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1、实验二 胰蛋白酶抑制剂的胰蛋白酶抑制剂的分离纯化和活性测定分离纯化和活性测定（P40）一、实验目的（1 1）了解胰蛋白酶抑制剂的制备方）了解胰蛋白酶抑制剂的制备方法；法；（2 2）了解胰蛋白酶抑制剂抑制活性）了解胰蛋白酶抑制剂抑制活性测定的原理和方法；测定的原理和方法；（3 3）掌握离心机和微量移液器的使）掌握离心机和微量移液器的使用方法。用方法。二、实验原理胰蛋白酶抑制剂是对胰蛋白酶有抑制活性的胰蛋白酶抑制剂是对胰蛋白酶有抑制活性的胰蛋白酶抑制剂是对胰蛋白酶有抑制活性的胰蛋白酶抑制剂是对胰蛋白酶有抑制活性的蛋白蛋白蛋白蛋白质质质质。利用蛋白质可溶于水或提取液中的性质，可用水利用蛋白质可溶于水
2、或提取液中的性质，可用水利用蛋白质可溶于水或提取液中的性质，可用水利用蛋白质可溶于水或提取液中的性质，可用水或提取液从富含胰蛋白酶抑制剂的材料中或提取液从富含胰蛋白酶抑制剂的材料中或提取液从富含胰蛋白酶抑制剂的材料中或提取液从富含胰蛋白酶抑制剂的材料中抽提抽提抽提抽提胰胰胰胰蛋白酶抑制剂，利用蛋白酶抑制剂，利用蛋白酶抑制剂，利用蛋白酶抑制剂，利用盐析盐析盐析盐析使胰蛋白酶抑制剂沉淀使胰蛋白酶抑制剂沉淀使胰蛋白酶抑制剂沉淀使胰蛋白酶抑制剂沉淀出来，得到含有胰蛋白酶抑制剂的蛋白质制品。出来，得到含有胰蛋白酶抑制剂的蛋白质制品。出来，得到含有胰蛋白酶抑制剂的蛋白质制品。出来，得到含有胰蛋白酶抑制剂的
3、蛋白质制品。在制备过程中通过测定对胰蛋白酶的抑制活性进在制备过程中通过测定对胰蛋白酶的抑制活性进在制备过程中通过测定对胰蛋白酶的抑制活性进在制备过程中通过测定对胰蛋白酶的抑制活性进行跟踪检测。行跟踪检测。行跟踪检测。行跟踪检测。二、实验原理胰蛋白酶可作用于其底物苯甲酰胰蛋白酶可作用于其底物苯甲酰胰蛋白酶可作用于其底物苯甲酰胰蛋白酶可作用于其底物苯甲酰-L-L-L-L精氨酰精氨酰精氨酰精氨酰-对硝基对硝基对硝基对硝基苯胺苯胺苯胺苯胺(BAPNA)(BAPNA)(BAPNA)(BAPNA)，使，使，使，使BAPNABAPNABAPNABAPNA发生水解，生成苯甲酰发生水解，生成苯甲酰发生水解，生成
4、苯甲酰发生水解，生成苯甲酰-L-L-L-L-精氨酸和淡茶色的对硝基苯胺，使溶液变成淡茶精氨酸和淡茶色的对硝基苯胺，使溶液变成淡茶精氨酸和淡茶色的对硝基苯胺，使溶液变成淡茶精氨酸和淡茶色的对硝基苯胺，使溶液变成淡茶色。色。色。色。如果在此活性测定系统中加入过量的胰蛋白酶抑如果在此活性测定系统中加入过量的胰蛋白酶抑如果在此活性测定系统中加入过量的胰蛋白酶抑如果在此活性测定系统中加入过量的胰蛋白酶抑制剂，过量的抑制剂与胰蛋白酶竞争底物，抑制制剂，过量的抑制剂与胰蛋白酶竞争底物，抑制制剂，过量的抑制剂与胰蛋白酶竞争底物，抑制制剂，过量的抑制剂与胰蛋白酶竞争底物，抑制了胰蛋白酶的水解活性，不能使底物水解
5、，无对了胰蛋白酶的水解活性，不能使底物水解，无对了胰蛋白酶的水解活性，不能使底物水解，无对了胰蛋白酶的水解活性，不能使底物水解，无对硝基苯胺的生成，不能使溶液变成淡茶色，而呈硝基苯胺的生成，不能使溶液变成淡茶色，而呈硝基苯胺的生成，不能使溶液变成淡茶色，而呈硝基苯胺的生成，不能使溶液变成淡茶色，而呈现无色，从而表现出胰蛋白酶的抑制活性。现无色，从而表现出胰蛋白酶的抑制活性。现无色，从而表现出胰蛋白酶的抑制活性。现无色，从而表现出胰蛋白酶的抑制活性。本实验以大豆为主要原料，制备胰蛋白酶抑制剂，本实验以大豆为主要原料，制备胰蛋白酶抑制剂，本实验以大豆为主要原料，制备胰蛋白酶抑制剂，本实验以大豆为主
6、要原料，制备胰蛋白酶抑制剂，并测定其抑制活性。并测定其抑制活性。并测定其抑制活性。并测定其抑制活性。二、实验原理 BAPNA BA p-NA三、试剂与仪器（一）试剂（一）试剂（一）试剂（一）试剂RR0.2 mol/L Na0.2 mol/L Na2 2HPOHPO4 4，0.2mol/L 0.2mol/L NaHNaH 2 2P0P04 4。RR0.8mol/L0.8mol/L磷酸缓冲液；磷酸缓冲液；36mL 0.2mol/LNa36mL 0.2mol/LNa2 2HP0HP04 4与与14mL 14mL 0.2mol/L NaH0.2mol/L NaH2 2POPO4 4混合，用蒸馏水定容到
