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1、第八章 抗体的分离纯化及测定食品学院廖振林第一节 抗体的分离纯化 无论是将抗体用于研究还是用于检测或临床治疗，均需对抗体进行分离与纯化。分离：将抗体从其存在的体液或培养液中分离出来并加以初步纯化。纯化：提高分离出来的抗体的纯度，并将其中的杂质控制在所需的低水平。对治疗性抗体尤为重要。分离纯化的方法可依据抗体的特性进行分离纯化：据蛋白质疏水性的差异，以盐析的方法将抗体与其他蛋白分开；据抗体带有电荷的不同，用离子交换，电泳等技术分离.按分离方法：沉淀、盐析、膜技术、电泳、色谱等。其中只有电泳和色谱法可以将抗体精细分离即纯化。一、盐析法（一）原理 蛋白质的溶解度在一定范围内随盐的浓度变化而变化。在低
2、盐浓度下溶解度随着盐浓度升高而增加，当盐浓度达到一定水平时，其溶解度又以不同程度下降并先后析出。其原理是由于蛋白质分子的极性基团有着静电引力，当水中加入少量盐类时，盐类离子与水分子对蛋白质分子上的极性基团的影响，使蛋白质在水个溶解度增大。但盐浓度增加到一定程度时，水的活度降低，蛋白质表面的电荷被中和，水化膜破坏，致使蛋白质分子相互聚集而沉淀。盐析法就是根据不同蛋白质在一定浓度的盐溶液中溶解度不同面达到彼此分离的方法。（二）盐的选择 蛋白质盐折常用中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最广的是硫酸铵，其优点是温度系数小，溶解度大(25时饱和溶解度为4.1mol/L，即7
3、67g/L)。在不同饱和度的硫酸铵溶液内，不同蛋白质依次析出，而且硫酸铵价廉易得，分段效果好，不容易引起蛋白质变性。硫酸铵浓溶液的pH常在4.55.5之间，市售的硫酸铵还常含有少量游离硫酸，pH往往在4.5以下，需用氨水调节其pH至7.0左右。(三)盐析时需注意的问题 1.盐的饱和度 盐的饱和度是影响蛋白质盐析的主要因素，不同蛋白质的盐析要求盐的饱和度不同。分离几个混合组分的蛋白质时，盐的饱和度常由低到高逐渐增加，每出现一种蛋白质沉淀进行离心分离后，再继续增加盐的饱和度，使第二种蛋白质沉淀。如用硫酸铵盐析分离血浆蛋白，当饱和度达20时，纤维蛋白原首先析出；饱和度增至2833时，优球蛋白析出；饱
4、和度达3350时，球蛋白析出；饱和度大于50以上时，清蛋白析出。免疫球蛋白常在饱和皮为33开始析出。2.pH 在等电点时，蛋白质溶解度最小容易沉淀析出。因此，盐析时除个别特殊情况外，pH常选择在被分离的蛋白质等电点附近。3.蛋白质浓度 在相同盐析条件下，蛋白质浓度越高越易沉淀，高浓度虽对沉淀有利，但浓度过高，也容易引起其它蛋白质的共沉淀，因此，必须选择适当浓度，尽可能避免共沉淀作用的干扰。4温度 出于高浓度的盐溶液对蛋白质有一定保护作用，盐析操作一般可在室温下进行，但在使用某些中性盐进行盐析时，温度对盐溶解度的影响比较明显。5.脱盐 蛋白质用盐析沉淀分离后，常需脱盐才能获得纯品。最常用的脱盐方
5、法是透析。通过透析袋内外的离子交换，最后使透析袋内溶液的盐浓度与外界相一致。当然，也可以使用凝胶过滤或超滤的方法除盐。二、膜分离技术 可以形象地将膜分离技术比喻成以多孔膜进行过滤或过筛子的过程。在实际操作时，由于膜上的孔很小，需使用一定的压力，才能将含有待分离物质的液体驱动通过分离膜，使具有不同分子量的物质或通过膜、或截留于膜上而得到分离。有多种膜技术可用于抗体的分离与纯化。但最基本的是使用超滤膜。超滤膜的孔径在1100nm之间，其截止到分子量的范围为几百至一百万，所需的驱动压力在0.11.0MPa左右。(一)超滤膜的基本性能 作为膜分离材料，超滤膜的基本性能可以用透水率和截留分子量加以表征。
6、1透水速率 在一定的驱动压力下，单位面积的膜在单位时间里所能透过的水的量称为该膜的进水率(Jf)。式中Jf为进水率，为渗透系数，P为压力差，是料液的渗透压差，是透过水流通道的长度，它正比于膜的厚度。通常情况下，由于很小，所以可以忽略不计、此时，透水率可简化表达为即透水率与操作压力成正比，与膜厚呈反比。由于膜在使用过程中会发生污染和孔结构的改变，因而在使用过程中，其透水率会逐渐发生变化。所以定义其初始运水量Qz和稳定透水量Qs之比为稳定系数Sm，即一般情况下，Sm=0.6-0.8,不同规格和品种的膜的透水率相差很大。同时，不同的操作条件与参数，也会对实际透水量产生影响，这些参数包括操作压力、料液
