医学遗传学基因诊断与治疗.ppt

上传人:石*** 文档编号:46604079 上传时间:2022-09-27 格式:PPT 页数:64 大小:2.85MB
返回 下载 相关 举报
医学遗传学基因诊断与治疗.ppt_第1页
第1页 / 共64页
医学遗传学基因诊断与治疗.ppt_第2页
第2页 / 共64页
点击查看更多>>
资源描述

《医学遗传学基因诊断与治疗.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《医学遗传学基因诊断与治疗.ppt(64页珍藏版)》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。

1、医学遗传学基因诊断与治疗现在学习的是第1页,共64页传统的诊断传统的诊断、问、望、听、触、问、望、听、触经验型判断的方法。经验型判断的方法。、化验、化验/检验检验细胞、组织、大分子、小细胞、组织、大分子、小分子、酶、代谢物;微生物、免疫学、生物化分子、酶、代谢物;微生物、免疫学、生物化学、病理学等。学、病理学等。、影像学、影像学X X线、线、B B超、超、CTCT、核磁共振、内、核磁共振、内窥镜等。窥镜等。、特殊检查、特殊检查染色体检查、肌电染色体检查、肌电/脑电脑电/心心电、骨密度、原子吸收光谱等。电、骨密度、原子吸收光谱等。现在学习的是第2页,共64页 随着技术水平的发展,这些诊断方法随着

2、技术水平的发展,这些诊断方法也在不断的提高和完善,在医学实践中发挥也在不断的提高和完善,在医学实践中发挥了巨大的作用。并还将有更先进的方法问世。了巨大的作用。并还将有更先进的方法问世。但这些方法大多存在一个无法克服的但这些方法大多存在一个无法克服的缺陷:不可预先诊断。缺陷:不可预先诊断。现在学习的是第3页,共64页 随着分子生物学和分子遗传学的发展,随着分子生物学和分子遗传学的发展,越来越多的证据表明,绝大多数疾病的发生越来越多的证据表明,绝大多数疾病的发生和发展都与患者的遗传物质结构和功能改变和发展都与患者的遗传物质结构和功能改变有关,所以遗传物质的检查越来越显得必要。有关,所以遗传物质的检

3、查越来越显得必要。基因诊断的定义基因诊断的定义 应用分子生物学方法检测患者体内遗传应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构和功能变化而作出的或辅助临床物质的结构和功能变化而作出的或辅助临床诊断的技术,称为诊断的技术,称为基因诊断基因诊断。现在学习的是第4页,共64页 基因诊断具有灵敏度高、特异性强、费用低,基因诊断具有灵敏度高、特异性强、费用低,并对许多疾病特别是遗传性疾病做出预先诊断并对许多疾病特别是遗传性疾病做出预先诊断的优点。它是一种极具发展潜力的诊断方法。的优点。它是一种极具发展潜力的诊断方法。由于基因诊断发展的时间不长,人们对于由于基因诊断发展的时间不长,人们对于基因,特别是致病

4、基因的了解还有许多空白,基因,特别是致病基因的了解还有许多空白,因此许多疾病的诊断还主要依靠其他方法。此因此许多疾病的诊断还主要依靠其他方法。此外,基因诊断的发展并非取代和抛弃其他方法,外,基因诊断的发展并非取代和抛弃其他方法,而是相互补充,共同发展。而是相互补充,共同发展。现在学习的是第5页,共64页 长期以来,单基因遗传病的诊断主要靠临长期以来,单基因遗传病的诊断主要靠临床观察和一系列生化检查,但生化学检查要求床观察和一系列生化检查,但生化学检查要求有相应基因表达产物的体液或细胞,并对基因有相应基因表达产物的体液或细胞,并对基因产物或代谢异常机理有所了解。产物或代谢异常机理有所了解。但对绝

5、大多数遗传病而言,目前还远但对绝大多数遗传病而言,目前还远未达到这种认识。未达到这种认识。诊断方法的变更诊断方法的变更现在学习的是第6页,共64页 理想的诊断方法是对患者基因或理想的诊断方法是对患者基因或DNADNA本身直本身直接进行分析,因为这种分析摆脱了上述各种限接进行分析,因为这种分析摆脱了上述各种限制。机体各种组织的核细胞均有全套基因组制。机体各种组织的核细胞均有全套基因组DNADNA,可以作为分析的材料,而不必考虑表达,可以作为分析的材料,而不必考虑表达问题,是目前诊断技术中最具发展前途的技术。问题,是目前诊断技术中最具发展前途的技术。现在学习的是第7页,共64页基因诊断的对象基因诊

