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1、1 1 2009 PerkinElmer 2009 PerkinElmer 2009 PerkinElmer 2009 PerkinElmer高敏HBV检测临床意义及产品考评工作汇报珀金埃尔默医学诊断孙祥杰电话：152021265162 2Ourmission愿景.forahealthiertodayandanevenbettertomorrowDedicated to improving the health and safety of people and the environment致力于改善人类的健康和促进我们生活环境的安全3 3国际治疗路线HBV优化治疗路线图策略优化治疗路线图策略
2、*由美国坦福大学医学中心Keeffe教授（专家组）提供4 4各指南推荐的治疗终点 AASLD 2007 APASL 2008 EASL 2009HBeAg(+)CHB 患者患者HBeAg血清转换血清转换 (唯一的终点唯一的终点)HBeAg血清转换血清转换和和/或或HBV DNA检测检测不不到到HBsAg 血清清除血清清除(“理想的终点理想的终点”)HBeAg 血清转换血清转换(“满意的终点满意的终点”)HBV DNA检测不检测不到到 HBeAg(-)CHB患者患者HBsAg血清血清清除清除 HBV DNA检测不到检测不到 以及以及ALT正常化正常化 HBsAg 血清清除血清清除(“理理想的终点
3、想的终点”)HBV DNA检测不检测不到到 5 5美肝会指南2008年美国肝病协会CHB防治指南：持久消除HBV是乙肝的治疗终点，HBVDNA病毒载量尽可能小于或等于10IU/ml。6 6欧洲肝病研究学会EASL2010年指南指出：将HBVDNA病毒载量尽可能控制在10-15IU/ml，能有效防止疾病的复发。欧肝会指南7 7乙型肝炎病毒定量检测试剂注册申报技术指导原则乙型肝炎病毒（HBV）DNA定量检测试剂注册申报技术指导原则8 8行业标准9 9专家意见庄庄辉、鲁凤民等辉、鲁凤民等，慢性慢性乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒DNA定量检测的临床意义定量检测的临床意义2012年年1010临床一线对超灵敏检
4、测试剂需求旺盛临床床阶段段 HBV DNA定量的目的定量的目的开始治疗前确定患者乙肝感染的基线水平选择针对性的药物避免盲目用药治疗过程中评估抗病毒治疗的效果及时监测是否发生耐药预测肝硬化、肝癌的发生风险治疗末期确定治疗终点为医生什么时候停止治疗提供可靠依据治疗结束每3-6个月定期监测HBV-DNA水平，监控疾病复发v传统传统定量定量产品满足不了临床产品满足不了临床需求需求 1111临床用核酸提取试剂乙肝定量kit48测试/盒国食药监械（准）字2013第3402077号2013年11月丙肝定量kit24测试/盒国食药监械（准）字2011第3400554号2011年5月核酸提取kit32测试/盒沪
5、青械备20140045号2014年12月1212高灵敏：高灵敏：HBV 检测下限：20 IU/ml (2013年11月已拿到新证)HCV 检测下限：15 IU/ml (预计16年3月拿到新证)国家国家CFDA技技术审评术审评中心中心HBV DNA/HCV RNA 定量定量试剂试剂技技术审评术审评指指导导原原则则中指出：中指出：HBV DNA最低最低检测限限应30IU/ml HCV RNA最低最低检测限限应 50IU/mlPKI临床高敏定量检测产品1313方法学方法学 method磁珠法磁珠法 paramagnetic particle method样本类型sample血清、血浆serumorp
6、lasma上样量samplevolume200400ul检测型别genotypesHBVA-H基因型线性范围LOQ20IU/mL-2*109IU/mL灵敏度LOD20IU/mL注册证号国食药监械（准）字2013第3402077号HBV产品性能1414高敏乙肝试剂对比试验开展单位北京大学医学部上海仁济医院湖北省人民医院上海第三人民医院温州医科大附属第一医院东营胜利油田中心医院昆明医学院第一附属医院沧州传染病医院中山大学附属第一医院北京三零二医院1515高敏乙肝试剂对比试验开展单位浙江PCR培训班现场评价重庆PCR培训班现场评价广州PCR培训班现场评价烟台PCR培训班现场评价16161717一、北
7、大医学部溯源性评价1重复性评价234临床血清盘评价线性范围评价1818Day 1:Genotype A Panel:WHO HBV Standard（NIBSC code:10/264）稀释均采用HBV 阴性人EDTA抗凝血浆：HBsAg negative and anti-HBcAb negativeGenotype A PanelRepeat 1Repeat 2Repeat 3PKI 稀释至20、50、200、2,000、20,000 IU/ml五个浓度值Day 2&3:repeat the above testing pattern1.WHO标准血清盘可溯源性检测方案1919理论值理论值