7、流速、温度以及料液的性质等。一般情况下，在膜使用的开始和结束时，可以实际测定一下透水率。当透水率已经降低时，应考虑将其清洗并再生，以恢复其透水率。2截留分子量 超滤膜的另一基本性能是标称截留分子量。它的定义是指溶液中被截留的溶质中最小的分子量。对于“截留分子量”这个指标，不应做机械式的理解。例如，使用截留分子量5万的膜时，分子量68万的牛血清白蛋白也可通透过去。这是因为，一方面，膜上的孔的大小是不均匀的，一般情况下，有一个孔径分布。另一方面，由于分子的形状不同且分子链具有柔性，分子量相同的线型分子和球型分子的透过率是不同的，线型分子更容易透过。通常，厂家给出的截留分于量指的是截留率90时，相对
8、应的蛋白质(或其它水溶性高聚物)的分子量。在实际使用时应注意以下几个问题：一般超滤膜的截留分子量曲线多呈S形(如图8-1)。S形透过率曲线的线性部分越陡，则截留性能亦越佳。蛋白质分子呈球形者其截留特性优于呈线性者。因此，应注意厂家给出的截留分子量是何种物质为样品所测定。一般情况下，裁留率顺序为：球蛋白支链高聚物直链(线型)高聚物。厂家给出的截留分子量是以单一蛋白质(或水溶性大分子)为样品所测定的。但是，实际样品往往极为复杂，如体系中有多种蛋白质存在时，膜的特性会因为浓差极化现象、凝胶层的形成”以及样品间形成复合物等现象而有所改变。图图8-1 截留分子量曲线截留分子量曲线(二)常用的超滤膜 用于
9、生化分离的超滤膜，因使用目的的不同，有很多不同的种类和规格。若按其制造材料分，有醋酸纤维素(CA)、三醋酸纤维素(CTA)、聚砜(PS)、聚酰胺(PA)、聚酰亚胺(PI)、聚丙烯腈轻(PAN)、聚醚醚酮(PEEK)以及聚偏氟乙烯(PVDF)等。其中，以醋酸纤维素和聚砜制备的膜最为常用。膜的使用形式有平板膜、平板膜堆、管式膜、卷式膜以及中空纤维膜。其截留分子量自500-30万不等，可按需要加以选择。例如，当分离IgG时，若使用截留分子量5万以下的膜，均可达到98的高截留率；使用截留分子量10万的膜，截留率下降至95。超滤膜的生产厂家很多，但适合于生化分离的产品也很有限。表8-1列出了代表件的厂家
10、及其产品。三 色谱法（一）概述 色谱(chromatography)，早期的文献上曾翻译为“层析”，具意义是很准确的。前国内使用较多的则是“色谱”一词。色谱是一种现代分离、分析方法，也是研究物理、化学和生物过程的很好的工具。色谱分离过程的本质是溶质在流动相和固定相之间分配的差异。任何两种不同的物质，只要它们存在有不同的物理、化学或生物学性质上的差异，而且还表现于在不同物相上分配系数的差异的话，它们便都可以在色谱过程中得到分离、分析或测定。这里，所谓不同的物相可以包括气相、液相、固相和超临界相。不同物相的配合，可以得到不同的色谱类型，如气相色谱系以气相为流动相，以固相或载有液相的固体为固定相进行
11、物质的分离；液相色谱则以液体为流动相，以广义的固相为固定相而进行分离。通常，均将固定相装填于柱子中，即以色谱柱的形式进行工作。因此，色谱柱是进行色谱分离的主要场所。发生在色谱柱中的分离过程受热力学因素和动力学因素的控制。为得到满意的分离，首先必须考虑固定相的性质从其与溶质相互作用的强弱，这主要体现在色谱柱填料(在生物学文献上常称为“介质”)的设计、合成及选择。为使不同的物质尽可能地得到分离，亦即色谱峰尽可能地高而窄(色谱学的术语称之为“谱带展宽尽可能地小”)，就需要对柱子进行优化设计并将填料填充成性能优良的柱子。同时，由于流动相的种类与使用条件既可影响动力学因素，又影响热力学因素，故必须正确地
12、选择并优化色谱条件，才能得到满意的分离。假设有两个溶质A和B，将它们注射进色谱柱后，便会在流动相的携带下通过色谱柱并获得分离。在柱子出口处设置一个检测器，便能记录下流经出口的溶质的浓度的变化。这种浓度时间曲线便是该物质的色谱图(图8-2)。色谱图上，可以见到溶质的色谱峰：如A峰、B峰。同时，也有不保留物质或杂质形成的峰。没有峰时的信号轨迹形成基线。从色谱图上，可以直接得到或通过计算得到一系列的色谱参数，如保留时间、峰高、峰宽等。表8-2汇总了主要的色谱参数及其定义。图8-2 色谱图及其参数上面所举出的各种色谱参数和名词中，最重要的是保留时间TR、保留体积VR、容量因子K、分离因子以及分离度R。
13、保留时间和保留体积指的是色谱峰出现的时间；容量因子，表示样品在固定相上的被吸附的程度；分离因子表示样品的选择性的大小；分离度则用以表示两个色谱峰分离的程度。按照分离原理的不同，可以将色谱方法分成不同的模式(表8-3)。当然，表中所例举的各种色谱模式，还可以再细分为不同的类别。在抗体的分离、纯化中，用得最多的是离子交换色谱、凝胶色谱与亲和色谱。在以色谱技术进行抗体的分离纯化时，还应注意柱色谱和高效液相色谱(HPLC)的区别，以便实现对样品的最有效、最合理的分离。在通常的柱色谱中，多使用软质凝胶或强度较好的半硬胶为基质，填料的粒径约40-150um。（二）凝胶过滤 凝胶过滤是体积排除色谱的一种。在