6、断的对象1.1.病原生物的侵入,如肝炎、艾滋病、支病原生物的侵入,如肝炎、艾滋病、支原体、细菌、寄生虫。原体、细菌、寄生虫。2.2.先天遗传性疾患,先天遗传性疾患,如苯丙酮尿症、无丙如苯丙酮尿症、无丙种球蛋白血症。种球蛋白血症。3.3.后天基因突变引起的疾病,如肿瘤。后天基因突变引起的疾病,如肿瘤。4.4.其它,如亲子鉴定、个体识别、法医物其它,如亲子鉴定、个体识别、法医物证。证。现在学习的是第8页,共64页基因诊断的内容基因诊断的内容与疾病相关的遗传物质改变主要有两类,与疾病相关的遗传物质改变主要有两类,1.1.遗传物质,即遗传物质,即DNADNA或或RNARNA的水平的变化。的水平的变化。

7、如病毒感染时病毒基因及其转录产物在人体如病毒感染时病毒基因及其转录产物在人体内的从无到有,某些肿瘤中癌基因表达水平的内的从无到有,某些肿瘤中癌基因表达水平的从低到高。从低到高。现在学习的是第9页,共64页 2.2.遗传物质的结构变化,即基因突变。遗传物质的结构变化,即基因突变。如点突变引起的基因失活、染色体转位引如点突变引起的基因失活、染色体转位引起的基因激活或灭活等等。起的基因激活或灭活等等。因此,从理论上说,所有涉及基因结因此,从理论上说,所有涉及基因结构和功能变化的检测都属于基因诊断。构和功能变化的检测都属于基因诊断。现在学习的是第10页,共64页基因诊断的原理基因诊断的原理 核酸分子杂

8、交是基因诊断的最基本的核酸分子杂交是基因诊断的最基本的方法之一。方法之一。基本原理是:互补的基本原理是:互补的DNADNA单链能够在单链能够在一定条件下结合成双链,即能够进行杂一定条件下结合成双链,即能够进行杂交。交。这种结合是特异的,即严格按照碱这种结合是特异的,即严格按照碱基互补的原则进行,它不仅能在基互补的原则进行,它不仅能在DNADNA和和DNADNA之间进行,也能在之间进行,也能在DNADNA和和RNARNA之间进行。之间进行。现在学习的是第11页,共64页 用一段已知基因的核酸序列作出探针,与变性后用一段已知基因的核酸序列作出探针,与变性后的单链基因组的单链基因组DNADNA接触时

9、,如果两者的碱基完全配接触时,如果两者的碱基完全配对,它们即互补地结合成双链,从而表明被测基对,它们即互补地结合成双链,从而表明被测基因组因组DNADNA中含有已知的基因序列。进行基因检测有两中含有已知的基因序列。进行基因检测有两个必要条件:个必要条件:一是必需的特异的一是必需的特异的DNADNA探针;探针;二是必需的基因组二是必需的基因组DNADNA。当两者都变性呈单链状态时,就能进行分子当两者都变性呈单链状态时,就能进行分子杂交。杂交。现在学习的是第12页,共64页基因探针基因探针 基因探针(基因探针(probeprobe)就是一段与目的基因)就是一段与目的基因或或DNADNA互补的特异核

10、苷酸序列,它可以包括整互补的特异核苷酸序列,它可以包括整个基因,也可以仅仅是个基因,也可以仅仅是/基因的一部分;可以基因的一部分;可以是是DNADNA本身,也可以是由之转录而来的本身,也可以是由之转录而来的RNARNA。现在学习的是第13页,共64页DNADNA探针根据其来源有探针根据其来源有3 3种:种:1 1、来自基因组中有关的基因本身,称为基因组、来自基因组中有关的基因本身,称为基因组探针(探针(genomic probegenomic probe)2 2、是从相应的基因转录获得了、是从相应的基因转录获得了mRNAmRNA,再通过逆,再通过逆转录得到的探针,称为转录得到的探针,称为cDN

11、a cDNa 探针(探针(cDNa cDNa probeprobe)。与基因组探针不同的是,)。与基因组探针不同的是,cDNAcDNA探针不探针不含有内含子序列含有内含子序列3 3、可在体外人工合成碱基数不多的与基因序、可在体外人工合成碱基数不多的与基因序列互补的列互补的DNADNA片段,称为寡核苷酸探针片段,称为寡核苷酸探针一、探针的一、探针的 来源:来源:现在学习的是第14页,共64页二、探针的制备二、探针的制备 一般是通过分子克隆(一般是通过分子克隆(molecular molecular cloningcloning)获得的。)获得的。克隆是指用无性繁殖方法获得同一个克隆是指用无性繁殖