8、(IU/ml)理论值理论值(lg IU/ml)实测值实测值(lg IU/ml)相对偏差相对偏差(lg IU/ml)标准差标准差(lg IU/ml)200004.3014.210-0.0910.09520003.3013.248-0.0530.1442002.3012.3120.0110.145501.6991.7240.0250.111201.3011.4410.1400.225该该HBV定量试剂定量试剂具有良好的溯源具有良好的溯源性性PKIHBV定量试剂对WHO标准品溯源性检测结果2020灵敏度WHO标准品（A亚型）2E42E32E25020105LODcanreachto10IU/ml；a
9、bout70%of5IU/mlcouldbedetected.2121Day 1:Genotype B:卫生部临床检验中心（GBW09150）Genotype C:中国药品生物制品检定研究院Genotype D:SeraCare公司（WWHD301-10）Rep 1Rep 2Rep 3Rep 4Rep 5Rep 6Genotype B/C/DPanelPKI 稀释至20、50、200、2,000、20,000 和200,000 IU/ml六个浓度Day 2&3:repeat the above testing pattern2.HBVB/C/D亚型的重复性比较方案2222HBV基因基因型型理论
10、值理论值(IU/ml)理论值理论值(lgIU/ml)检测次数检测次数实测值实测值(lg IU/ml)相对相对偏差偏差(lg IU/ml)标准差标准差（lg IU/ml）LognormalCV%HBV B型型2000005.301185.3290.0280.0581.096200004.301184.3760.0750.1082.46420003.301183.3840.0830.1303.8312002.301182.4200.1190.1215.000501.699181.7760.0050.1649.235201.301181.4480.1470.23916.502HBV C型型20000
11、05.301185.3240.0230.0160.307200004.301184.3200.0190.0190.44020003.301183.3070.0060.0381.1652002.301182.340.0390.0421.815501.699181.7170.0180.0985.754201.301181.4340.1330.1278.863HBV D型型 2000005.301185.145-0.1560.0751.462200004.301184.251-0.0500.0721.69920003.301183.187-0.1140.1605.0082002.301182.229
12、-0.0730.2179.756501.699181.684-0.0150.25815.341201.301181.3010.0000.28722.068PKIHBV定量试剂对HBVB/C/D亚型标准血浆检测精密度评价该该HBV定量试剂定量试剂具有良好的重复性具有良好的重复性2323重复性临检中心标准品（B亚型）2E52E42E32E2503 repeat tests each concentration20Systemshowsgoodrepeatability2424Rep1Rep2Rep3高浓度假病毒颗粒PKI稀释至20、50、100、1000、100001.0E+10 IU/ml等 1
13、1个浓度值试剂盒线性范围：20-109 IU/ml3.线性范围评价方案2525改良Doumas法该该试剂的试剂的线性范围可达到（线性范围可达到（201E+09）IU/ml线性范围分析改良Doumas法2626E9E8E7E6E5E4E3E25020negativeSystemshowsgoodlinearrelationshipintheconcentrationrangeof201E9IU/ml.线性范围图27274.临床血清盘评价双盲法对比测试84例临床样本符合率100%其中2例样本低于两种检测试剂的检测下限20IU/ml，两种试剂均可检出。Demingregression（图）分析结果显
14、示：两中试剂的相关性较好（r=0.968，p0.0001）；二者关系为PKI=0.340+0.975*Roche；总符合率：总符合率：100%PKIposnegRochepos440neg040CorrelationwithRoche2828该HBV定量检测试剂在溯源性、精密度及线性范围方面均有良好表现，临床样本检测与进口试剂具有良好的相关性。试剂考评结论2929二、上海仁济医院溯源性评价/准确度评价1批内/批间重复性评价234临床血清盘评价线性范围评价5检测限评价3030Genotype A Panel:WHO HBV Standard（NIBSC code:10/264）稀释均采用HBV
