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1、筛选（筛选（Screening）遗传表型（遗传表型（phenotype）：）：是生物体遗传组成同环境是生物体遗传组成同环境相互作用所产生的外观或其他特征。相互作用所产生的外观或其他特征。n n本章教学目的和要求：本章教学目的和要求：本章教学目的和要求：本章教学目的和要求：掌握常用的抗生素抗性筛选、蓝白斑筛选、酶切筛选、酶掌握常用的抗生素抗性筛选、蓝白斑筛选、酶切筛选、酶掌握常用的抗生素抗性筛选、蓝白斑筛选、酶切筛选、酶掌握常用的抗生素抗性筛选、蓝白斑筛选、酶切筛选、酶联免疫吸附测定（联免疫吸附测定（联免疫吸附测定（联免疫吸附测定（ELISAELISAELISAELISA）和免疫印迹（）和免疫印
2、迹（）和免疫印迹（）和免疫印迹（Western Western Western Western blottingblottingblottingblotting）法的原理；了解转译筛选法和真核生物的报道）法的原理；了解转译筛选法和真核生物的报道）法的原理；了解转译筛选法和真核生物的报道）法的原理；了解转译筛选法和真核生物的报道基因筛选法。基因筛选法。基因筛选法。基因筛选法。n n重点：重点：重点：重点：常用的抗菌素抗性筛选、蓝白斑筛选、酶切筛选、酶联免常用的抗菌素抗性筛选、蓝白斑筛选、酶切筛选、酶联免常用的抗菌素抗性筛选、蓝白斑筛选、酶切筛选、酶联免常用的抗菌素抗性筛选、蓝白斑筛选、酶切筛选、
3、酶联免疫吸附测定（疫吸附测定（疫吸附测定（疫吸附测定（ELISAELISAELISAELISA）n n难点：难点：难点：难点：免疫印迹（免疫印迹（免疫印迹（免疫印迹（Western BlottingWestern BlottingWestern BlottingWestern Blotting）法的原理）法的原理）法的原理）法的原理n转化子转化子：接纳载体或重组分子的转化细胞。：接纳载体或重组分子的转化细胞。n非转化子非转化子：未接纳载体或重组分子的转化细胞。：未接纳载体或重组分子的转化细胞。n重组子重组子：含有重组：含有重组DNADNA分子的转化子。分子的转化子。n非重组子非重组子：仅含有空
4、载载体分子的转化子。：仅含有空载载体分子的转化子。n期望重组子期望重组子：含有目的基因的重组子。：含有目的基因的重组子。n非期望重组子非期望重组子：不含有目的基因的重组子。：不含有目的基因的重组子。1 1 抗药性标记及其插入失活选择法抗药性标记及其插入失活选择法pBR322质粒上有两个抗生素抗性基因质粒上有两个抗生素抗性基因:Tetr和和Ampr。Tetr上有插入位点上有插入位点BamH I和和Sal I;Ampr上有插入位点上有插入位点Pst I。一、利用载体提供的表型特征筛选重组体一、利用载体提供的表型特征筛选重组体原理：原理：8.18.1 遗传学检测法遗传学检测法pBR322外源外源DN
5、ApBR3224363PstI酶切酶切PstI酶切酶切黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端连接酶连接酶重组子重组子(ampstetr)空载体空载体(amprtetr)插入子插入子(ampstets)野生型的野生型的E.coli(ampstets)导导入入涂布在含涂布在含Tc的平板上的平板上重组子转化子重组子转化子(ampstetr)空载体空载体转化子转化子(amprtetr)影印在含影印在含Ap的平板上的平板上空载体空载体转化子转化子(amprtetr)因插入外源因插入外源DNA而导致基因失活的现象称之为而导致基因失活的现象称之为插入失活效应插入失活效应。对比两个平板上的菌落，凡在对比两个平板上的
6、菌落，凡在Tc平板上生长而在平板上生长而在Ap平板上不能生长的菌落则是平板上不能生长的菌落则是重组质粒转化子克隆，挑选阳性克隆，分离出重组质粒。重组质粒转化子克隆，挑选阳性克隆，分离出重组质粒。（1）四环素抗性基因）四环素抗性基因 Tetr：（2）氨苄青霉素抗性基因）氨苄青霉素抗性基因 Ampr：pBR322抗菌素标记选择抗菌素标记选择产生产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘霉酮酸，使碘-青霉素指示液（青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。）（蓝灰色）褪色。抑制细菌生长，但不杀死细菌。抑制细菌生长，但不杀死细菌。杀死生长的细