12、方法获得同一个体、细胞或分子的大量复制品。体、细胞或分子的大量复制品。现在学习的是第15页,共64页 当制备基因组当制备基因组DNADNA探针进,应先制备基因探针进,应先制备基因组文库,即把基因组组文库,即把基因组DNADNA打断,或用限制性酶打断,或用限制性酶作不完全水解,得到许多大小不等的随机片作不完全水解,得到许多大小不等的随机片段,将这些片段体外重组到运载体(噬菌体、段,将这些片段体外重组到运载体(噬菌体、质粒等)中去,再将后者转染适当的宿主细质粒等)中去,再将后者转染适当的宿主细胞如大肠肝菌,这时在固体培养基上可以得胞如大肠肝菌,这时在固体培养基上可以得到许多携带有不同到许多携带有不

13、同DNADNA片段的克隆噬菌斑,通片段的克隆噬菌斑,通过原位杂交,从中可筛出含有目的基因片段过原位杂交,从中可筛出含有目的基因片段的克隆,然后通过细胞扩增,制备出大量的的克隆,然后通过细胞扩增,制备出大量的探针。探针。现在学习的是第16页,共64页制备制备cDNA cDNA 探针探针 离纯化相应离纯化相应mRNA mRNA mRNAmRNA模板模板 cDNA cDNA 人工合成寡核苷酸探针人工合成寡核苷酸探针已知蛋白质的氨基酸顺序量已知蛋白质的氨基酸顺序量 按氨基酸的密码推导出核苷酸序列按氨基酸的密码推导出核苷酸序列 化学方法合成化学方法合成 现在学习的是第17页,共64页三、探针的标记三、探

14、针的标记 为了确定探针是否与相应的基因组为了确定探针是否与相应的基因组DNADNA杂交,杂交,有必要对探针加以标记,以便在结合部位获得可识有必要对探针加以标记,以便在结合部位获得可识别的信号别的信号,通常采用放射性同位素通常采用放射性同位素3232P P标记探针的标记探针的某种核苷酸某种核苷酸磷酸基。磷酸基。近年来已发展了一些用非同位素如生物素、近年来已发展了一些用非同位素如生物素、地高辛配体等作为标记物的方法。但都不及同位地高辛配体等作为标记物的方法。但都不及同位素敏感。素敏感。现在学习的是第18页,共64页5353最常用的探针标记法最常用的探针标记法 缺口平移法缺口平移法(nick tra

15、nslation)(nick translation),5353DNA酶酶I5353OH P+DNA聚合酶聚合酶+标记核苷酸标记核苷酸5335OH P5353OH P53OH P35现在学习的是第19页,共64页随机引物法:随机引物法:即向变性的探针溶液加入即向变性的探针溶液加入6 6个核苷酸个核苷酸的随机的随机DNADNA小片段,作为引物,当后者小片段,作为引物,当后者与单链与单链DNADNA互补结合后,按碱基互补原则互补结合后,按碱基互补原则不断在其不断在其3 3OHOH端添加同位素标记的单核苷端添加同位素标记的单核苷酸,这样也可以获得比放射性很高的酸,这样也可以获得比放射性很高的DNAD

16、NA探探针。针。现在学习的是第20页,共64页限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶(限制性核酸内切酶(restriction restriction endonucleaseendonuclease),又简称限制酶或内切酶。它们),又简称限制酶或内切酶。它们是基因工程和基因诊断重要的一类工具酶。是基因工程和基因诊断重要的一类工具酶。限制酶能特异地识别和切割特异的核苷酸限制酶能特异地识别和切割特异的核苷酸序列,将双链序列,将双链DNADNA切成较小的片段。酶切后目的切成较小的片段。酶切后目的基因可能完整地或部分地保存于某一基因可能完整地或部分地保存于某一DNADNA片段上,片段上,

17、并被分离出来。并被分离出来。现在学习的是第21页,共64页 每种限制酶识别和切割的通常为每种限制酶识别和切割的通常为4-64-6个核苷酸序个核苷酸序列列,称为限制性位点称为限制性位点(restriction sites)(restriction sites)或切点。或切点。限制酶切割双链限制酶切割双链DNADNA的方式有两种,产生的的方式有两种,产生的末端也有两种:末端也有两种:第一种是交错切割,即两条链的切点不在同一第一种是交错切割,即两条链的切点不在同一水平而是相隔数个碱基,故断口产生两小段自身互水平而是相隔数个碱基,故断口产生两小段自身互补的单链,这种末端容易互补连接,称为粘性末端补的单

