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1、1基因治疗基因治疗 Gene therapyGene therapy 2n（一）、基因治疗的发展简史、概念及背景（一）、基因治疗的发展简史、概念及背景n（二）、基因治疗的基因导入系统（二）、基因治疗的基因导入系统n（三）、基因治疗的途径（三）、基因治疗的途径n（四）、基因治疗的靶细胞研究（四）、基因治疗的靶细胞研究n（五）、基因治疗在单基因遗传病、肿瘤和（五）、基因治疗在单基因遗传病、肿瘤和心血管疾病治疗上的应用心血管疾病治疗上的应用n（六）、基因治疗面临的问题和挑战（六）、基因治疗面临的问题和挑战n（七）、基因治疗的发展方向（七）、基因治疗的发展方向3（一）、基因治疗的发展简史、（一）、基因
2、治疗的发展简史、概念及背景概念及背景4基因治疗的发展简史基因治疗的发展简史时间时间发生事件发生事件研究者研究者1944DNA是转化物质是转化物质Avery1953DNA双螺旋结构模型双螺旋结构模型Watson and Crick1963遗传密码的破译遗传密码的破译Brenner1979重组体重组体DNA技术、基因转染技术、基因转染Mulligan and Berg1980临床地贫研究临床地贫研究Cline1990第一个临床试验（第一个临床试验（ADA)基因基因Blas and Anderson1992大量癌症临床试验大量癌症临床试验美国等美国等1993中国制定第一部基因治疗质控要点中国制定第一
3、部基因治疗质控要点中国中国1997至今重组病毒的产业化及其技术改进重组病毒的产业化及其技术改进美国美国5基因治疗的概念基因治疗的概念n经典：经典：针对遗传病某一基因缺陷，将外源基因导入体内予以矫正；n现在：现在：凡是在基因水平上进行操作而达到治疗疾病的所有疗法6n上世纪九十年代初，一位因ADA(腺苷酸脱氨酶)基因缺陷导致严重免疫缺损的四岁女孩，由美国国立卫生研究院用ADA基因治疗，取得疗效。“基因治疗”研究热从此波及全世界，起而效颦，为保障人类健康展现了美好的前景。78截止到截止到2012年年1月，基因治疗试验的全球分布：月，基因治疗试验的全球分布：9截止到截止到2012年年1月，基因治疗试验
4、的国家分布：月，基因治疗试验的国家分布：10基因治疗的疾病类型：基因治疗的疾病类型：11基因治疗试验的临床阶段：基因治疗试验的临床阶段：121989-2012年年1月，每年全球被批准的临床数目：月，每年全球被批准的临床数目：13基因治疗选用的载体分类基因治疗选用的载体分类14世界第一个基因治疗药物在中国诞生世界第一个基因治疗药物在中国诞生n人民网深圳2003年10月22日15：30急电 正在这里召开的深圳市政府新闻发布会向世界公布了一项振奋人心的消息：“世界首个基因治疗药物在中国诞生”。n深圳市赛百诺基因技术有限公司研制开发的抗癌新药“重组人p53腺病毒注射液”（商品名“今又生”），10月16
5、日获得国家仪器药品监督管理局颁发的新药证书。这标志着我国在基因治疗药物研制和产业化方面已达世界领先水平，在国际竞争中抢占了先机。n赛百诺公司负责人说，这种新药是拥有自主知识产权的广谱肿瘤基因治疗药品，可望明年一月正式上市。15n根据靶细胞的类型分类：根据靶细胞的类型分类：1、生殖细胞（germ cell)基因治疗：2、体细胞（somatic cell)基因治疗n 根据基因转移的途径分类：根据基因转移的途径分类：1、in vivo(活体直接转移或称一步法）2、ex vivo(回体转移或称二步法）基因治疗的种类基因治疗的种类16n1 1、基因置换、基因置换n基因置换就是用正常的基因原位置换病变基因
6、置换就是用正常的基因原位置换病变细胞内的致病基因，使细胞内的突变致病细胞内的致病基因，使细胞内的突变致病基因完全恢复正常状态，这种基因治疗方基因完全恢复正常状态，这种基因治疗方法最为理想。但这种方法是建立在同源重法最为理想。但这种方法是建立在同源重组技术基础上的，而目前同源重组虽然在组技术基础上的，而目前同源重组虽然在技术上可行，但重组的效率很低，远没达技术上可行，但重组的效率很低，远没达到基因治疗要求的水平，在临床试验上就到基因治疗要求的水平，在临床试验上就更无法实现了。更无法实现了。基因治疗的策略基因治疗的策略17n2、基因修复n基因修复是指将致病基因的突变碱基序列定点纠正，可用来治疗点突