14、排除色谱中，溶质即待测样品组分，与填料(或介质)以及流动相之间没有额外的相互作用，样品只依据其分子体积(流动力学体积)的大小而分离。1953年，Porath和Flodin首先用交联预聚糖凝胶在水溶液中分离水溶性高分子，其商品名称即Sephadex，由于其突出的优点，立即得到了生物医药界的承认和广泛的应用。这种分离技术被称为凝胶过滤。1964年出现的以苯乙烯二乙烯苯共聚物为基质的不同孔径的有机高分子凝胶，解决了分子量几千至几百万的合成高分子的体积排除色谱分离问题。其后，体积排除色谱得到了快速发展并日臻完善，成为高效液相色谱家族中重要的一员。凝胶过滤色谱的突出优点：出峰迅速，任何组分的保留体积均在
15、Vi和V0之间，且不需要梯度淋洗；溶质与固定相(填料)和流动相之间没有相互作用；分离时不会滞留杂质或残留物在柱上，故柱寿命长；可用以测定生物大分子的分子量；生物相容性好，有很高的活性回收率；柱负载较大，利于制备分离。缺点：分辨率及峰容量均相对较低。1原理 凝胶过滤色谱是在装填有多孔性材料的色谱柱中进行的。多孔材料的孔有大有小。孔径有其“孔径分布”，当流动相携带分子量不同的溶质进入色谱柱后，因浓度差而可能渗入或扩散进入填料的孔中：也就是说，溶质在两相中的运动的动力是浓度梯度。但是，分子体积的大小，造成了在孔中扩散路径的差异，这可以从图8-3看出：单孔中的体积排除 形象地说，填料颗粒上的孔有大有小
16、，但对于溶剂分子来说，它们是足够大的，可以允许它们自由地扩散、进出。但是，对于体积大的分子来说，它们只能进入尺寸比它大的孔；对于比颗粒上的孔还要大的分子，则只能从孔旁流过。换句话说，分子量或分子体积较小时，能占有更多的孔体积。这样，分子体积不同的混合物一齐进入柱端时经过淋洗、扩散，总是体积大的分子先流出柱子，小分子物质(即体积小)因进入凝胶颗粒，行程延长而滞后流出从而使两者得以分离。2常用的凝胶种类凝胶是胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。用于凝放过滤的常用凝胶有以下几种：(1)交联葡聚糖凝胶(2)琼脂和琼脂糖凝胶(3)聚丙烯酰胺凝
17、胶(4)其它凝胶过滤介质(1）交联葡聚糖凝胶 交联葡聚糖凝胶（商品名为 Sephadex)，是最早出现的凝胶过滤介质。其基本骨架是葡聚糖，由许多右旋葡萄糖单位通过 l,6-糖苷键连接成链状结构，再由 3-氯-1,2-环氧丙烷作交联剂，将链状结构连接起来形成具有多孔网状结构的高分子化合物。其网孔大小可通过调节交联度和葡萄糖的比例以及反应条件来控制，交联度越大，网孔结构越紧密，交联度越小，网孔结构越疏松。交联葡聚糖凝胶化学性质稳定，可工作于pH 2-11范围内。表8-4列出了其规格性质。(2)琼脂和琼脂糖凝胶：琼脂来源于一种海藻，其结构为D-乳糖和3,6-无水-L-乳糖两种糖的残基所组成的多聚糖。
18、琼脂糖有较大的孔隙，允许较大分子渗入，能分离较高分子量的物质，其工作范围远大于交联葡聚糖和聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶的最大缺点是它带有大量电荷(主要是璜酸基，也有一定量的羟基)，过滤时常需使用较高离子强度的洗脱液，使分离物质中的盐浓度过高，影响纯度。因不同厂家而异，主要商品有Sepharose系列等，其种类和特性见表8-5。(3)聚丙烯酰胺凝胶：它是一种人工合成的凝胶，如生物凝胶-P(Bio-gel-P)，产品为颗粒状干粉，在溶剂中能自动吸水膨胀成凝胶。聚丙烯酰胺系内丙烯酰胺经自由基聚合而成的线性高聚物，与甲叉双丙烯酰胺共聚能生成交联的聚丙烯酰胺，经干燥粉碎或加压成形处理即成生物凝胶-P。除了
19、聚丙烯酚胺凝胶，完全是出碳碳骨架构成的机械强度较好，适宜作为凝胶过滤的介质。缺点是不耐酸，遇酸时酰胺键会水解成羧基，使凝胶带有一定的离子交换基团，影响其使用范围。（如表8-6）3凝胶的选择 前述各种凝胶在微观结构上是很相似的，它们都是三维空间网状交织的高分子聚合物。所能适用的分子量范围，主要决定于凝胶颗粒内部微孔孔径的大小。混合物的分离程度，则取决于凝胶的粒度和凝胶的结构。凝胶的粒度一般分为三级：4060筛孔属粗粒，100200筛孔属细粒250400筛孔属最细粒；也有的厂家将其按粒径划分，即粗(200600)、中(100300)、细(40160)和超细(2080)四级。其中，以细粒的应用较多，