18、链,这种末端容易互补连接,称为粘性末端(cohesive terminuscohesive terminus););限制性位点限制性位点现在学习的是第22页,共64页 第二种为平整切割第二种为平整切割 ,即两条链在同一水平切,即两条链在同一水平切开,得到平齐末端(开,得到平齐末端(blunt terminusblunt terminus)。)。5GAATTC33CTTAAG5EcoR 5GGCC33CGCG5HaeIII 由于具有相同粘性末端的由于具有相同粘性末端的DNADNA片段在片段在DNADNA连连接酶的作用下很容易共价连接,因此被广泛地接酶的作用下很容易共价连接,因此被广泛地应用于重组

19、应用于重组DNADNA操作中。具有相同平齐末端的操作中。具有相同平齐末端的DNADNA片段也可以连接,但连接效率只有粘性末端连片段也可以连接,但连接效率只有粘性末端连接效率的接效率的1 1。现在学习的是第23页,共64页常用基因诊断的技术常用基因诊断的技术1.Hybridization1.Hybridization2.2.聚合酶链反应聚合酶链反应 PCRPCR3.3.限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性 RFLPRFLP4.4.扩增片段长度多态性扩增片段长度多态性 AFLPAFLP5.5.寡核苷酸探针寡核苷酸探针 ASOASO6.6.单链构象多态性单链构象多态性 SSCPSSCP现在学习的

20、是第24页,共64页 每个人的每个人的DNADNA是不完全相同的,一般每是不完全相同的,一般每100100500bp500bp就有一就有一个是不相同的,即多态性。在两套基因组个是不相同的,即多态性。在两套基因组DNADNA中平均有中平均有10001000万万处不同,它们多位于内含子序列中。碱基的变异就可能导致酶处不同,它们多位于内含子序列中。碱基的变异就可能导致酶切点的消失或新的切点出现,当使用同一限制酶切割不同个体切点的消失或新的切点出现,当使用同一限制酶切割不同个体基因组基因组DNADNA时,时,DNADNA片段长度出现差异,这种由于内切酶切点片段长度出现差异,这种由于内切酶切点变化所导致

21、的变化所导致的DNADNA片段长度的差异,称为限制性片段长度多态片段长度的差异,称为限制性片段长度多态性(性(restriction fragment length polymorphism,RFLPrestriction fragment length polymorphism,RFLP)。)。RFLPRFLP反映了常见的个体间反映了常见的个体间DNADNA核苷酸的可遗传性变异,核苷酸的可遗传性变异,它按照孟德尔方式遗传。它按照孟德尔方式遗传。RFLPRFLP可用可用SouthernSouthern印迹杂交法检印迹杂交法检出。出。1.RFLP(restriction fragment len

22、gth 1.RFLP(restriction fragment length polymorphism)polymorphism)现在学习的是第25页,共64页等位基因等位基因2 2由于出现新的切点,由于出现新的切点,DNADNA片段缩至片段缩至8kb8kb。DNA DNA片段电泳后杂交图片段电泳后杂交图等位基因等位基因2 2探针位置探针位置12kb8kb8Kb4Kb等位基因等位基因1 1探针位置探针位置现在学习的是第26页,共64页等位基因等位基因 1/1 2/2 1/2 RFLP RFLP的检出等位基因的检出等位基因1 1因有额外切点而导致产生两个长因有额外切点而导致产生两个长短不同的短不

23、同的DNADNA片段(片段(3kb3kb及及5kb5kb)且均能与探针杂交。)且均能与探针杂交。探针位置探针位置8kb5kb3kb3Kb5Kb等位基因等位基因1 18Kb等位基因等位基因2 2现在学习的是第27页,共64页 在人类基因组中还存在一类在人类基因组中还存在一类DNADNA重复序列,称为小重复序列,称为小卫星卫星DNADNA。它们分布十分广泛,每个重复单位通常只有几。它们分布十分广泛,每个重复单位通常只有几几十个碱基对,但其重复次数在人群中是高度变异的,又几十个碱基对,但其重复次数在人群中是高度变异的,又叫数目变异的串联重复(叫数目变异的串联重复(variable number ta