15、阴性人EDTA抗凝血浆：HBsAg negative and anti-HBcAb negativeGenotype A PanelRepeat 1Repeat 2Repeat 3PKI 稀释至20、50、100、1,000、10,000 IU/ml五个浓度值1.WHO标准品准确度检测方案3131该该HBV定量试剂定量试剂具有良好的溯源性和准确度具有良好的溯源性和准确度PKIHBV定量试剂准确度检测结果3232Day 2&3&4:repeat the above testing pattern2.重复性比较方案批内重复:Rep 16次10号样本（2E7）浓度稀释至3E5，共8mlPKI 10号
16、样本（2E7）浓度稀释至3E3，共8ml批间重复:Rep 4次9个5次方浓度样本混合成8ml，分装4管PKI 9个3次方浓度样本混合成8ml，分装4管Day1:Day 1:直接测试直接测试16次次3333批内重复性检测结果该该HBV定量试剂定量试剂具有良好的重复性具有良好的重复性(CoefficientofVariance)3434批间重复性检测结果该该HBV定量试剂定量试剂具有良好的重复性具有良好的重复性3535Rep1Rep2Rep3高浓度假病毒颗粒PKI稀释至20、50、100、1000、100001.0E+10 IU/ml等 11个浓度值试剂盒线性范围：20-109 IU/ml3.线性
17、范围评价方案3636改良Doumas法该该试剂的试剂的线性范围可达到（线性范围可达到（201E+09）IU/ml线性范围分析Correlate37374.临床样本评价方案8次方浓度样本8个PKI3次方浓度样本8个7次方浓度样本8个2次方浓度样本8个6次方浓度样本8个5次方浓度样本8个4次方浓度样本8个1次方浓度样本8个Roche对比3838临床对比结果3939临床对比结果40405.检测限评价方案Genotype A Panel:WHO HBV Standard（NIBSC code:10/264）稀释均采用HBV 阴性人EDTA抗凝血浆：HBsAg negative and anti-HBc
18、Ab negativeGenotype A PanelRepeat 1Repeat 2Repeat 5PKI 稀释至50、20、10 IU/ml3个浓度值Repeat 3Repeat 44141检测限结果4242三、湖北省人民全血测评结果 on Chemagic 360相对相对于过柱于过柱法提取，磁法提取，磁珠方法提取珠方法提取全血有更高全血有更高的得率的得率4343湖北省人民全血测评结果 on Chemagic 360将全血原倍样本重复提取将全血原倍样本重复提取3次测试，并稀释次测试，并稀释5倍、倍、10倍测试，倍测试，结果表明磁珠方法提取全血具有更好的重复性、梯度关系结果表明磁珠方法提取全
19、血具有更好的重复性、梯度关系4444湖北省人民全血测评结果 on Chemagic 3604545四、北京302医院精密度46464747四、北京302医院临床样本对比4848四、北京302医院棋盘交叉污染测评4949UnbeatableSOLUTIONMagnet offRotation onMagnet onMagneticBeadsbasedon(PVA)1mchemagicSeparationTechnologyBloodSaliva/SwabsPlasma(Pathogens)StandardKitsfor:5050Pre-NAT技术特点-3转移磁珠而不采用转移液体的方式进行核酸提取
20、，可以有效的减少气溶胶的产生几率，具有良好的防污染效果，而且可以极大的减少样本处理时间。用旋转磁棒的方式进行液体搅拌，从而确保磁珠完全重悬并释放杂质。能够避免磁棒振动模式混匀、或者吹吸混匀的气溶胶产生的风险。通过电磁铁控制磁场，磁珠被转移到下一个提取组分中，无需转移液体。5151防污染措施1.紫外灯消毒，有效防止交叉污染。2.磁棒旋转式混匀，液面上升幅度小，可防止液体喷溅。3.转移磁珠的方法，减少了液体/气溶胶暴露的机会，从而减少污染。4.废弃枪头处理方式：直接打到专用垃圾袋，防止含病原体的枪头污染台面。5.每次实验后进行仪器清洁：75%酒精擦拭台面。6.使用滤芯枪头。7.MSM1排风口引到p
21、re-NAT外部，防止气流回流造成污染。8.设有移液回吸动作，防止阳性样本滴出造成污染。5252试验煮沸法合计阳性阴性PerkinElmer阳性04747阴性033合计05050表1 相对符合率分析五、与国内煮沸法HBV 低于500 IU/ml 样本结果测评分析1E3-E5IU/ml8%500-1E3IU/ml9%100-500IU/ml23%20-100IU/ml28%10-20IU/ml13%0-10IU/ml19%0IU/ml0%50例例临床阴性床阴性样本本PE高敏高敏试剂实测结果果简要分析：要分析：q国产试剂HBVPCR试剂500IU/ml的样本50例，均例，均报告阴性告阴性结果果;q
22、使用PerkinelmerHBVPCR试剂只检出3例阴性，其余其余47例均有例均有检测结果果；q20IU/ml浓度以上假阴性率达到64%以上，且个别结果达到E4E5高浓度样本漏检；可可见普通煮沸法普通煮沸法HBV 定量定量试剂临床漏床漏检率特率特别高，高，给临床床诊治治带来来错误的的诊断治断治疗依据。依据。5353试验一步法合计阳性阴性PerkinElmer阳性13092222阴性06464合计130156286表2 相对符合率分析与一步法 HBV PCR试剂 样本结果测评对比分析-11000500-1000100-50020-10010-200-101000500-1000100-50020
