌染色体染色体人类肿瘤基因定位易位N-myc2p25t(2;8)Burkitt淋巴瘤raf3p2
12、5t(3;8)肺癌和肾癌yes6t(6;14)急性淋巴细胞白血病、卵巢癌myc8q24t(8;14),(8;21)急性淋巴细胞白血病、Burkitt淋巴瘤abl9q34t(9;22),(6;9)慢性粒细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病fes15q25t(15;17)慢性粒细胞白血病sis22q12t(9;22),(8;22)慢性粒细胞白血病、Burkitt淋巴瘤DNA多态性群体中的不同个体或同一个体的不同染色体DNA核苷酸序列存在许多差异，尤其是非编码区域，大约每几百个碱基中就有一个存在着碱基取代或碱基替代现象，但表型并未改变，这种现象称为DNA多态性。实际上是染色体DNA中核苷酸排列顺序的改变
13、。DNA多态性nRFLPnVNTRn小卫星DNA多态n微卫星DNA多态n单核苷酸多态RFLP 数量可变的串联重复序列 variable number of tandem repeat,VNTR 人类基因组中含有一些重复序列家族，有些序列分散在基因组中，有些是以一系列短的重复序列排列组成高变区，其串联重复序列拷贝数可相差很多，约占单倍体DNA的10%，基本上位于非编码区。重复单位以670bp为多，重复次数约6100次，称为数量可变的串联重复序列。RFLP限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism）当当DNA序列的差异发生在
14、限制性内切酶识序列的差异发生在限制性内切酶识 别位点或当别位点或当DNA片段的插入、缺失或重复可使片段的插入、缺失或重复可使 基因组基因组DNA经经限制性内切酶水解后发生片段长限制性内切酶水解后发生片段长 度改变。因这些特异基因片段是限制性内切酶度改变。因这些特异基因片段是限制性内切酶 产生的，在不同个体间可出现不同长度的限制产生的，在不同个体间可出现不同长度的限制 性片段类型，故称为限制性片段长度多态性。性片段类型，故称为限制性片段长度多态性。概念概念小卫星小卫星DNA 细胞内基因组含有大量的细胞内基因组含有大量的碱基重复序列，一般将碱基重复序列，一般将670bp的串联重复称为小卫星的串联重
15、复称为小卫星DNA。微卫星微卫星DNA 将将14bp的串联重复序列称为微的串联重复序列称为微卫星卫星DNA，又称简单重复序列又称简单重复序列（simple repeat sequence,SRS)。微卫星不稳定性微卫星不稳定性 microsatelite instability,MI 是指简单重复序列的增加或丢失，特别是是指简单重复序列的增加或丢失，特别是在在DNA错配修复系统（错配修复系统（DNA mismatch system,DNAMMR)缺损的肿瘤基因组中常显缺损的肿瘤基因组中常显示大量的示大量的MI。微卫星不稳定性与肿瘤微卫星不稳定性与肿瘤微卫星不稳定性微卫星不稳定性MI与癌基因或抑
16、癌基因的变化之间无明显关系，即癌基与癌基因或抑癌基因的变化之间无明显关系，即癌基 因或抑癌基因的突变并不增加微卫星的不稳定性。因或抑癌基因的突变并不增加微卫星的不稳定性。MI与肿瘤的发展有关，与肿瘤的发展有关，MI仅在肿瘤细胞中发现，从未在仅在肿瘤细胞中发现，从未在 正常组织中检测到。正常组织中检测到。在原发与转移性肿瘤中，在原发与转移性肿瘤中，MI均匀分布于整个肿瘤。在晚期均匀分布于整个肿瘤。在晚期胃癌的胃癌的MI频率显著高于早期胃癌。频率显著高于早期胃癌。端粒酶与肿瘤的关系及检测端粒酶与肿瘤的关系及检测 端粒酶与肿瘤端粒酶与肿瘤 端粒：端粒：是位于细胞染色体末端的一种由是位于细胞染色体末端