24、ndem variable number tandem repeats,VNTRrepeats,VNTR)。当用限制酶切割)。当用限制酶切割VNTRVNTR区时,只要酶切点区时,只要酶切点不在重复区内,就可能得到各种长度不同的片段,可用于致不在重复区内,就可能得到各种长度不同的片段,可用于致病基因的连锁分析。病基因的连锁分析。探针探针酶切后电泳酶切后电泳VNTR现在学习的是第28页,共64页 串联重复的短片段的长度多态性可以通过串联重复的短片段的长度多态性可以通过PCRPCR扩增后电泳来检出,并用于致病基因的连扩增后电泳来检出,并用于致病基因的连锁分析,这种诊断方法称为扩增片段长度多态锁分析,

25、这种诊断方法称为扩增片段长度多态性(性(AFLPAFLP)连锁分析法。)连锁分析法。PCRPCR扩增后,产物即等位片段之间的差别有扩增后,产物即等位片段之间的差别有时只有几个核苷酸,故需用聚丙烯酰胺凝胶电时只有几个核苷酸,故需用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离鉴定。此法多用于突变性质不明的连锁泳分离鉴定。此法多用于突变性质不明的连锁分析。分析。2.AFLP2.AFLP(amplified fragment length polymorphismamplified fragment length polymorphism)现在学习的是第29页,共64页 当基因的突变部位和性质已完全明了时,可以当基因的突变

26、部位和性质已完全明了时,可以合成等位基因特异的寡核苷酸探针合成等位基因特异的寡核苷酸探针(allele-specific oligonucleotide,ASO)用同位素或非同位素标记用同位素或非同位素标记进行诊断。探针通常为长进行诊断。探针通常为长20bp20bp左右的核苷酸。用于左右的核苷酸。用于探测点突变时需要合成两种或两种以上的探针,一种探测点突变时需要合成两种或两种以上的探针,一种与正常基因序列完全一致,能与之稳定地杂交,但不与正常基因序列完全一致,能与之稳定地杂交,但不能与突变基因序列杂交;另一种与突变基因序列一致,能与突变基因序列杂交;另一种与突变基因序列一致,能与突变基因序列稳

27、定杂交,但不能与正常基因序列能与突变基因序列稳定杂交,但不能与正常基因序列稳定杂交,这样,就可以把只有一个碱基发生了突变稳定杂交,这样,就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区别开来。的基因区别开来。3.ASO3.ASO(allele-specific oligonucleotideallele-specific oligonucleotide)现在学习的是第30页,共64页 PCR PCR可结合可结合ASOASO,即,即PCRPCRASOASO技术,即先将技术,即先将含有突变点的基因有关片段进行体外扩增,然后含有突变点的基因有关片段进行体外扩增,然后再与再与ASOASO探针作点杂交,这样大大简

28、化了方法,探针作点杂交,这样大大简化了方法,节约了时间,而且只要极少量的基因组节约了时间,而且只要极少量的基因组DNADNA就就可进行。可进行。现在学习的是第31页,共64页 异常探针异常探针 T A GT A G正常人正常人 患者患者 DNA DNADNA DNA正常人正常人 患者患者 DNA DNADNA DNA杂交结果杂交结果点杂交点杂交 正常探针正常探针 G A GG A G 正常人正常人 患者患者 DNA DNADNA DNA杂交结果杂交结果 正常人正常人 患者患者 DNA DNADNA DNA点杂交点杂交 等位基因特异的寡核苷酸探针等位基因特异的寡核苷酸探针(ASO)(ASO)检测

29、点突变检测点突变现在学习的是第32页,共64页4 4、聚合酶链反应、聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCRpolymerase chain reaction,PCR)PCRPCR原理原理现在学习的是第33页,共64页PCRPCR原理原理变性变性现在学习的是第34页,共64页PCRPCR原理原理复性复性现在学习的是第35页,共64页PCRPCR原理原理延伸延伸现在学习的是第36页,共64页PCRPCR原理原理变性变性现在学习的是第37页,共64页PCRPCR原理原理复性复性现在学习的是第38页,共64页PCRPCR原理原理延伸延伸现在学习的是第39页,共64页P

30、CRPCR原理原理变性变性现在学习的是第40页,共64页PCRPCR原理原理复性复性现在学习的是第41页,共64页PCRPCR原理原理延伸延伸现在学习的是第42页,共64页 DNA DNA以指数形式扩增以指数形式扩增(2(2n n),其中长片段以线性形其中长片段以线性形式扩增式扩增(2(2n+2)n+2),最终主产物片段长度在两个引物最终主产物片段长度在两个引物之间。之间。长片段(单链)长片段(单链)2402401616256256114114525222228 82 20 00 0短片段(单链)短片段(单链)1414121210108 86 64 42 2128128646432321616