7、变导致的疾病。但由于纠错效率低的原因，实践中有相当的难度。18n3、基因增补n将目的基因导入患者体内，其表达产物能补偿缺陷细胞的功能，可用于隐性遗传病的治疗。19n4、基因失活n利用反义技术特异性封闭、抑制有害基因表达，可用于一些显性遗传病或肿瘤的基因治疗。20nAndrew Z.Fire、Craig C.Mello21n1998年Andrew Z.Fire、Craig C.Mello等发现将很少量的双链RNA注入秀丽线虫体内，即可高效、特异地阻断/抑制与双链RNA同源的基因表达，其阻断/抑制率比纯化后的反义RNA技术高若干个数量级。双链RNA导入细胞后引起与该段RNA同源的mRNA发生特异性
8、降解，进而使相应基因抑制的转录后基因沉默现象称RNA干扰。22n双链RNA特异性核酸内切酶（dsRNA-specific endonuclease，Dicer）切割，形成21-23nt的双链短干扰RNA（short-interference RNA，siRNA），siRNA链为5端磷酸化，3端有二个碱基以非配对方式悬垂。23nsiRNA与由蛋白及酶类组成的RNA诱导沉默复合体（RNA-Induced Silencing Complex，RISC）结合后，由于RISC具有解旋酶活性，siRNA中的正义链和反义链解旋、解链。随后正义链被降解，而与RISC结合的反义链则按照碱基互补配对原则与靶mRN
9、A中的同源序列结合，并由RISC发挥核酸内切酶作用，在距siRNA3断11或12个碱基处切割靶mRNA。24n倍增放大作用：siRNA一方面可引导RISC特异性切割靶mRNA；另一方面，siRNA还可作为引物与靶mRNA结合，在RNA依赖性RNA多聚酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）的作用下合成新的ds-RNA，再次经Dicer酶切割，形成新的siRNA，并作用于靶mRNA。25RNA干扰26微小微小RNA（microRNA）n微小微小RNA（microRNA）大量存在人类基因组）大量存在人类基因组中的非编码中的非编码RNA，能特异识别成熟，能特异识别成熟
10、mRNA的的3非翻译区，抑制非翻译区，抑制mRNA的翻译。的翻译。n微小微小RNA（microRNA）1993 年年Lee等在对秀等在对秀丽线虫进行突变体的遗传分析中首次发现的不丽线虫进行突变体的遗传分析中首次发现的不能编码蛋白质，但能时序调控其胚胎后期发育能编码蛋白质，但能时序调控其胚胎后期发育基因表达的基因表达的miRNA:Lin一一4。27n2000年年Reinhart等在线虫中发现了另一等在线虫中发现了另一 种重要的具有转录后调节作用的种重要的具有转录后调节作用的miRNA:let一一7，后来发现了大量类似，后来发现了大量类似RNA，2001年起统一称为年起统一称为miRNA。28nm
11、iRNA通常来源于一个大小约为1000bp的长链RNA初始转录产物(Pri一miRNA)，Pri一miRNA分子在细胞核中经过双链RNA特异性核酸酶Rnaselll一Drosha的作用形成70-100nt的具有茎环结构的RNA分子(pre一miRNA)。pre一miRNA在转运蛋白一5(Exportin一5)的作用下转运至胞质中，被另一个双链RNA特异性核酸酶Rnaselll一Dicer识别，进一步被切割成长约22nt的小分子RNA，即成熟的miRNA。成熟miRNA在RNA诱导的沉默复合物引导下，当与mRNA完美互补时，miRNA便指导mRNA特异性切割;当两者没有足够的互补性时，miRNA
12、则抑制mRNA转录后翻译。29n随着人类后基因组计划的进一步开展，占类基因组90%以上的非编码序列越来越引起科学家的关注，据计算推测，人类基因组可能存在1000多个miRNA基因，n单个miRNA可调控200多个靶基因，约1/3的蛋白编码基因受miRNA调控。30nmiRNA是调节真核生物基因表达的天然反义寡核昔酸链。研究表明，miRNA参与了生命过程中一系列的重要过程，包括发育进程、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡等，与许多疾病的发生、诊断、治疗和预后密切相关，miRNA也因而成为当前研究的新热点。31n5、免疫调节 将抗原、抗体或细胞因子基因导入患者体内，改变其免疫状态，达到预防和治疗疾