20、因为它能使洗脱曲线的峰区变得对称而狭窄；使用过细的凝胶时，因洗脱阻力增大，使洗脱时间延长。与凝胶孔径大小有直接关联的是凝胶中的琼脂糖或葡聚糖的比例，以及凝胶的交联度；凝胶交联度越高，孔径越小，反之孔径就越大。应根据被分离物质分子量的大小与形状，选择不同孔径和文联度的凝胶。此外，如果用于脱盐，则宜选择Sephadex G25等排阻极限较小的凝胶。4凝胶的填装 商品凝胶是干燥的颗粒，使用前需充分膨胀。（煮沸可充分溶胀，消毒，除去凝胶中污染的细菌。排除气泡）。装柱前凝胶应充分洗涤，除去细颗粒，并减压抽气排除气泡。将处理好的凝胶以适宜的缓冲液悬浮起来，趁其尚未沉降时，均匀而连续地倾倒入垂直放置的空柱子
21、中。柱子的底部，应预先放有过滤网或筛板。开放柱子底部活塞或螺旋夹，令缓冲液流出，而凝胶则滞留在柱子中形成均匀而稳定的柱床。在这一过程中，切忌流干或部分流干。填装软凝胶的柱子时，须注意不可使凝胶受到过高的压力，不宜使用减压或加压的方法；而硬胶，即高交联度的凝胶，则可使用水泵减压或以蠕动泵驱动的方法加速柱床的形成。5凝胶柱的检查 样品的分离效果主要取决于装填起来的层析床是否均匀。为了确保分离效果，使用前应检查凝胶柱的质量。即用肉眼观察层析床是否均匀，有无“纹路或气泡，或向层析床加入大分子有色物质，观察色带移动。色带狭窄，均匀和平整即说明柱子性能良好。色带出现歪曲，散乱，变宽时必须重新填装柱子。（三
22、）离子交换色谱 1原理 在适宜的载体上，例如在纤维素，琼脂糖凝胶、交联的葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶以及各种合成高聚物型凝胶上，通过酯化、醚化或氧化等化学反应，引入具有碱性或酸性离子基团，便可制备出各种类型的离子交换填料。按照表面基团的不同，可以将离子交换填料分成阴、阳两类，其中又有强、中、弱之分。常见四种类型是：强阴型(SAX)，如N(CH3)3+(QAE)中阴型(MAX)，如一O一(CH2)2一N(C2H5)2 (DEAE)强阳型(SCX)，如一SO3-H+(SA)弱阳型(WCX)，如一OCH2COOH (CM)当离子交换填料带有阳离子基团时，便可交换阴离子样品，称之为阴离子交换树脂；当交换
23、剂带有阴离子基团时，便可交换阳离子样品，称之为阳离子交换树脂。将所需的离子交换树脂制备成柱后，便可将其用于蛋白质、酶、激素以及病毒等的分离。通过改变流动相的pH值和离子强度，便能以可逆的吸附和释放作用，在柱子上分离蛋白质样品，达到纯化之目的。由于各种蛋白质的等电点、分子大小、电荷及与离子交换剂结合的强度不同，故可利用不同的置换条件将它们分开。由于各种离子交换剂吸附和释放的能力不同，可以被不同的缓冲液洗脱。有些蛋白质层析时应改变洗脱液PH值。以减少蛋白质分子上的电荷数目；或适当增加盐类浓度，与蛋白质竞争结合位置，以减低静电键的结合可达到分离(表8-7)。2 常用离子交换剂 从原则上讲，任何亲水凝
24、胶均可以作为基质，再经过适当的化学修饰而制备出各种离子交换剂。因此，相应的离子交换剂也有纤维素、葡聚糖、琼脂糖等系列。根据离子交换剂的性能，又可分为阳离子交换剂，阴离子交换剂两大类。表8-8、8-9及8-10为常用的一些离子交换剂种类。3羟基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)羟基磷灰石是一种特殊的离子交换剂，其主成分为羟基磷酸钙。天然的羟基磷灰石属六方晶体，由于有很好的生物相容性，故可以用作生物医学材料。1983年Bio-Rad公司生产并开始销售由无定形羧基磷灰石填充的高效液相色谱柱。实际上，这种羟基磷灰石系由细小的片状结晶所织成，因而柱效、柱子的通透性以及柱床的稳定性均不是很好。
25、由于粒径的减小，使得色谱柱的阻力增高，只能用于高效液相色谱，而不能用于通常的柱色谱。正是由于羟基磷灰石的化学组成和晶体结构特性，使得它具有独特的分离机理。羟基磷灰石晶体上有两种不同的晶面，形成了两种具有不同吸附特性的吸附位点，即位于Ca2+离子上的吸附阴离子的位点和位于PO43-离子上的吸附阳离子的位点。而OH-不参与吸附过程。这种吸附作用的机理，使得它具有很高的吸附容量。4、离子交换剂的选择和处理 (1)选择：如前所述，离子交换剂由基质和带电的基团构成，常用的有DEAE和CM，前者为弱阴型，后者为弱阳型。常用的离子交换剂，既有阴、阳离子之分，也有强、弱之别。因此，应根据纯化蛋白质所带电荷性质