31、总片段(单链)总片段(单链)循环数循环数现在学习的是第43页,共64页预变性预变性(92-95(92-95 C,2-5m)C,2-5m)变性变性(92-95(92-95 C,30s)C,30s)复性复性(40-60(40-60 C,30s)C,30s)延伸延伸(72(72 C,30-60s)C,30-60s)总延伸总延伸(72(72 C,7m)C,7m)(25-35)(25-35)PCRPCR的一般过程:的一般过程:经过经过3030次的循环次的循环,扩增的扩增的DNADNA片段可达片段可达100100万倍以上。万倍以上。现在学习的是第44页,共64页5、Southern 杂交法杂交法细胞细胞提

32、取目的基因提取目的基因限制性内切酶消化限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳观察分析观察分析变变性性原原位位转转移移硝硝酸酸纤纤维维滤滤膜膜上上探针杂交探针杂交放射自显影放射自显影现在学习的是第45页,共64页基因诊断的临床检测应用基因诊断的临床检测应用现在学习的是第46页,共64页1.1.基因诊断在感染性疾病检测中的应用基因诊断在感染性疾病检测中的应用乙型肝炎病毒(乙型肝炎病毒(HBVHBV)、人乳头瘤病毒()、人乳头瘤病毒(HPVHPV):):其其DNADNA可以使用点杂交、可以使用点杂交、PCRPCR方法直接检出。方法直接检出。丙型肝炎病毒(丙型肝炎病毒(HCVHCV)、人免疫缺陷

33、病毒()、人免疫缺陷病毒(HIVHIV):):其其RNARNA可以使用可以使用RT-PCRRT-PCR方法直接检出。方法直接检出。结核杆菌和疟原虫的分型可以使用探针杂交和结核杆菌和疟原虫的分型可以使用探针杂交和PCRPCR方方法检出。法检出。现在学习的是第47页,共64页丙型肝炎丙型肝炎(HCV)(HCV)基因诊断实例基因诊断实例 丙型肝炎为丙型肝炎为RNARNA病毒,病毒,9500mer9500mer,编码,编码3011-30333011-3033个个氨基酸,具有高变异性。基因组组成:氨基酸,具有高变异性。基因组组成:E1E1NS2NS2NS3NS3NS4NS43-NCR3-NCRC CNS

34、1/E2NS1/E2NS1NS15-NCR5-NCR高变异区(编码衣壳和包膜蛋白)高变异区(编码衣壳和包膜蛋白)NCR:NCR:非编码区非编码区 5-NCR 5-NCR为保守的区域,将引物设计在该区为保守的区域,将引物设计在该区域,进行域,进行RT-PCR,RT-PCR,可特异性的扩增可特异性的扩增HCVHCV。PCRPCR引物:引物:+:5+:5-GATTCTCGAGGCGACACTCCACCATAGAT-GATTCTCGAGGCGACACTCCACCATAGAT-:5-:5-ATACTCGAGGTGCACGGTCTACGAGACCT-ATACTCGAGGTGCACGGTCTACGAGACC

35、TPCRPCR产物长度为产物长度为322bp322bp现在学习的是第48页,共64页 2.2.基因诊断在遗传病检测中的应用基因诊断在遗传病检测中的应用 镰状细胞贫血症(镰状细胞贫血症(globinglobin,6 6),其),其GAGGAGGTGGTG的突变,可用的突变,可用RFLPRFLP(Mst IIMst II,CCTNAGGCCTNAGG)或)或PCR-SSCPPCR-SSCP检出。检出。现在学习的是第49页,共64页甲型血友病(甲型血友病(FVIIIFVIII,XRXR)可用可用PCR-RFLPPCR-RFLP检出。检出。142 bp142 bp 99 bp 99 bp现在学习的是第

36、50页,共64页3.3.基因诊断在肿瘤检测中的应用基因诊断在肿瘤检测中的应用在许多肿瘤中存在的在许多肿瘤中存在的癌基因癌基因 rasras、mycmyc等的突变等的突变抗癌基因抗癌基因P53P53、RbRb等的突变、丢失等的突变、丢失可用可用PCRPCR、PCR-ASOPCR-ASO、PCR-SSCPPCR-SSCP等方法检出。等方法检出。现在学习的是第51页,共64页4.4.基因诊断在个体识别中的应用基因诊断在个体识别中的应用鉴定基因多态性的方法均可用于:鉴定基因多态性的方法均可用于:亲子鉴定、个体识别、法医物证亲子鉴定、个体识别、法医物证现在学习的是第52页,共64页基因治疗基因治疗(ge