13、病的目的。如可将白细胞介素-2（IL-2）导入肿瘤病人体内，提高病人（IL-2）的水平，激活体内免疫系统的活性。32n许多肿瘤都能表达一些肿瘤特异的抗原，将这些在正常机体内并不表达的肿瘤特异抗原的编码基因转入肿瘤内，制备成肿瘤DNA瘤苗，再导入患者体内，通过其在机体内的表达可以激发机体对编码抗原的免疫反应。如黑色素瘤相关抗原MAGE、在多种肿瘤中表达的癌胚抗原CEA、病毒基因产物HPV-E6、E7等。33n6、其他方法 增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。如向肿瘤细胞导入单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，然后给予病人无毒性核苷类似物GCV（甘昔洛韦，ganciclovir）的药物前体，由于只有含单纯疱疹病
14、毒胸苷激酶基因的细胞才能将GCV转化成有毒的药物，因而肿瘤细胞被杀死，而对正常细胞影响不大。34n由于基因治疗的人体试验引发了争论，为了规范这一新生事物，使其更好地为人类健康服务，但同时又在人类伦理学的接受范围内，1975年美国国立卫生研究院（NIH）召集和组织了重组DNA顾问委员会（Recombinant DNA Advisory Committee,RAC）,制定了一系列有关重组DNA研究的法规，接着RAC又任命了一个人体基因治疗的分委员会（Human Gene Therapy Subcommittee）,并于1985年颁布了一个权威性的文件，称为“人体细胞基因治疗方案的设计和提请批准的注
15、意要点”，该文件要点如下：基因治疗的守则基因治疗的守则35n1、什么病可以采用基因治疗？即被治疗的疾病是否严重到必须要用这种全新和从未尝试过的疗法？试图增加一个人的能力而不是治疗疾病，将立即被否决。36n2、该病目前是否有其他治疗方法？要求基因治疗必须用于目前尚无满意疗法的疾病，在其他所有因素均等同的情况下，基因治疗应较其他疗法更有效。37n3、根据已有的实验室和临床研究，基因治疗对于患者及其子女和接触者的安全性如何估计？即基因治疗的安全性必须有保证。38n4、根据已有的实验室和临床研究，基因治疗的疗效预计将如何？即基因治疗的有效性在进行人体试验前要有足够的动物试验证据。39n5、如果满意地回
16、答了上述4个问题，那么如何公正地选择受试者？n6、如果上述5个问题都有满意的答案，那么医生将如何把基因治疗的各种情况恰当正确地告知患者，以及他们将如何表达同意和不同意？即要保证患者的知情同意权。40n7、在满意地回答了上述所有问题后，将采取什么步骤来保护接受基因治疗患者的隐私权？n临床申请的基因治疗方案经过审议，如果不符合这些条件，则禁止实施。（二）、基因治疗的基因导入系统（二）、基因治疗的基因导入系统n基因导入系统（gene delivery system）是基因治疗的核心技术，可分为病毒载体系统和非病毒载体系统。41n1.病毒载体系统n用于基因治疗的病毒载体应具备以下基本条件：n1).携带
17、外源基因并能包装成病毒颗粒；2).介导外源基因的转移和表达；3).对机体不致病。42n大多数野生型病毒对机体都具有致病性。因此需要对其进行改造后才能用于人体。原则上，各种类型的病毒都能被改造成病毒载体。但是由于病毒的多样性及与机体复杂的依存关系，人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展的关系等的认识还很不全面,从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。近20年来，只有少数几种病毒如反转录病毒（包括HIV病毒）、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒（包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用。43n病毒载体产生的原理 病毒载体的产生
18、建立在对病毒的生活周期和分子生物学认识的基础之上。研究病毒载体首先要对病毒的基因组结构和功能有充分的了解，最好能获得病毒基因组全序列信息。病毒基因组可分为编码区和非编码区。编码区基因产生病毒的结构蛋白和非结构蛋白；根据其对病毒感染性复制的影响，又可分为必需基因和非必需基因。非编码区中含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式作用元件。44n各种野生型病毒颗粒都具有一定的包装容量，即对所包装的病毒基因组的长度有一定的限制。一般来说，病毒包装容量不超过自身基因组大小的105110。基因重组技术的发展使病毒载体的产生成为可能。最简单的做法是，将适当长度的外源DNA插入病毒基因组的非必需区，包装成重组病