23、-10010-200-100圣湘PE0204060801001201400%5%10%15%20%25%30%35%40%45%50%115152371112412014345417232440.2%5.2%8.0%2.4%0.3%0.3%43.4%42.0%4.9%11.9%18.9%5.9%8.0%8.4%阳性数阳性率一步法一步法 HBV PCR试剂对比比情况分析情况分析：qPE与一步法平行对比HBV样本，总计286例；q一步法定量下限500IU/ml，即有156个样本报阴性或无结果，PE定量下限20IU/ml，总计64个样本不报结果。实际有92个弱阳性标本被漏报，占总检测数量的32.17
24、%，风险相当大；5454国产：曲线平台期不明显，扩增效率低重复性一般。PE：曲线呈典型S曲线，扩增效率高重复性非常好5555一一步法步法 HBV PCR试剂对比情况分析：比情况分析：q两例样本结果两种试剂差异较大，复测；q一步法HBV试剂检测准确性差，因杂质未去除，试剂抗干抗干扰能力差能力差，重复性差重复性差，不稳定。qPEHBV高敏试剂抗干抗干扰能力能力强，稳定，重复性好。定，重复性好。与一步法 HBV PCR试剂 样本结果测评对比分析-2样本本1一步法一步法内内标未起跳未起跳PE1.78E+06 IU/ml复复测复复测原倍原倍内内标仍未起跳仍未起跳1.7E+06 IU/ml稀稀释10倍倍3
25、.9E+05IU/ml样本本2一步法一步法9.92E+02IU/mlPE9.26E+01 IU/ml复复测复复测1.36E+02IU/mlPE9.68E+01 IU/ml5656Real time PCR普通普通PCRPKI-超灵敏超灵敏PCRPCR上上样量量2ul40ul体系20ul60ul提取提取DNA 方法学方法学煮沸法磁珠法优缺点（纯度度）杂质多扩增效率低 纯度度高扩增效率高超灵敏的超灵敏的PCRPCR（即（即高效率高效率高效率高效率）需要的各种条件）需要的各种条件较高较高:(1+x)n=AF，109 PCR产物分子高灵敏的关键要素5757PerkinElmer全自动核酸检测反应体系构
26、建系统-Pre-NAT仪器型号：Pre-NAT条码扫描：原始管上机，条码扫描读取仪器大小：2300mmx810mmx950mm样本通量：196个样本处理体积：最大1.2ml液体加样范围：5ul800ul处理时间：2小时完成96个样本的PCR体系构建加样器：4通道磁场控制：电磁铁提取方法：磁珠法-转移磁珠5858 Pre-NAT工作流程Pre-NAT 工作站工作站核酸提取、核酸提取、扩增前增前PCR反反应体系构建等体系构建等过程程无需人工操作无需人工操作将您从繁将您从繁琐的操作中解放出来的操作中解放出来Walk away5959Pre-NAT四大模块6060Pre-NAT操作界面175ul Ti
27、p头900ul Tip头试剂槽槽PCR八八联管管1.5ml管架管架样本架本架洗洗针槽槽深孔板深孔板磁棒套管磁棒套管垃圾槽垃圾槽6161客户操作流程-全自动核酸提取工作站启启动客客户端端软件件点点击开始按开始按钮运行运行仪器器Pre-NAT完成完成试剂分装、分装、样本本提取、提取、PCR反反应液准液准备根据根据软件提示完成件提示完成1.选择所需程序所需程序2.摆放所需耗材及放所需耗材及试剂3.扫码工作工作PCR扩增增约510min约120min约90min人工操作人工操作Walk away6262Accusense（精确液面感应）技术可以感应电离液和非电离液（如DMSO/甲醇等）。可以设置高，中
28、，低等感应灵敏度。可探测的最小体积试管中100L微孔板中50L每个通道取样头均具有液面感应功能，可独立探测液面并在Z轴方向独立运动，保证可同时操作具不同液面高度的离心管，减少一次性吸头外壁的吸附，精确移液。Pre-NAT技术特点-26363JANUS 4道移液臂（Varispan Arm）：Varispan（移液头间距调整）技术自动调节Tip头间的间距：9-20 mm(4 通道)9-40 mm(8 通道)Pre-NAT其他技术特点6464Pre-NAT其他技术特点模块化设计模块化设计，通过智能计算模块位置精准定位。仪器内部配件、载架均可移到外部进行冲洗。从而更有效的做到防止交叉污染。安全门设计仪器门意外打开，或按紧急制动按钮时，自动暂停程序，排除意外后程序继续进行，不会造成整批样本报废的情况。6565OurmissionWearetakingactiontoimprovethehealthandsafetyofpeopleandtheenvironment.为了改善人类健康和环境安全，我们不断在行动6666 2009 PerkinElmer 2009 PerkinElmer 2009 PerkinElmer 2009 PerkinElmerThanksforyourattention！