37、ne therapy)现在学习的是第53页,共64页基因治疗的策略基因治疗的策略 1 1、生殖细胞基因治疗:生殖细胞基因治疗、生殖细胞基因治疗:生殖细胞基因治疗(germ cell gene therapy)是将正常基因转移到患者的生殖是将正常基因转移到患者的生殖细胞(精细胞、卵细胞中早期胚胎)使其发育成细胞(精细胞、卵细胞中早期胚胎)使其发育成正常个体,显然,这是理想的方法。正常个体,显然,这是理想的方法。1 1、体细胞基因治疗:体细胞基因治疗、体细胞基因治疗:体细胞基因治疗(somatic cell gene therapy)是指将正常基因转移到体细胞,使之表是指将正常基因转移到体细胞,使

38、之表达基因产物,以达到治疗目的。达基因产物,以达到治疗目的。现在学习的是第54页,共64页基因治疗的方法基因治疗的方法 1 1基因转移方法基因转移方法 (1 1)特异正常基因的分离与克隆:)特异正常基因的分离与克隆:(2 2)外源基因的转移:)外源基因的转移:基因转移(基因转移(gene transfergene transfer)是将外源基因导)是将外源基因导入细胞内。入细胞内。现在学习的是第55页,共64页基因转移方法:基因转移方法:1 1)化学法:将正常基因)化学法:将正常基因DNADNA(及其拷贝)与带电(及其拷贝)与带电荷物质和磷酸钙、荷物质和磷酸钙、DEAEDEAE葡萄糖或与若干脂

39、类混合,葡萄糖或与若干脂类混合,形成沉淀的形成沉淀的DNADNA微细颗粒,直接倾入培养基中与细胞微细颗粒,直接倾入培养基中与细胞接触,由于钙离子有促进接触,由于钙离子有促进DNADNA透过细胞有作用,某透过细胞有作用,某些化合物可扰乱细胞膜,故可将些化合物可扰乱细胞膜,故可将DNADNA输入细胞内,输入细胞内,并整合于受体细胞的基因组中,在适当的条件下,并整合于受体细胞的基因组中,在适当的条件下,整合基因得以表达,细胞亦可传代。整合基因得以表达,细胞亦可传代。方法简单,但效率极低,一般方法简单,但效率极低,一般10001000100000100000个个细胞中只有一个细胞可结合导入的外源基因。

40、细胞中只有一个细胞可结合导入的外源基因。现在学习的是第56页,共64页2 2)物理法:包括电穿孔法和直接显微注射法)物理法:包括电穿孔法和直接显微注射法 电穿孔法:电穿孔法电穿孔法:电穿孔法(electroporotion)是将细是将细胞置于高压脉冲电场中,通过电击使细胞产生可胞置于高压脉冲电场中,通过电击使细胞产生可逆性的穿孔,周围基质中的逆性的穿孔,周围基质中的DNADNA可渗进细胞,但有可渗进细胞,但有时也会使细胞受到严重损伤。时也会使细胞受到严重损伤。显微注射法:显微注射显微注射法:显微注射(microinjection)是在显是在显微镜直视下,向细胞核内直接注射外源基因,这种微镜直视

41、下,向细胞核内直接注射外源基因,这种方法应是有效的。但一次只能注射一个细胞,工作方法应是有效的。但一次只能注射一个细胞,工作耗力费时。此法用于生殖细胞时,有效率可达耗力费时。此法用于生殖细胞时,有效率可达1010。直接用于体细胞却很困难。直接用于体细胞却很困难。现在学习的是第57页,共64页脂质体法:脂质体(脂质体法:脂质体(liposomeliposome)法是应用人工脂)法是应用人工脂质体包装外源基因,再与靶细胞融合,或直接注入质体包装外源基因,再与靶细胞融合,或直接注入病灶组织,使之表达。病灶组织,使之表达。3 3)同源重组法:同源重组()同源重组法:同源重组(homologous ho

42、mologous recombinationrecombination)是将外源基因定位导入受体细)是将外源基因定位导入受体细胞的染色体上,在该座位因有同源序列,通过单胞的染色体上,在该座位因有同源序列,通过单一或双交换,新基因片段替换有缺陷的片段,达一或双交换,新基因片段替换有缺陷的片段,达到修正缺陷基因的目的。到修正缺陷基因的目的。现在学习的是第58页,共64页4 4)病毒介导基因转移:前述的化学和物理方)病毒介导基因转移:前述的化学和物理方法都是通过传染方式基因转移。病毒介导基因转法都是通过传染方式基因转移。病毒介导基因转移(移(viral mediated gene transferv