17、的一种由220kb串联的短片段重复串联的短片段重复 序列（序列（TTAGGG)n及一些结合蛋白组成的特殊结构，在染色及一些结合蛋白组成的特殊结构，在染色 体定位、复制、保护和控制细胞生长寿命等方面具有重要作体定位、复制、保护和控制细胞生长寿命等方面具有重要作 用，用，并与细胞凋亡、细胞转化和永生化密切相关。并与细胞凋亡、细胞转化和永生化密切相关。端粒酶：端粒酶：为由为由RNA和蛋白质组成的一种核糖核蛋白复合物（和蛋白质组成的一种核糖核蛋白复合物（RNP)，含有端粒重复序列的模板，即以自身含有端粒重复序列的模板，即以自身RNA组分为模板，复组分为模板，复 制合成端粒序列。制合成端粒序列。目前有关
18、端粒酶活性表达的研究已覆盖了人类大部分的实体瘤。目前有关端粒酶活性表达的研究已覆盖了人类大部分的实体瘤。基因变异及其检测基因变异及其检测一、点突变一、点突变指基因在特定位置发生一个核苷酸的改变，使相应蛋白质的一个氨基酸改变，继而改变了蛋白质的空间构型和生物学功能。点突变的检测点突变的检测n等位基因特异性寡核苷酸分析法（等位基因特异性寡核苷酸分析法（allele-specific allele-specific oligonucleotide,ASOoligonucleotide,ASO）；）；n等位基因特异性扩增法（等位基因特异性扩增法（allele-specific amplificatio
19、n,allele-specific amplification,ASAASA）；）；n限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（restriction fragment length restriction fragment length polymorphisim,RFLPpolymorphisim,RFLP）分析；分析；nDNADNA测序；测序；n基因芯片基因芯片 一、已知点突变的检测点突变的检测点突变的检测 二、未知点突变的检测n单链构象多态性（单链构象多态性（single-strand conformational single-strand conformational polym
20、orphisim,SSCPpolymorphisim,SSCP）分析；分析；n杂合双链分析法（杂合双链分析法（HA)HA)；n变性梯度凝胶电泳法（变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradient gel denaturing gradient gel electrophoresis,DGGEelectrophoresis,DGGE）；）；n突变体富集突变体富集PCRPCR法；法；nDNADNA测序；测序；n基因芯片基因芯片二、基因扩增是细胞原癌基因在细胞基因组内拷贝数的增加及其表达水平的增高。基因扩增的检测核酸分子杂交核酸分子杂交n原位杂交原位杂交(insituhybridizati
21、on)和和 荧光原位杂交荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization)nDNA杂交杂交(Southernblot)n原位原位PCR(insituPCR)DNADNA的检测的检测原位杂交分类基因探针和靶核苷酸不同基因探针和靶核苷酸不同nDNA-DNA杂交nDNA-RNA杂交nRNA-RNA杂交探针的标记物是否能被直接检测n直接法n间接法原位分子杂交技术优点原位分子杂交技术优点n特异性强、灵敏度高，具有组织细胞化学染色的可见性特异性强、灵敏度高，具有组织细胞化学染色的可见性n既可用新鲜组织，又可用石蜡包埋组织作回顾性研究既可用新鲜组织，又可用石蜡包埋组织作回顾性研究
22、n所需样本量少，可用活组织细针穿刺和细胞涂片所需样本量少，可用活组织细针穿刺和细胞涂片n应用范围广，可对特定的基因（如癌基因、病毒基因）应用范围广，可对特定的基因（如癌基因、病毒基因）DNADNA、mRNAmRNA的表达进行定位、定性、定量、组织细胞分布和杂交电的表达进行定位、定性、定量、组织细胞分布和杂交电镜的亚细胞定位研究镜的亚细胞定位研究基因扩增的检测核酸分子杂交核酸分子杂交n Northern blotNorthern blot；n RT-PCR RT-PCR；n 基因芯片等基因芯片等。mRNAmRNA的检测：的检测：基因扩增的检测n免疫组织化学法（免疫组织化学法（immunohist