7、菌，但不杀死停止生长的细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。（3）环丝氨酸：）环丝氨酸：选择过程：选择过程：如果在如果在Tetr上插入外源上插入外源DNA，导致四，导致四环素抗性基因失活，可用环素抗性基因失活，可用四环素加环四环素加环丝氨酸丝氨酸平板培养基选择重组克隆。平板培养基选择重组克隆。Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；丝氨酸杀死，保留下来；Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。反而被环丝氨酸杀死。（1）四环素抗性插入失活）四环素抗性插入失活无环丝氨酸培养基无环丝氨酸
8、培养基氨苄青霉素抗性插入失活选择过程氨苄青霉素抗性插入失活选择过程如果如果Ampr上插入外源上插入外源DNA，导致氨苄，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素青霉素指示液选择。指示液选择。2.蓝白斑筛选蓝白斑筛选法法-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 乳糖乳糖半乳糖半乳糖葡萄糖葡萄糖Xgal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛蓝氯靛蓝+深蓝色深蓝色原理：原理：载体载体上有一段上有一段 -半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（Lac ZLac Z）的）的）的）的 片段片段片段片段（氨基端），其上有外源（氨基端），其上有外源（氨基端），其上有外源（氨基端），其
9、上有外源DNADNA的插入位点。的插入位点。的插入位点。的插入位点。受体菌受体菌受体菌受体菌基因组基因组基因组基因组中有突变的中有突变的中有突变的中有突变的 -半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（片段缺失）。片段缺失）。片段缺失）。片段缺失）。可以被可以被可以被可以被IPTGIPTG诱导表达。诱导表达。诱导表达。诱导表达。载体和受体菌基因组可以载体和受体菌基因组可以载体和受体菌基因组可以载体和受体菌基因组可以互互互互补补补补形成完整有功能的形成完整有功能的形成完整有功能的形成完整有功能的 -半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。假阳性：假阳性：如果插入的外
10、源如果插入的外源DNA正好是正好是3的倍数并且没有的倍数并且没有中止密码；（不破坏中止密码；（不破坏 肽）。肽）。选择过程选择过程-半乳糖苷酶显色反应筛选法半乳糖苷酶显色反应筛选法-半乳糖苷酶使半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。分解成兰色产物。蓝白菌落蓝白菌落筛选白色菌落筛选白色菌落3.噬菌斑筛选噬菌斑筛选法法噬菌斑(plaque)噬菌斑是指在噬菌斑是指在宿主细菌的菌宿主细菌的菌苔上，噬菌体苔上，噬菌体使菌体裂解而使菌体裂解而形成的空斑。形成的空斑。筛选植物转化细胞常用的报告基因筛选植物转化细胞常用的报告基因筛选植物转化细胞常用的报告基因筛选植物转化细胞常用的报告基因n n报告基因（报告基因
11、（报告基因（报告基因（reporter genereporter gene）：系指其编码产物能够：系指其编码产物能够：系指其编码产物能够：系指其编码产物能够被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表达功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表达功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表达功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。活性的一类特殊用途的基因。活性的一类特殊用途的基因。活性的一类特殊用途的基因。4.