7、混合，用蒸馏水定容到500 500 mLmL。RR固体硫酸铵。固体硫酸铵。RR2 mol/L HCI2 mol/L HCIRRl0mol/L l0mol/L NaOHNaOH。RR6060乙酸溶液乙酸溶液(v/vv/v)。RR底物缓冲液：底物缓冲液：0.1 0.1 mmolmmol/L pH/L pH值值8.1 8.1 TrisTris-HCI-HCI缓冲液缓冲液(内含内含0.0.4 4的氯化钙的氯化钙)。RR1 1 mmolmmol/L BAPNA/L BAPNA水溶液水溶液.RR20 mg/20 mg/mLmL胰蛋白酶溶液：用胰蛋白酶溶液：用0.001mol/L0.001mol/L盐酸配制
8、。盐酸配制。三、试剂与仪器（二）材料与器材（二）材料与器材（二）材料与器材（二）材料与器材vv新鲜材料新鲜材料新鲜材料新鲜材料vv绞碎机绞碎机绞碎机绞碎机vv纱布纱布纱布纱布vv台式高速冷冻离心机台式高速冷冻离心机台式高速冷冻离心机台式高速冷冻离心机vv微量移液器微量移液器微量移液器微量移液器vvpHpHpHpH值试纸值试纸值试纸值试纸vv恒温水浴锅恒温水浴锅恒温水浴锅恒温水浴锅vv电子天平电子天平电子天平电子天平vv玻璃试管、烧杯、量筒玻璃试管、烧杯、量筒玻璃试管、烧杯、量筒玻璃试管、烧杯、量筒vv离心管离心管离心管离心管四、实验方法（一）胰蛋白酶抑制剂的提取和纯化（一）胰蛋白酶抑制剂的提取
9、和纯化50g50g大豆，绞碎，大豆，绞碎，大豆，绞碎，大豆，绞碎，1 1：7 7加水加水加水加水pH5.0pH5.0，4 4，过夜，过夜，过夜，过夜缓慢加入硫酸铵至缓慢加入硫酸铵至缓慢加入硫酸铵至缓慢加入硫酸铵至60%60%饱和度饱和度饱和度饱和度10ml10ml，2500rpm2500rpm，15min15min取取取取1.5mL1.5mL上清，上清，上清，上清，10000rpm10000rpm，10min10min静置静置静置静置0.5h0.5h弃沉淀留上清，调弃沉淀留上清，调弃沉淀留上清，调弃沉淀留上清，调pH7.0pH7.0，测体积测体积测体积测体积V V，计算硫酸铵量，计算硫酸铵量，
10、计算硫酸铵量，计算硫酸铵量纱布过滤纱布过滤纱布过滤纱布过滤留沉淀，加入留沉淀，加入留沉淀，加入留沉淀，加入200L dH200L dH2 2OO胰蛋白酶抑制剂水溶液胰蛋白酶抑制剂水溶液胰蛋白酶抑制剂水溶液胰蛋白酶抑制剂水溶液（1 1 1 1）取两支试管，分别标记记号，其中）取两支试管，分别标记记号，其中）取两支试管，分别标记记号，其中）取两支试管，分别标记记号，其中1 1 1 1号管为对号管为对号管为对号管为对照管，照管，照管，照管，2 2 2 2号管为测试管。号管为测试管。号管为测试管。号管为测试管。（2 2 2 2）按照）按照）按照）按照(表表表表2-1)2-1)2-1)2-1)表格所示数
11、据将溶液分别加入两表格所示数据将溶液分别加入两表格所示数据将溶液分别加入两表格所示数据将溶液分别加入两支试管中。支试管中。支试管中。支试管中。（3 3 3 3）将试管中的溶液摇匀，放入）将试管中的溶液摇匀，放入）将试管中的溶液摇匀，放入）将试管中的溶液摇匀，放入28282828水浴水浴水浴水浴2 min2 min2 min2 min。（4 4 4 4）向两支试管中各加入）向两支试管中各加入）向两支试管中各加入）向两支试管中各加入0.2 mL 20 mg0.2 mL 20 mg0.2 mL 20 mg0.2 mL 20 mgmLmLmLmL的胰蛋的胰蛋的胰蛋的胰蛋白酶溶液，摇匀。白酶溶液，摇匀。
12、白酶溶液，摇匀。白酶溶液，摇匀。（5 5 5 5）28282828水浴水浴水浴水浴5 min5 min5 min5 min。（6 6 6 6）向两支试管中分别加入）向两支试管中分别加入）向两支试管中分别加入）向两支试管中分别加入0.4 mL 600.4 mL 600.4 mL 600.4 mL 60的乙酸。的乙酸。的乙酸。的乙酸。观察现象。观察现象。观察现象。观察现象。四、实验方法（二）胰蛋白酶抑制剂的活性测定（二）胰蛋白酶抑制剂的活性测定五、结果与分析q说明现象说明现象q解释原因解释原因六、讨论与心得试分析实验过程中影响胰蛋白酶抑制剂分试分析实验过程中影响胰蛋白酶抑制剂分离提纯效果的因素有哪些？离提纯效果的因素有哪些？实验心得及改进意见。实验心得及改进意见。