26、及结构，决定离子交换剂以及相应的淋洗条件的选择；如使用阴离子交换剂，则所应用的pH值应高于蛋白质等电点，以使蛋白质呈阴离子性反之亦然。此外，弱离子交换剂用于分离对电荷具有高亲和力的蛋白质，而强离子交换剂则用于分离对电荷具合较低亲和力的蛋白质(表8-11)。不过，一般不推荐使用强阳或强阴型离子交换剂，田其有导致蛋白变性之虑。离子交换刑的吸附能力(即样品的负载量)取决于离子交换基团的含量。离子交换基团愈多，交换量愈大，吸附容量亦愈大。通常，上样量在离子交换剂交换容量的5以下时，可获得较好的分离效果。但是，如考虑进行制备型分离，则可不受此限。(2)处理：处理纤维素离子交换剂时，一般允将所需量的交换剂
27、轻轻加入0.5molLNaOH溶液中，略加搅拌，待其自然沉降，室温静置30min后去除上清液。然后按0.5molLNaOH-0.5molL HCl-0.5molL NaOH顺序处理。每次更换前，需用蒸馏水充分洗涤至中性，CM纤维素和微粒型纤维素在碱洗时不易沉降，可加用0.5molL NaCl。葡聚糖制剂不需酸和碱处理，使用时将葡聚糖凝胶放于PBS缓冲液膨胀12d(室温)，或在中性溶液中煮沸2h，在处理过程中，避免强烈的搅动，以避免圆珠结构受损，但不需除去细粒。（四）亲和色谱1、原理 亲和色谱是利用生物分子间的专一性识别能力、即它们之间所具有的亲和力而设计的色谱技术：如抗原、半抗原与其抗体、蛋白
28、A和一些抗体之间，均具有专一性的亲和力，在一定条件下能紧密结合成复合物，而这种结合又是可逆的，改变条件可将它们解离。当把可结合的一对分子的一方（例如抗原）作为配基，通过一定的化学修饰及偶联反应将其固定化于惰性载体上，便制出了亲和填料，亦即亲和介质（图 8-4）。有时因为空间位阻效应的存在，使得被分离物难以接近固定化的配基以致会降低样品的负载量。亲和介质示意图 载体载体 空间臂空间臂 配基配基 配原配原 为此，可以在载体和配基之间连接 一个适宜长度的分 子链段，称为空间臂。将制得的亲和介质填装成亲和色谱柱，以适宜的缓冲液为流动相，并令亲和介质的对应物（如抗体）随流动相流过该色谱柱，则会因抗原-抗
29、体的亲和相互作用，使抗体被吸附于亲和介质上。此时，与该介质没有亲和相互作用力的其它物质，随流动相一起被冲出色谱柱。改变流动相的组成或淋洗条件，可以将（固定化的）抗原-杭体复合物解离，收集其流出液，便可以得到已纯化的抗体。从上述亲和色谱的原理可知，它具有极高的选择性。有时甚至可以仅用一步分离，便可得到纯度很高的产品。亲和力一对亲和物质的亲和力，可以用亲和常数，即结合常数来表示，用于亲和色谱时，这一常数不宜过高或过低。过高，则难以洗脱。过低，则因专一性差而选择性不佳。亲和力常数一般在103-108之间。2、载体的选择 使配体固相化的不溶性化合物称为载体。用于亲和色谱的理想载体应该具备下述特性：高度
30、亲水，使固相配体易于同水溶液中的相应结合物接近；惰性载体，使载体的非专一性吸附尽可能小；具有相当量的化学基团可供活化，并在温和条 件下能与较大量配体连接；有较好的物理化学稳定性，不易受周围条件(如pH、离子强度、温度、变性剂和去污剂等)的影响；具有多孔的网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过而增加配体的有效浓度；有良好的机械性能，利于控制色谱速度，最好是均一的珠状颗粒。可使用的胶的种类 凝胶色滞中所使用的各种凝胶，均可作为亲和色谱的载体。抗体纯化中常用的载体为琼脂糖凝胶，它是球状凝胶顾粒、球状琼脂糖凝胶亲水能力很强，物理和化学性质比较稳定。交联型凝胶，即机械强度较高的硬胶和半硬胶、在制备型抗
31、体分离上有其特点。它们可以使用较高的流速，从而可以得到较高的制备效率，也缩短了制备生产的周期。膜为载体的膜亲和色谱应用：所使用的膜材料可以是微滤膜也可以是超滤膜；既可用合成的分子膜，也可用滤纸等天然材料 将数层膜叠合起来制成膜色谱柱。3、配体的选择 在抗体的纯化中，既可以使用该抗体的抗原，也可以利用该抗体的有关特性去制备或寻找适合的亲和配体。抗原的类似物也可以用作为配基，尽管它们与抗体的亲和力一般较小，但选择适宜的条件，依然可以得到很好的分离效果；此外，固定化金属离子亲和色谱、以组氨酸为配基的亲和色谱以及利用亲和标签等方法，均可进行抗体的亲和色谱分离。(1)抗原：根据抗原和抗体能形成抗原-抗体