19、毒颗粒。45n然而，这样的重组病毒作为基因转移载体有许多缺点。首先，许多野生型病毒通过在细胞中产毒性复制而导致细胞裂解死亡；或带有病毒癌基因而使细胞发生转化。因此必须经过改造使其成为复制缺陷性病毒并且删除致癌基因后才能用于基因治疗。46n其次，插入外源DNA的长度受到很大限制，尤其对于基因组本身较小的病毒如腺病毒相关病毒（AAV，4.7kb）、反转录病毒（810kb）、腺病毒（36kb），如果不去除病毒基因，可供外源DNA插入的容量就十分小。因此，必须删除更多的病毒基因以腾出位置插入较大的外源DNA。为了增加病毒载体插入外源DNA的容量，除了可以删除病毒的非必需基因外，还可以进一步删去部分或全
20、部必需基因，这些必需基因的功能由辅助病毒或包装细胞系反式提供。47LTRLTRgaggagpolpolenvenvLTRLTR长末端长末端长末端长末端重复序列重复序列重复序列重复序列调节和调节和调节和调节和启动转录启动转录启动转录启动转录产生病毒产生病毒产生病毒产生病毒核心蛋白核心蛋白核心蛋白核心蛋白产生产生产生产生逆转录酶逆转录酶逆转录酶逆转录酶产生病毒产生病毒产生病毒产生病毒外膜蛋白外膜蛋白外膜蛋白外膜蛋白包装信号包装信号包装信号包装信号以反转录病毒为例：以反转录病毒为例：DNADNA前病毒的结构特征前病毒的结构特征48逆转录病毒载体的构建n常用的是莫洛尼小鼠白血病病毒(MoMLV)构建的
21、各类逆转录病毒载体LTRLTRgaggagpolpolenvenvLTRLTR长末端长末端长末端长末端重复序列重复序列重复序列重复序列调节和调节和调节和调节和启动转录启动转录启动转录启动转录包装信号包装信号包装信号包装信号目的基因标记基因49LTRLTRgaggagpolpolenvenvLTRLTRGagGag蛋白蛋白蛋白蛋白PoLPoL蛋白蛋白蛋白蛋白EnvEnv蛋白蛋白蛋白蛋白包装细胞系包装细胞系包装细胞系包装细胞系LTRLTRLTRLTR靶细胞靶细胞靶细胞靶细胞目的基因标记基因LTRLTRLTRLTR目的基因标记基因12345假病毒颗粒的产生并感染靶细胞逆转录病毒载体重组逆转录病毒(核
22、酸部分是逆转录病毒载体)辅病毒辅病毒501）物理方法（1 1）电穿孔法（电穿孔法（电穿孔法（电穿孔法（electroporotionelectroporotion）将细胞置于高将细胞置于高将细胞置于高将细胞置于高压脉冲电场中，通过电压使细胞产生可逆性的穿压脉冲电场中，通过电压使细胞产生可逆性的穿压脉冲电场中，通过电压使细胞产生可逆性的穿压脉冲电场中，通过电压使细胞产生可逆性的穿孔。周围基质中的孔。周围基质中的孔。周围基质中的孔。周围基质中的DNADNA可渗进细胞，进而表达。可渗进细胞，进而表达。可渗进细胞，进而表达。可渗进细胞，进而表达。瞬间瞬间瞬间瞬间细胞细胞细胞细胞 细胞膜核膜通透性增加细
23、胞膜核膜通透性增加细胞膜核膜通透性增加细胞膜核膜通透性增加 高压脉冲高压脉冲高压脉冲高压脉冲 DNADNA渗入细胞渗入细胞渗入细胞渗入细胞（2 2）显微注射法（）显微注射法（microinjection microinjection）利用显微操作把目的基因直接注入靶细胞或细胞核利用显微操作把目的基因直接注入靶细胞或细胞核 不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露基因不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露基因不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露基因不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露基因DNADNADNADNA注入动物肌肉或某些器官组织内。注入动物肌肉或某些器官组织内。注入动物肌肉或某
24、些器官组织内。注入动物肌肉或某些器官组织内。动物实验表明：接受注射外源动物实验表明：接受注射外源动物实验表明：接受注射外源动物实验表明：接受注射外源DNADNADNADNA的小鼠能够按其的小鼠能够按其的小鼠能够按其的小鼠能够按其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。1.1.1.1.将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内
