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1、三碱性磷酸酶的分离纯化和Km测定二、实验原理当当温温度度、pH 及及酶酶浓浓度度恒恒定定的的条条件件下下，酶酶促促反反应应的的初初速速度度随随作作用用物物浓浓度度S增增 大大而而增增大大，但但增增大大到到一一定定限限度度时时，作作用用物物浓浓度度再再增增加加，则则反反应应速速度度不不再再增增加加。此此 时时反反应应速速度度为为最最大大速速度度（Vmax）。Michaelis Menten 对对酶酶促促反反应应速速度度与与作作用用物物浓浓 度度之之间间的的这这种种关关系系进进行行了了大大量量实实验验研研究究，并并于于 1913 年年提提出出了了数数学学方方程程式式，即即著著名名的的米米一一曼曼方
2、方程程式式：作图后，将各点连线延长，直线与横轴的交点为作图后，将各点连线延长，直线与横轴的交点为 1/Km，根据在横轴，根据在横轴上的截上的截 距，可以计算出该酶的距，可以计算出该酶的 Km。本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，碱性磷酸酶能本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，碱性磷酸酶能分解磷分解磷 酸苯二钠产生酚和磷酸，酚在碱性溶液中与酸苯二钠产生酚和磷酸，酚在碱性溶液中与 4-氨基安替比林作氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧用，经铁氰化钾氧 化生成红色的醌衍生物，根据红色深浅可测出酶活化生成红色的醌衍生物，根据红色深浅可测出酶活力高低。其反应式如下：力高低。其反应式如下
3、：磷酸苯二钠磷酸苯二钠磷酸盐磷酸盐 +酚酚AKP酚酚 +4-氨基安替比林氨基安替比林红色醌类衍生物红色醌类衍生物铁氰化钾铁氰化钾PH 10碱性利用在不同作用物浓度的条件下，测定的酶活性（A），按 Lieweaver-Burk 二氏法作图，从 x 轴上的截距求得其 Km 值。三、实验仪器及试剂仪器：恒温水浴锅，721 型分光光度计。试剂：1.0.04mol/L 作用物液：称取 10.16g 磷酸苯二钠（C6H5PO4Na22H2O），用 煮沸后冷却的蒸溜水溶解，并稀释至 1,000ml，4ml 氯仿防腐，加 贮于棕色瓶内，置冰箱内保存，可用一周。2.0.1mol 碳酸盐缓冲液（pH10.0）：称
4、取无水碳酸钠 6.36g 及碳酸氢钠 3.36g，溶解于蒸馏水中，并稀释至 1,000ml.3.碱性磷酸酶液：用自己提取的碱性磷酸酶液，用 pH10 缓冲液稀释 5-7 倍。4.0.5mol/L NaOH 溶液5.0.3%4-氨基安替比林：称取 3g4 氨基安替比林及碳酸氢钠 42g，用蒸馏水 溶解，并稀释至 1,000ml，贮于棕色瓶中，放冰箱内保存。6.0.5%铁氰化钾：称取 10g 铁氰化钾及 30g 硼酸各溶于 800ml 蒸馏水中，溶 解后两液混合加水至 2,000ml。置棕色瓶中，放冰箱内保存。四、操作步骤1、取大试管 7 支，按下表操作：加入酶液，混匀之后立即计时，各管在37水浴
5、中准确保温15分钟后，立即加入0.5MolNaOH液1.0ml以终止反应。2、显色：各管中加入 0.3%4 氨基安替比林 1.0ml 和 0.5%铁氰化钾 2.0ml，充分混 匀，放置 10 分钟，以 0 管为对照，在波长 510nm 下比色，记录各管的吸光度。3、作图：所测各管的吸光度代表各管中反应速度 V，以之为纵轴，以作用物浓度 S为横轴，在坐标纸上连接各点作图，观察曲线的形状。以各管吸光度值的倒数 为纵坐标，以作用物浓度的倒数 为横坐标，作图并求此 酶的 Km 值。五、实验结果（1）说说碱性磷酸酶提取过程中的注意事项（2）计算碱性磷酸酶的Km值单选题：单选题：1下面关于酶的描述，哪一项
6、不正确：AA、所有的酶都是蛋白质B、酶是生物催化剂C、酶具有专一性D、酶是在细胞内合成的，但也可以在细胞外发挥催化功能2一个简单的米氏酶催化反应，当SKm时：BA、反应速度最大B、底物浓度与反应速度成正比C、增加酶浓度，反应速度显著变大D、S浓度增加，Km值也随之变大3酶的比活力是指：BA、任何纯酶的活力与其粗酶的活力比B、每毫克蛋白的酶活力单位数C、每毫升反应混合液的活力单位D、以某种酶的活力作为1来表示其他酶的相对活力是非题：是非题：1如果有一个合适的酶存在，达到过渡态所需的活化能就减少。2T.Cech从自我剪切的RNA中发现了有催化活性的RNA,称之为核酶。3酶促反应中，酶饱和现象是普遍存在的。此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