12、载体提供选择动植物转化细胞常用的标记基因载体提供选择动植物转化细胞常用的标记基因（1 1）大大肠肠杆菌的杆菌的-D-葡萄糖苷酸酶葡萄糖苷酸酶 （-D-glucuronidase，GUS）；）；（2 2）细菌和萤火虫的荧光素酶细菌和萤火虫的荧光素酶 （luciferase）；）；（3 3）水母绿色荧光蛋白（水母绿色荧光蛋白（GFP）基因）基因 （Green Fluorescent Protein）。）。报道基因（报道基因（reporter gene)（4 4）其它）其它几种报道基因的作用原理几种报道基因的作用原理4-甲甲-D-葡萄糖苷酸葡萄糖苷酸荧光产物荧光产物GUSGFP紫外光照紫外光照发绿色
13、荧光发绿色荧光5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-葡萄糖醛酸葡萄糖醛酸蓝色水解产物蓝色水解产物GUSFireflies emit light catalyzed by luciferase with ATP转入萤火虫转入萤火虫的的luciferase的烟草的烟草GFP-Kac的狗GFP 老鼠GFP Alba發青綠光芒的兔子n n新霉素磷酸转移酶基因（新霉素磷酸转移酶基因（新霉素磷酸转移酶基因（新霉素磷酸转移酶基因（NPTNPTNPTNPT）抗新霉素、卡抗新霉素、卡抗新霉素、卡抗新霉素、卡那霉素、庆大霉素和那霉素、庆大霉素和那霉素、庆大霉素和那霉素、庆大霉素和G418G418G418G418等
14、抗生素，成为筛选动等抗生素，成为筛选动等抗生素，成为筛选动等抗生素，成为筛选动植物转化子的选择标记基因。植物转化子的选择标记基因。植物转化子的选择标记基因。植物转化子的选择标记基因。n n潮霉素磷酸转移酶基因（潮霉素磷酸转移酶基因（潮霉素磷酸转移酶基因（潮霉素磷酸转移酶基因（HPTHPTHPTHPT）赋予转化子能抗赋予转化子能抗赋予转化子能抗赋予转化子能抗潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植物潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植物潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植物潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植物转化子。转化子。转化子。转化子。潮霉素是致癌物质潮霉素是致癌物质潮霉素是致
15、癌物质潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。，操作时应慎重。，操作时应慎重。，操作时应慎重。n n氯霉素乙酰转移酶基因（氯霉素乙酰转移酶基因（氯霉素乙酰转移酶基因（氯霉素乙酰转移酶基因（CATCATCATCAT）也被用于筛选动也被用于筛选动也被用于筛选动也被用于筛选动植物转化子的标记基因。植物转化子的标记基因。植物转化子的标记基因。植物转化子的标记基因。-葡萄糖酸酶基因（葡萄糖酸酶基因（葡萄糖酸酶基因（葡萄糖酸酶基因（GUSGUSGUSGUS）n nGUSGUSGUSGUS的基因产物的基因产物的基因产物的基因产物-葡萄糖酸酶葡萄糖酸酶葡萄糖酸酶葡萄糖酸酶（GUSGUSGUSGUS）能够催化）能够催化