32、复合物的特性，发展了免疫亲和色谱。将可溶性抗原用化学方法偶联到不溶性载体(如sepharose 4B)上，使之固相化，并填装入适宜的色谱柱中，将相应的抗血清加入柱中，抗血清中相应的抗体就与抗原特异结合，其它蛋白成分随洗液流出。改变缓冲液的pH和离子强度，就可以使抗体和偶联在载体上的抗原分开而被洗脱下来，从而得到纯净的抗体。(2)蛋白A：蛋白A是金黄色葡萄球菌细胞壁的一种蛋白成分，它是单一的多肽链，分子量为42000，分为5个片段。从N末端开始有4个由58-62个氨基酸残基组成的高度同源的片段，每个片段都具有和IgG的Fc段结合的活性。但是，就整个蛋白A分子而言，只能与2个Fc段结合，这种结合是
33、一种疏水性作用。改变pH、盐浓度或加入有机溶剂，则可以将IgG从蛋白A洗脱下来。蛋白A具有良好的再生性，耐受低pH反复处理的性能极佳，并可采用高浓度的诸如尿素、盐酸胍或异硫氰酸钾等变性剂进行处理而不致受到破坏，大多数抗体都能耐受短暂的低pH处理。(3)蛋白G：蛋白G是链球菌表面的一种蛋白，分子量为30 000-35 000，它对免疫球蛋白的吸附机制与蛋白A相似。蛋白G对各种免疫球蛋白的吸附能力与蛋白A不同故在抗体的纯化上可与蛋白A互补。当某些抗体对蛋白A没有吸附能力时，它们往往会对蛋白G有吸附作用(表8-12，8-13)。(4)蛋白L：蛋白L是从厌氧链球菌细胞表面分离出来的一种蛋白质，分子量约
34、72 000。经研究发现，它可以专一地与链相结合。但是，它与链的结合力却很弱。经进一步的研究发现，也并不是所有的都和蛋白L有亲和力，V I亚群、V III亚群可以和蛋白L结合，而V II亚群及轻链的所有亚群则否。此外，蛋白L也能识别大鼠、小鼠、免和灵长类的链。这样，就有可能利用蛋白L为配基，以亲和色谱去分离人鼠杂交抗体和重组的小抗体片段。(5)蛋白H：蛋白H也是一种由链球菌(APl株)产生的表面蛋白。与前面介绍的几个蛋白不同的是，蛋白H与免疫球蛋白的结合具有温度依赖性。在22度时发生结合，盯在37度时则解离。它能以很高的亲和力与人IgGl-IgG4、人IgG Fc以及免IgG相结合。但是，不与
35、人IgA、1gD、IgE、IgM以及大鼠、小鼠、牛、绵羊和山羊的IgG相结合。蛋白H具有很强的种属专一性和温度依赖性。很温和的条件下，利用蛋白H去纯化重组人单抗及其片段。(6)组氨酸：早在10年前便已发现，以组氨酸为配基的亲和色谱，可用以分离IgG。关于组氨酸与IgG之间的亲和力，不同条件下有所差异。与组氨酸之间的亲和作用力恰好适于亲和色谱的要求。是一种简单、有效、方便、价廉的分离纯化IgG的亲和色谱配基。组氨酸可以固定于任何载体上，例如：常用凝胶、交联凝胶、高效凝胶、中空纤维以及其他膜材料上，非常适合制备分离之用。(7)固定化金属离子：利用带有整合基团的凝胶或树脂，将金属离子以整合作用吸附或
36、固定于其上。固定化的金属离子能和蛋白质分子链上的一些残基，如组氨酸相互作用，产生亲和作用力而实现蛋白质的分离。这种方法被称为固定化金属离子亲和色谱（IMAC)或称为金属整合亲和色谱(MCAC)。IMAC中常用的整合基团有亚胺基二乙酸基(IDA)和亚胺基二乙醛基(IDAD)等；常用的金属离子有Zn2+、Ni+、Mg2+、Cu2+等；可以选用任何载体以制备亲和色谱柱。为进一步增强分离的效果，可以在设计重组抗体时，在抗体链段的N端或C端融合上一串寡聚组氨酸链（6His，4His 等），就像给重组抗体加上了一个标签(tag)。这样，便可以用IMAC柱子(带有His的融合蛋白一般用镍柱纯化)很方便地将融
37、合蛋白分离出来；得到的融合蛋白再以适当方法去掉寡聚组氨酸，就能回收纯化的蛋白。这 种方法简单、有效，运用得当时，可收到很好的效果。（如果要去掉His，采用 Factor Xa Protease酶解即可）（五）高效液相色谱 前述各种色谱模式，已在生化实验室中获得了广泛的应用。但是，人们常为柱色谱(层析)的费时和低效而苦恼，通过色谱基本理论的研究可知，在填充色谱柱中，填料粒径、形状以及填充柱床紧密程度的不均一性，都会对色谱柱的性能产生影响。这些效应对柱子理论塔板高度的影响，与填料颗粒的粒径及粒径分布密切相关。粒径大时柱效低；粒径小则柱效高；此外，填料颗粒的粒径分布均匀时，柱效也相应会高一些。因此，
38、为提高柱效，应使用细粒径的填料，并要求填料的粒径分布尽可能地均匀，甚至使用粒径单分散的填料。正是基于这样的原理，在20世纪70年代出现了以使用细粒径填料为特征的高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)。高效液相组成示意图123451输液系统 2 进样系统 3 色谱柱 4 检测器 5 数据处理及控制系统灌流色谱在灌流色谱的填料上，既有50-150um的微孔，又有贯穿整个颗粒的600-800um的超大孔存在，允许流动相直接进入填料颗粒内部贯穿而过。柱子通透性很好，高流速条件下也不需要增加工作压力。因此该种色谱柱同时具有高流速、高效率、