23、ochemistryimmunohistochemistry）；n联免疫吸附实验（联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA assay,ELISA）；）；n蛋白印迹（蛋白印迹（Western blotWestern blot）；n流式细胞仪测定法（流式细胞仪测定法（flow cytometryflow cytometry）；）；n影像细胞测试法（影像细胞测试法（image cytometryimage cytometry）蛋白质表达产物的检测：三、基因缺失、易位与重排杂合型缺失的检测杂
24、合型缺失的检测nPCR-RFLP法;nMI标记；基因缺失、易位、重排的检测n荧光原位杂交荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization,FISH）n比较基因组杂交比较基因组杂交（comparative genomic hybridization,CGHCGH）四、基因甲基化改变的检测四、基因甲基化改变的检测n限制性酶切结合电泳方法；限制性酶切结合电泳方法；nUvrABC切割试验切割试验五、五、DNADNA多态性及其检测多态性及其检测DNADNA多态性多态性RFLPMITelomereRFLPnSouthernblot；nPCR-RFLP检测检测微卫星不稳定性的
25、检测微卫星不稳定性的检测基本方法：基本方法：首先用PCR技术扩增所需的双核苷酸重复序列，然后用凝胶电泳分析DNA序列。优优 点：点：比RFLP及其他Southern杂交方法简易快速；可对单个细胞进行检测；可对石蜡包埋的组织进行回顾性研究，使检测目的更明确。端粒酶活性的检测基本方法TRAP法接近闪烁分析法TRAP-ELISA法原位杂交法分子诊断在肿瘤研究中的应用分子诊断在肿瘤研究中的应用n肿瘤的早期诊断n肿瘤的分类n肿瘤的个体化和预见性治疗n肿瘤的预后判断及检测肿瘤的早期诊断n胰腺癌：K-Ras基因的第12位编码子突变检出率达100%n结肠癌：PCR-RFLP方法检测结肠癌患者粪便中Ras基因突
26、变率达33.3%n高危人群的筛选和临床检测：结肠癌肿瘤易感基因的检测已明确的肿瘤易感基因及其相关肿瘤nRb1（视网膜母细胞瘤）nWT1（肾母细胞瘤）nP53（Li-Fraumeni综合征）nAPC（家族性腺瘤性息肉病）nHNPCC（遗传性非息肉病性结肠癌）nNF1（神经纤维瘤病）nVHL（VonHippel-Lindau综合征）nPTEN（Bannayan-Riley-Ruvalcaba综合征和Cowden综合征）nBRCA1（乳腺癌）肿瘤的分类n限制性酶切片段多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)：用于判断淋巴细胞增生与淋巴细胞性肿瘤及
27、其克隆起源nBcr区基因重排：可对慢性粒细胞白血病作出诊断并可与急性粒细胞白血病进行鉴别诊断nMyc基因检测：通过对N-Myc和C-Myc的扩增和表达检测，对鉴别神经母细胞瘤和神经上皮瘤具有应用价值肿瘤的个体化和预见性治疗基因的变化和基因间的信号传递与肿瘤临床治疗的敏感性密切关联，如能在分子水平上对肿瘤基因变化提供指标，对肿瘤的个体化和预见性治疗具有指导意义。肿瘤的预后判断nP53基因突变与乳腺癌、肝癌、结肠癌等多种肿瘤预后有关nNm23的状态与肿瘤转移有关肿瘤的预后检测n在白血病的临床治疗缓解期的白血病细胞仍达1011。n应用细胞遗传学分子诊断存在的问题1操作复杂2结果受多方面因素的影响（技术性假阳性和假阴性）3费用昂贵4局限于研究领域研究方向研究方向探索新途径诊断技术标准化诊断指标标准化设置严格的阴、阳性对照结果的判定严格遵守科学的原则