25、毛细血管增加心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加30%30%30%30%40%40%40%40%；2.2.2.2.将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素；糖尿病所缺少的胰岛素；糖尿病所缺少的胰岛素；糖尿病所缺少的胰岛素；3.3.3.3.肌内注射凝血因子肌内注射凝血因子肌内注射凝血因子肌内注射凝血因子基因，可产生血友病所需基因，可产生血友病所需基因，可产生血友病所需基因，可产生血友病所需的凝血因子
26、等等。的凝血因子等等。的凝血因子等等。的凝血因子等等。基因直接注射法的优点基因直接注射法的优点1.1.1.1.制备具有调控部件的质粒制备具有调控部件的质粒制备具有调控部件的质粒制备具有调控部件的质粒DNADNADNADNA重组体的技术较容易；重组体的技术较容易；重组体的技术较容易；重组体的技术较容易；2.2.2.2.排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；3.3.3.3.导入的基因不需整合即可表达，避免了逆转录病导入的基因不需整合即可表达，避免了逆转录病导入的基因不需
27、整合即可表达，避免了逆转录病导入的基因不需整合即可表达，避免了逆转录病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆转的缺点；转的缺点；转的缺点；转的缺点；4.4.4.4.基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。诱导体内免
28、疫应答，致使反复治疗效果下降。例：转基因动物的制备 重组基因重组基因重组基因重组基因 DNA DNA 微注射微注射微注射微注射 （体外）（体外）（体外）（体外）小鼠受精卵小鼠受精卵小鼠受精卵小鼠受精卵 回植回植回植回植 假妊娠假妊娠假妊娠假妊娠 仔仔仔仔 鼠鼠鼠鼠 动物模型：转基因鼠动物模型：转基因鼠动物模型：转基因鼠动物模型：转基因鼠 (每个鼠细胞中都含有外源基因，按孟德尔方式遗传每个鼠细胞中都含有外源基因，按孟德尔方式遗传每个鼠细胞中都含有外源基因，按孟德尔方式遗传每个鼠细胞中都含有外源基因，按孟德尔方式遗传)clone sheep Dollyclone sheep Dolly体细胞体细胞
29、体细胞体细胞 提取提取提取提取 核核核核 重组细胞重组细胞重组细胞重组细胞 回植回植回植回植 DollyDolly卵细胞卵细胞卵细胞卵细胞 去核去核去核去核 细胞细胞细胞细胞 （3）微粒子轰击法n n 利用亚微粒的利用亚微粒的钨钨和和金金能吸附能吸附DNA，并将其，并将其包裹起来形成微粒，通过物理途径获得高速包裹起来形成微粒，通过物理途径获得高速度，微粒瞬间既可进入靶细胞，达到转移目度，微粒瞬间既可进入靶细胞，达到转移目的基因的目的，而不损伤靶细胞。的基因的目的，而不损伤靶细胞。n n 该方法可使目的基因在皮肤、肝、胰、胃该方法可使目的基因在皮肤、肝、胰、胃及乳腺等细胞中表达。及乳腺等细胞中表
30、达。2）化学法）化学法磷酸钙沉淀法：磷酸钙沉淀法：目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNADNA微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受体细胞基因组中，在适当条件并整合到受体细胞基因组中，在适当条件下得以表达。下得以表达。磷酸钙磷酸钙+DNA 混合微细颗粒混合微细颗粒 沉淀反应沉淀反应2030min 细胞在沉淀物中暴露细胞在沉淀物中暴露 524h 方法方法简单简单，但转化，但转化效率低效率低。3 3 脂质体介导的基因转移技术使用方便、脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。成本低廉。基本原理基本原理:利用阳离子
31、脂质体单体与利用阳离子脂质体单体与DNADNA混合后，混合后，可以自动形成包埋外源可以自动形成包埋外源DNADNA的脂质体，然后与细的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源DNADNA（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。人工脂质体膜具有如下特点：人工脂质体膜具有如下特点：1.1.与体细胞相容，无毒性和免疫原性与体细胞相容，无毒性和免疫原性与体细胞相容，无毒性和免疫原性与体细胞相容，无毒性和免疫原性2.2.可生物降解，不会在体内堆积可生物降解，不会在体内堆积可生物降解，不会在体内堆积可生物降解，不会