39、高样品负载率和低操作压力（poros柱）。灌流色谱填料示意图扩散孔扩散孔贯穿孔贯穿孔第二节 抗体的测定 抗体的测定包括抗体纯度、含量、抗体活性、抗体特异性以及抗体亲和力的测定等几个方向。这些指标与参数对抗体的研究与应用均十分重要特别是近年来，随着越来越多的治疗用抗体进入临床，必须严格地控制抗体制品的纯度、含量和活性等指标。同时，对与其相关的其它一些参数，也需要加以测定。常用的方法如RIA和ELISA等已很成熟。但是，这些方法往往较为烦琐是需较多的时间并难于测定动态的过程。因此，需要发展简单、准确、方便、快速和动态的检测新方法。新的方法中，最引入注目的是基于表面等离子体共振的“生物相互作用体系”
40、(BIAcore)；利用BIAcore，可以快速、准击、灵敏、方便、及时地测定抗原抗体相互作用的动态过程。相对于常规的酶联免疫和放射免疫等方法，这无疑是一个巨大的进步。一 抗体特异性的测定 抗体的特异性，指的是一种抗体识别只有不同结构抗原的能力。或者说,一种抗体仅与具有特定分子结构的抗原才发生明显的分子识别作用。一般情况下，抗原与抗体之间的特异性相互作用，发生于抗原上的抗原决定簇与抗体上的抗体结合部位之间。而当其它某种分子也具有类似结构时，它也能与抗体发生类似的分子识别作用，这就是交叉反应(cross reaction)。抗体的特异性是决定抗体应用价值的关键，可以用多种力法进行测定，其基础均是
41、利用了抗原抗体特异性相互作用；这种测定可以通过沉淀、凝集等作用的直接观察进行但往往灵敏度较低。近年来，一些新的仪器和方法，如酶免疫技术、放射免疫技术、荧光免疫技术、化学发光免疫技术；以及表面等离了体共振(SPR)和石英晶体微天平(QCM)等被用于直接测定抗体的特异性，灵敏度可达到ugm1或更低。本节仅介绍酶联免疫吸附试验（ELISA）、放射免疫测定（RIA）、免疫荧光测定三种方法。（一）ELISA ELISA是酶联接免疫吸附剂测定(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay)的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来
42、，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。原理：ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗体夹心法以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法ELISA图图8-9 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验 EL
43、ISA 底物底物酶标抗体酶标抗体Ab（待测）（待测）AgELISA 常用的酶和底物常用的酶和底物辣根过氧化物酶，底物为辣根过氧化物酶，底物为OPD,深桔黄色深桔黄色，检测波长，检测波长492nm TMB，蓝绿色，检测波长蓝绿色，检测波长450nm 碱性磷酸酶，底物为碱性磷酸酶，底物为PNPP（对硝基苯磷酸酯）（对硝基苯磷酸酯）,黄色黄色 检测波长检测波长405nm ELISA各步骤的反应时间各步骤的反应时间 包被：包被：2436h，蛋白浓度为，蛋白浓度为15ug/ml 封闭：封闭：37C 2h 或或4C过夜（过夜（3BSA）样本反应时间：样本反应时间：37C 45min-1h 酶标抗体反应时间
44、：酶标抗体反应时间：37C 45min-1h 显色时间：显色时间：15min(避光）避光）设对照设对照 可以一次包被多块板，冻存备用可以一次包被多块板，冻存备用 辣根过氧化物酶标记方法 酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。辣根过氧化物酶的标记常用过碘酸盐氧化法，这种方法法只适用于含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，醛基与抗体分子上的氨基形成Schiff碱而结合。后者可进一步用NaBH(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。ELISA 常规生色底物常规生色底物辣根过氧化物酶底物：辣根过氧化物酶底物：ABTS水溶性HRP底物，在过氧化物酶的作用下产生