16、）能够催化）能够催化4-4-4-4-甲基伞形花酮甲基伞形花酮甲基伞形花酮甲基伞形花酮-D-D-D-D-葡萄糖苷酸，产生葡萄糖苷酸，产生葡萄糖苷酸，产生葡萄糖苷酸，产生荧光物质荧光物质荧光物质荧光物质4-4-4-4-甲基伞形花酮，以此筛选含甲基伞形花酮，以此筛选含甲基伞形花酮，以此筛选含甲基伞形花酮，以此筛选含GUSGUSGUSGUS基因的转化子。基因的转化子。基因的转化子。基因的转化子。n n由于植物细胞由于植物细胞由于植物细胞由于植物细胞GUSGUSGUSGUS本底非常低，因此广泛地应用于本底非常低，因此广泛地应用于本底非常低，因此广泛地应用于本底非常低，因此广泛地应用于筛选植物转化子。筛选
17、植物转化子。筛选植物转化子。筛选植物转化子。n n尤其是尤其是尤其是尤其是GUSGUSGUSGUS基因的基因的基因的基因的3 3 3 3 端与其他结构基因连接产生端与其他结构基因连接产生端与其他结构基因连接产生端与其他结构基因连接产生的嵌合基因仍能正常表达，产生的融合蛋白中仍的嵌合基因仍能正常表达，产生的融合蛋白中仍的嵌合基因仍能正常表达，产生的融合蛋白中仍的嵌合基因仍能正常表达，产生的融合蛋白中仍有有有有GUSGUSGUSGUS活性，可用于外源基因在转化生物体中的定活性，可用于外源基因在转化生物体中的定活性，可用于外源基因在转化生物体中的定活性，可用于外源基因在转化生物体中的定位分析。位分析
18、。位分析。位分析。萤火虫荧光素酶基因（萤火虫荧光素酶基因（萤火虫荧光素酶基因（萤火虫荧光素酶基因（LUCLUCLUCLUC）n nLUCLUCLUCLUC表达产物萤火虫荧光素酶（表达产物萤火虫荧光素酶（表达产物萤火虫荧光素酶（表达产物萤火虫荧光素酶（LUCLUCLUCLUC）在）在）在）在MgMgMgMg2+2+2+2+的作用的作用的作用的作用下，下，下，下，可以与荧光素和可以与荧光素和可以与荧光素和可以与荧光素和ATPATPATPATP底物发生反应，底物发生反应，底物发生反应，底物发生反应，形成形成形成形成与酶与酶与酶与酶结合的结合的结合的结合的腺苷酸荧光素酰化复合物，腺苷酸荧光素酰化复合物
19、，腺苷酸荧光素酰化复合物，腺苷酸荧光素酰化复合物，经过氧化脱羧经过氧化脱羧经过氧化脱羧经过氧化脱羧作用后，作用后，作用后，作用后，该复合物转变成为处于激活状态的氧化该复合物转变成为处于激活状态的氧化该复合物转变成为处于激活状态的氧化该复合物转变成为处于激活状态的氧化荧光素，可以用荧光测定仪快速灵敏地检测出产荧光素，可以用荧光测定仪快速灵敏地检测出产荧光素，可以用荧光测定仪快速灵敏地检测出产荧光素，可以用荧光测定仪快速灵敏地检测出产生的荧光，是目前研究动植物转基因很好用的一生的荧光，是目前研究动植物转基因很好用的一生的荧光，是目前研究动植物转基因很好用的一生的荧光，是目前研究动植物转基因很好用的
20、一种报告基因。种报告基因。种报告基因。种报告基因。n nLucLucLucLuc基因检测十分迅速，灵敏度高，成本低，不存基因检测十分迅速，灵敏度高，成本低，不存基因检测十分迅速，灵敏度高，成本低，不存基因检测十分迅速，灵敏度高，成本低，不存在放射性同位素检测对人体健康和环境生态所造在放射性同位素检测对人体健康和环境生态所造在放射性同位素检测对人体健康和环境生态所造在放射性同位素检测对人体健康和环境生态所造成的危害，也没有内源荧光产生的背景干扰，因成的危害，也没有内源荧光产生的背景干扰，因成的危害，也没有内源荧光产生的背景干扰，因成的危害，也没有内源荧光产生的背景干扰，因此，此，此，此，LucL