32、在体内堆积3.3.可制成球状可制成球状可制成球状可制成球状(0.0350(0.0350 mm)，包容大小不，包容大小不，包容大小不，包容大小不同的生物活性分子同的生物活性分子同的生物活性分子同的生物活性分子4.4.可带有不同的电荷可带有不同的电荷可带有不同的电荷可带有不同的电荷5.5.具有不同的膜脂流动性、稳定性、及温度具有不同的膜脂流动性、稳定性、及温度具有不同的膜脂流动性、稳定性、及温度具有不同的膜脂流动性、稳定性、及温度敏感性，能适应不同的生理要求敏感性，能适应不同的生理要求敏感性，能适应不同的生理要求敏感性，能适应不同的生理要求64脂粒与细胞膜之间四种可能的相互作用形式1、膜间传递 2
33、、吸附 3、细胞吞噬 4、融合 （2 2）受体介导转移技术）受体介导转移技术 将将将将DNADNADNADNA与与与与细细细细胞胞胞胞或或或或组组组组织织织织亲亲亲亲和和和和性性性性的的的的配配配配体体体体偶偶偶偶联联联联，可可可可使使使使DNADNADNADNA具具具具有有有有靶靶靶靶向向向向性性性性。这这这这种种种种偶偶偶偶联联联联通通通通常常常常通通通通过过过过多多多多聚聚聚聚阳阳阳阳离离离离子子子子（如如如如多多多多聚聚聚聚赖赖赖赖氨氨氨氨酸酸酸酸）来来来来实实实实现现现现。多多多多聚聚聚聚阳阳阳阳离离离离子子子子与与与与配配配配体体体体共共共共价价价价连连连连接接接接后后后后，又又又
34、又通通通通过过过过电电电电荷荷荷荷相相相相互互互互作作作作用用用用与与与与带带带带负负负负电电电电荷荷荷荷的的的的DNADNADNADNA结结结结合合合合，将将将将DNADNADNADNA包包包包围围围围，只只只只留留留留下下下下配配配配体体体体暴暴暴暴露露露露于于于于表表表表面面面面。这这这这样样样样形形形形成成成成的的的的复复复复合合合合物物物物可可可可被被被被带带带带有有有有特特特特异异异异性性性性受受受受体体体体的的的的靶靶靶靶细细细细胞胞胞胞吞吞吞吞饮饮饮饮，从从从从而将外源而将外源而将外源而将外源DNADNADNADNA导入靶细胞。导入靶细胞。导入靶细胞。导入靶细胞。受体介导转移技
35、术示意图载体载体优点优点缺点缺点逆转录病素逆转录病素毒毒基因组小并且简单基因组小并且简单 可稳定整合于宿主基因组可稳定整合于宿主基因组生物学特性清楚生物学特性清楚可高效转入复制中的细胞可高效转入复制中的细胞对宿主细胞无害对宿主细胞无害仅感染分裂细胞仅感染分裂细胞 随机整合（可能导致突变）随机整合（可能导致突变）病毒滴度低（病毒滴度低（107pfu/ml）可能会与有复制能务的病毒重组插可能会与有复制能务的病毒重组插入容量有限（入容量有限（=8kb）腺相关病毒腺相关病毒基因组小（基因组小（5kb）可特异整合于人可特异整合于人19号染色体号染色体以人细胞作为宿主以人细胞作为宿主无毒、无致病性无毒、无
36、致病性尚未研究清楚尚未研究清楚 需腺病毒辅助复制需腺病毒辅助复制携带外源基因能力有限（携带外源基因能力有限（4kb）难得到高滴度病毒难得到高滴度病毒腺病毒腺病毒适于原位使用，尤其是肺适于原位使用，尤其是肺(在不分裂细胞中可进行高效率的体内感染在不分裂细胞中可进行高效率的体内感染病毒滴度高（病毒滴度高（1010pfu/ml）生物学特性清楚生物学特性清楚不与宿主基因组整合不与宿主基因组整合(只有短暂表达只有短暂表达)载本基因组复杂载本基因组复杂病毒蛋白可能引起免疫及炎症反应病毒蛋白可能引起免疫及炎症反应插入外源基因能力有限（插入外源基因能力有限（7-8kb）脂质体脂质体无感染能力无感染能力 理论上
37、无理论上无DNA大小限制大小限制毒性低毒性低无特异性靶细胞无特异性靶细胞 转染效率低转染效率低仅有短暂表达仅有短暂表达体内应用困难体内应用困难受体介导的受体介导的转运转运无感染能力无感染能力 特异性转染靶细胞特异性转染靶细胞理论上无理论上无DNA大小限制大小限制构建灵活构建灵活转染效率低转染效率低 体内应用困难体内应用困难可能有免疫原性可能有免疫原性只有短暂表达只有短暂表达(三三)、基因治疗的途径、基因治疗的途径n根据基因转移的途径分类：根据基因转移的途径分类：1、ex vivo(回体转移或称二步法）将人体细胞从体内取出,基因改造,再移植到人体中。2、in vivo(活体直接转移或称一步法）直