43、iral mediated gene transfer)是通过转)是通过转换方式完成基因转移,即以病毒为载体(换方式完成基因转移,即以病毒为载体(vectorvector),将外源目的基因通过基因重组技术,将其组装于将外源目的基因通过基因重组技术,将其组装于病毒上,让这种重组病毒去感染受体宿主细胞,病毒上,让这种重组病毒去感染受体宿主细胞,这种病毒称为病毒运载体(这种病毒称为病毒运载体(viral vectorviral vector)。)。现在学习的是第59页,共64页两种病毒介导基因转移方法两种病毒介导基因转移方法 反转录病毒载体:反转录病毒虽是反转录病毒载体:反转录病毒虽是RNARNA病

44、毒,病毒,但有反转录酶,可使但有反转录酶,可使RNARNA转录为转录为DNADNA,再整合到宿,再整合到宿主细胞基因组。主细胞基因组。DNADNA病毒介导载体(病毒介导载体(DNA viral mekiated DNA viral mekiated vectorvector):):DNADNA病毒包括腺病毒、病毒包括腺病毒、SV40SV40、牛乳头、牛乳头瘤病毒、疱疹病毒等。瘤病毒、疱疹病毒等。现在学习的是第60页,共64页1 1、靶细胞、靶细胞 靶细胞:是指接受转移基因的体细胞。靶细胞:是指接受转移基因的体细胞。选择靶细胞的原则是:选择靶细胞的原则是:必须较坚固,足以耐受处理,并易于由人体分

45、必须较坚固,足以耐受处理,并易于由人体分离又便于输回体内;离又便于输回体内;具有增殖优势,生命周期长,能存活几月至几具有增殖优势,生命周期长,能存活几月至几年,最后可延续至病人的整个生命期年,最后可延续至病人的整个生命期;易于受外源遗传物质的转化;易于受外源遗传物质的转化;在选用反转录病毒载体时,目的基因表达最好在选用反转录病毒载体时,目的基因表达最好具有组织特异性的细胞。具有组织特异性的细胞。现在学习的是第61页,共64页基因治疗存在问题与伦理学基因治疗存在问题与伦理学 存在着若干重要问题存在着若干重要问题 1 1导入基因的稳定高效表达外源基因转移入病人导入基因的稳定高效表达外源基因转移入病

46、人体内细胞表达,首先与转移方法有关。化学和物体内细胞表达,首先与转移方法有关。化学和物理方法所导入的基因效率低,自然表达也差。理方法所导入的基因效率低,自然表达也差。2 2导入基因的安全性基因治疗的安全性应确保不导入基因的安全性基因治疗的安全性应确保不因导入外源目的基因而产生新的有害遗传变异,因导入外源目的基因而产生新的有害遗传变异,这是因为采用反转录病毒载体而引起的问题。这是因为采用反转录病毒载体而引起的问题。现在学习的是第62页,共64页3 3基因治疗与社会伦理道德体细胞基因治疗是符合基因治疗与社会伦理道德体细胞基因治疗是符合伦理道德的,但试图纠正生殖细胞遗传缺陷或通过伦理道德的,但试图纠

47、正生殖细胞遗传缺陷或通过遗传工程手段来改变正常人的遗传特征则是引起争遗传工程手段来改变正常人的遗传特征则是引起争议的领域。议的领域。现在学习的是第63页,共64页基因治疗必须具备下列条件:基因治疗必须具备下列条件:选择适当的疾病,并对其发病机理及相应基选择适当的疾病,并对其发病机理及相应基因的结构功能了解清楚;因的结构功能了解清楚;纠正该病的基因已被克隆,并了解该基因表达纠正该病的基因已被克隆,并了解该基因表达与调控的机制与条件;与调控的机制与条件;该基因具有适宜的受体细胞并能在体外有效表达;该基因具有适宜的受体细胞并能在体外有效表达;具有安全有效的转移载体和方法,以及可供利具有安全有效的转移载体和方法,以及可供利用的动物模型。用的动物模型。现在学习的是第64页,共64页

展开阅读全文
相关资源
相关搜索

当前位置:首页 > 教育专区 > 大学资料

本站为文档C TO C交易模式,本站只提供存储空间、用户上传的文档直接被用户下载,本站只是中间服务平台,本站所有文档下载所得的收益归上传人(含作者)所有。本站仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容本身不做任何修改或编辑。若文档所含内容侵犯了您的版权或隐私,请立即通知淘文阁网,我们立即给予删除!客服QQ:136780468 微信:18945177775 电话:18904686070

工信部备案号:黑ICP备15003705号© 2020-2023 www.taowenge.com 淘文阁