45、绿色终产物。该绿色产物在410nm及650nm具有两个主要的吸收峰。OPD和HRP反应时生成桔黄色的产物，在492nm时吸收最大。OPD易溶于底物缓冲液，如Stable Peroxidase Substrate Buffer。TMB被过氧化氢氧化时（由HRP催化）可形成蓝色产物，主要吸收峰在370 nm和652nm。加入硫酸或磷酸后，它会变成黄色，最大吸收峰为450 nm。TMB灵敏度很高，达到相同的检测灵敏度需要的量比ABTS少，但这也可能产生较高的背景，所以要求使用较少的蛋白或较低的抗体浓度。碱性磷酸酶色底物碱性磷酸酶色底物 PNPP 碱性磷酸酶和PNPP反应后，形成黄色水溶反应产物，该产
46、物在405nm处有光吸光。半乳糖苷酶底物半乳糖苷酶底物ONPG ONPG是一种卓越的b-半乳糖苷酶底物。该产品完全可溶，并且在450nm具有高的消光系数。它产生一种黄色产物，用1M碳酸钠终止后在可见光范围内进行检测。2 类型（1）间接法测抗体）间接法测抗体间接法是检测抗体常用的方法间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗 体，检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。常用于临床血清中自身抗体的检测，以及杂交瘤上清特异性抗体的筛选。如血清中PDCD5自身抗体的检测。方法：方法：抗原包被 封闭 待检抗体 洗涤 酶标二抗 洗涤 显色反应 终止反应 ELISA Reader检测 OD值(
47、2)双抗体夹心法测抗原是检测抗原最常用的方法。是检测抗原最常用的方法。只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物。制备酶结合物。常用的组合：常用的组合：单克隆抗体多克隆抗体单克隆抗体多克隆抗体 单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体 后一组合是两种单克隆抗体针对抗原上不同的相距较远的两个抗后一组合是两种单克隆抗体针对抗原上不同的相距较远的两个抗原决定簇，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。原决定簇，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。用途：测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用用途：测定二价或二价以上的大分子
48、抗原，但不适用 于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成 两位点夹心。例如各种细胞因子的检测。两位点夹心。例如各种细胞因子的检测。双抗体夹心法测抗原的方法：双抗体夹心法测抗原的方法：捕获抗体包被 封闭（3BSA）待测抗原 洗涤（含0.1Tween的PBS)酶标单抗或多抗 洗涤 显色 检测1）抗体固相测抗原）抗体固相测抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。方
49、法：方法：抗体包被 封闭 同时加入待测抗原和酶标抗原 洗涤 酶底物 显色 ELISA reader检测(3)竞争法测抗原2）抗原固相测抗原其原理是标本中的抗原和固相抗原与一定量的抗体竞争结合。标本中抗原含量愈多，结合在固相上的抗体愈少，最后的显色也愈浅。方法:a:抗原包被96孔板；b:封闭;c:待测抗原与抗体反应一定时间；d:加入96孔板 e:洗涤 f：加入酶标二抗 g：洗涤 h：显色和检测如临床血清样本的检测以及细胞培养上清的检测如临床血清样本的检测以及细胞培养上清的检测（4）IgM抗体的检测抗体的检测1 1）间接法）间接法：间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被的
50、间接法直接测定血清中的IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部分IgM抗体不能结合到固相上，将出现假阴性结果。因此，如果用抗IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的干扰。方法方法 a:抗原包被96孔酶标板；b:封闭;c:待测血清与A蛋白反应一定时间后离心 d:吸取上清液加入96孔酶标板 e:洗涤 f：加入酶标抗IgM的抗体 g：洗涤 h：显色和检测（5）ABC-ELISA技术 （Avidin Biotin Complex-ELISA原理原理亲和素是一种分子量是60，000的碱性蛋白，由四个相同亚基组成