38、接将基因转移到人体中,如DNA注射,口服,喷雾等。有如普通治疗药物,商业化发展方向所在。6869基因治疗的基因治疗的ex vivo 途径途径家族性高胆固醇血症是由于肝细胞表面低密度脂蛋白家族性高胆固醇血症是由于肝细胞表面低密度脂蛋白（LDL）受体缺乏所致。取出一小部分肝脏，打碎体外培养，）受体缺乏所致。取出一小部分肝脏，打碎体外培养，用反转录病毒携带的用反转录病毒携带的LDL受体基因转染培养细胞，将整合有受体基因转染培养细胞，将整合有LDL受体基因的肝细胞通过门静脉输回肝脏。受体基因的肝细胞通过门静脉输回肝脏。70基因治疗就向打针和吃药一样基因治疗就向打针和吃药一样.基因治疗的基因治疗的in
39、vivo 途径途径71n在大多数基因治疗临床试验中，来自患者血液或骨髓的细胞在实验室中培养。这些细胞被暴露在带有目的基因的病毒中。病毒进入细胞后，目的基因就成为宿主细胞DNA的一部分。这些细胞在实验室培养后，通过静脉注射重新回到患者体内。这类基因治疗被称为ex vivo，就是体外的意思。基因是被运送到患者细胞中，但这些细胞存在于患者体外。n在其他研究中，载体被用于将目标基因运送到患者体内的细胞中。这种基因治疗被称为“体内，in vivo。72（四）、基因治疗的靶细胞研究（四）、基因治疗的靶细胞研究73基因治疗的靶细胞/器官n1.基因缺陷的细胞:如受体缺陷细胞,肿瘤细胞等原位细胞.n2.广泛的细
40、胞类型:n 造血干细胞n 皮肤成纤维细胞n 血液淋巴细胞n 肌细胞n 肝细胞n 骨髓基质细胞74n根据靶细胞的类型分类：根据靶细胞的类型分类：1、生殖细胞（germ cell)基因治疗 2、体细胞（somatic cell)基因治疗75n(1)生殖细胞基因治疗：生殖细胞基因治疗(germ cell gene therapy)是将正常基因转移到患者的生殖细胞（精细胞、卵细胞、早期胚胎中）使其发育成正常个体。n由于有着床前诊断技术，生殖细胞基因治疗已无必要。76n(2)体细胞基因治疗：体细胞基因治疗(somatic cell gene therapy)是指将正常基因转移到体细胞，或整合到染色体上，
41、或独立于染色体外，使之表达基因产物，以达到治疗目的。这种方法的理想措施是将外源正常基因导入靶体细胞内染色体特定基因座位，用健康的基因确切地替换异常的基因，使其发挥治疗作用，同时还须减少随机插入引起新的基因突变的可能性。对特定座位基因转移，目前还有很大困难。77（五）、基因治疗在单基因遗传（五）、基因治疗在单基因遗传病、肿瘤和心血管疾病治疗上的病、肿瘤和心血管疾病治疗上的应用应用 遗传病的治疗遗传病的治疗 遗传病的治疗分为三个层次：遗传病的治疗分为三个层次：（1 1）生理水平的治疗）生理水平的治疗对症治疗对症治疗 苯丙酮尿症苯丙酮尿症限制膳食中苯丙氨酸含量限制膳食中苯丙氨酸含量 白白 化化 病病
42、戴帽子和墨镜戴帽子和墨镜（2 2）蛋白质水平治疗）蛋白质水平治疗 向病人体内补充缺失的蛋白质。向病人体内补充缺失的蛋白质。如：血友病补充凝血因子如：血友病补充凝血因子。有时，补充必要的酶也很起作用。纤维性囊泡化有时，补充必要的酶也很起作用。纤维性囊泡化病（病（CFCF）是美国白色人种中较为常见的遗传病。）是美国白色人种中较为常见的遗传病。病儿从肺、胰腺等处分泌粘液，阻碍呼吸、消化病儿从肺、胰腺等处分泌粘液，阻碍呼吸、消化等功能。等功能。5 5岁前可能因呼吸阻碍致死。岁前可能因呼吸阻碍致死。CF病儿吸入基因工程法制备的 DNA 酶粉，症状大为改善。(3 3）基因治疗基因治疗 遗传病的根治应该是基
43、因治疗，但是基遗传病的根治应该是基因治疗，但是基因治疗的难度很高。因治疗的难度很高。1990 1990 年第一例基因治疗临床试验使腺苷年第一例基因治疗临床试验使腺苷酸脱氨酶（酸脱氨酶（ADAADA）基因进入骨髓细胞，再送回）基因进入骨髓细胞，再送回病人体内，治疗严重综合免疫缺失症病人体内，治疗严重综合免疫缺失症（SCIDSCID）获得初步效果。）获得初步效果。基因治疗的策略基因治疗的策略n1.替代缺失的基因（CFTR for CF）n2.正常或外源基因的异常表达(insulin)n3.靶细胞中表达毒素（TK gene）n4.封闭靶细胞中有害基因的表达（antisense）n5.核酶（riboz
44、yme）实施基因治疗的必要步骤如下：找到致病基因 克隆得到大量与致病基因相 应的正常基因 采取适当方法把正常基因放回 到病人身体内去 进入体内的正常基因应正常表达腺苷脱氨酶（腺苷脱氨酶（ADAADA）缺乏症）缺乏症nADAADA缺乏症是一种罕见的遗传病，患者没缺乏症是一种罕见的遗传病，患者没有正常的有正常的ADAADA基因，他们的缺陷基因不能基因，他们的缺陷基因不能产生功能性产生功能性ADAADA酶。酶。ADAADA缺乏的孩子一出生缺乏的孩子一出生就有严重的免疫缺陷，十分容易受感染，就有严重的免疫缺陷，十分容易受感染，有生命的危险。虽然有生命的危险。虽然ADAADA缺乏症能用缺乏症能用PEG-
45、PEG-ADAADA治疗，但这种药物十分昂贵（一年要治疗，但这种药物十分昂贵（一年要花花6000060000美元），而且必须通过静脉注射美元），而且必须通过静脉注射来维持生命。来维持生命。严重联合免疫缺失症（SCID）患儿从出生时起就必须生活在隔离室中。nADAADA缺乏症被选为第一个基因治疗试验有以下缺乏症被选为第一个基因治疗试验有以下几点原因：几点原因：这种疾病是由单个基因的缺陷导致的，基因这种疾病是由单个基因的缺陷导致的，基因治疗成功的可能性高；基因调控很简单，治疗成功的可能性高；基因调控很简单，总总是开启是开启 的状态，不像许多其他基因，调控很的状态，不像许多其他基因，调控很复杂复杂
46、；ADAADA的数量无需精确调控。即使很少量的数量无需精确调控。即使很少量的酶也能受益，即使数量很多也能忍受。的酶也能受益，即使数量很多也能忍受。腺苷脱氨酶（腺苷脱氨酶（ADAADA）缺乏症）缺乏症 1990年年9月月14日，安德森将经过改造的日，安德森将经过改造的含有健康基因的白细胞输入因腺苷脱氨酶缺含有健康基因的白细胞输入因腺苷脱氨酶缺乏造成先天性免疫功能不全，只能生活在无乏造成先天性免疫功能不全，只能生活在无菌的隔离帐里的菌的隔离帐里的4岁女孩的左臂静脉血管，岁女孩的左臂静脉血管，以后的以后的10个月内她又接受了个月内她又接受了7次同样的治疗。次同样的治疗。1991年年1月，另一名患同样
47、病的女孩也接受月，另一名患同样病的女孩也接受了同样的治疗。两患儿经治疗后，免疫功能了同样的治疗。两患儿经治疗后，免疫功能日趋健全，走出了隔离帐，过上了正常人生日趋健全，走出了隔离帐，过上了正常人生活，并进入普通小学上学。活，并进入普通小学上学。基因治疗遗传病基因治疗遗传病 继继安安德德林林之之后后，法法国国巴巴黎黎奈奈克克儿儿童童医医院院的的费费舍舍尔尔博博士士与与卡卡波波博博士士也也对对两两例例SCID患儿成功地进行了基因治疗。患儿成功地进行了基因治疗。基因治疗遗传病基因治疗遗传病89n2）、血友病B：是基因治疗的模式病种之一。常规治疗以输血和血制品为主，既会引起严重输血反应，还容易感染病毒
48、，此外还因凝血因子在血液中半衰期短，需要经常性输入，不仅不方便而且治疗费用昂贵。基因治疗为血友病B的治疗开辟了一条新的途径。90n血友病B是基因治疗的理想病种，其发病的生化和遗传机制已被阐明，而且hFIX是分泌型蛋白，能在多种组织中被表达、加工和分泌，基因治疗的靶组织选择范围广。另外，血友病B的基因治疗对靶细胞表达量的要求不高，只要达到正常人hFIX血浆浓度的10%（约500ng/mL）左右，就能治愈患者凝血功能的缺陷，同时血友病B有基因剔除的动物模型，有成熟的hFIX表达量和凝血活性的测定方法，便于进行基因治疗的疗效评价。91n目前，血友病B的基因治疗取得了一定的进展，但在大动物和人体试验的
49、结果还不够理想，需进一步提高hFIX的表达水平以提高治疗的有效性和安全性。2、肿瘤基因治疗 n肿瘤基因治疗是通过将外源基因导入目的细胞并有效表达从而达到治疗肿瘤的目的。按目的基因的功能分为以下几种：92n1）、抑癌基因的导入和癌基因的反义核酸导入疗法n肿瘤形成的分子机制涉及到癌基因的激活和抑癌基因的失活。n近年来相继克隆了Rb、p53、NF1、DCC、ERBA、APC、MTS等抑癌基因。nRb基因缺陷会导致视网膜母细胞瘤、小细胞肺癌和膀胱癌等肿瘤，将正常的Rb基因导入视网膜母细胞瘤中，该细胞将失去致瘤能力。93n在超过50%的肿瘤中都发现有p53基因的突变。将野生型p53基因转染肿瘤细胞，肿瘤
50、细胞会发生凋亡，在动物体内致瘤能力下降。Clayman等采用腺病毒携带p53基因治疗头颈部肿瘤取得了较好的疗效。94n在癌基因的反义基因治疗中，目前已经选取的靶基因很广泛，癌基因包括c-src、c-fos、H-ras、K-ras、c-myc等；自分泌的生长因子及其受体基因包括IGF-1、IGF-1受体、EGF、TGF-等。Amini等首先将表达src反义基因的质粒导入v-src过度表达的转化细胞，结果该细胞的致瘤性下降。Laird将带有TGF-反义基因的反转录病毒转染肝癌细胞株，细胞在裸鼠体内的致瘤性下降；Lian将IGF-1反义基因导入C6大鼠胶质瘤细胞，该细胞致瘤性下降。95n2）、免疫基