21、ucLucLuc是一种理想的报告基因。是一种理想的报告基因。是一种理想的报告基因。是一种理想的报告基因。抗除草剂抗除草剂抗除草剂抗除草剂barbarbarbar基因基因基因基因n nbarbarbarbar基因编码基因编码基因编码基因编码磷化乙酰转移酶磷化乙酰转移酶磷化乙酰转移酶磷化乙酰转移酶（PATPATPATPAT），使转化子），使转化子），使转化子），使转化子对含有磷化麦黄酮（对含有磷化麦黄酮（对含有磷化麦黄酮（对含有磷化麦黄酮（PPTPPTPPTPPT）成分的除草剂具有抗性。）成分的除草剂具有抗性。）成分的除草剂具有抗性。）成分的除草剂具有抗性。冠瘿碱合成酶基因冠瘿碱合成酶基因冠瘿碱合
22、成酶基因冠瘿碱合成酶基因n n主要包括主要包括主要包括主要包括胭脂碱合成酶基因胭脂碱合成酶基因胭脂碱合成酶基因胭脂碱合成酶基因和和和和章鱼碱合成基因章鱼碱合成基因章鱼碱合成基因章鱼碱合成基因两两两两类，存在于土壤农杆菌类，存在于土壤农杆菌类，存在于土壤农杆菌类，存在于土壤农杆菌TiTiTiTi质粒的质粒的质粒的质粒的T-DNAT-DNAT-DNAT-DNA区段。区段。区段。区段。n n冠冠冠冠瘿瘿瘿瘿碱合成酶基因在植物细胞中的表达产物可以碱合成酶基因在植物细胞中的表达产物可以碱合成酶基因在植物细胞中的表达产物可以碱合成酶基因在植物细胞中的表达产物可以催化一些特殊反应，通过催化一些特殊反应，通过
23、催化一些特殊反应，通过催化一些特殊反应，通过电泳分离电泳分离电泳分离电泳分离及及及及菲醌荧光染菲醌荧光染菲醌荧光染菲醌荧光染料染色料染色料染色料染色，方便地观察，据此作为报告基因用于转，方便地观察，据此作为报告基因用于转，方便地观察，据此作为报告基因用于转，方便地观察，据此作为报告基因用于转植物基因细胞的筛选。植物基因细胞的筛选。植物基因细胞的筛选。植物基因细胞的筛选。n n冠冠冠冠瘿瘿瘿瘿碱合成酶基因在植物基因工程早期应用较多，碱合成酶基因在植物基因工程早期应用较多，碱合成酶基因在植物基因工程早期应用较多，碱合成酶基因在植物基因工程早期应用较多，现已逐渐被其他更为理想的报告基因所取代。现已逐
24、渐被其他更为理想的报告基因所取代。现已逐渐被其他更为理想的报告基因所取代。现已逐渐被其他更为理想的报告基因所取代。n n在植物转基因研究中采用的氯霉素乙酰转移酶在植物转基因研究中采用的氯霉素乙酰转移酶在植物转基因研究中采用的氯霉素乙酰转移酶在植物转基因研究中采用的氯霉素乙酰转移酶(CatCatCatCat)基因和新霉素磷酸转移酶基因和新霉素磷酸转移酶基因和新霉素磷酸转移酶基因和新霉素磷酸转移酶(NptNptNptNpt)基因也可用于哺乳基因也可用于哺乳基因也可用于哺乳基因也可用于哺乳动物转基因细胞的筛选。动物转基因细胞的筛选。动物转基因细胞的筛选。动物转基因细胞的筛选。n n常用的标记基因还有
25、：常用的标记基因还有：常用的标记基因还有：常用的标记基因还有：n n-胸腺核苷激酶基因（胸腺核苷激酶基因（胸腺核苷激酶基因（胸腺核苷激酶基因（TKTKTKTK）n n-二氢叶酸还原酶基因（二氢叶酸还原酶基因（二氢叶酸还原酶基因（二氢叶酸还原酶基因（DHFRDHFRDHFRDHFR）n n-黄嘌呤黄嘌呤黄嘌呤黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（XGPRTXGPRTXGPRTXGPRT）筛选哺乳动物转基因细胞常用的报告基因筛选哺乳动物转基因细胞常用的报告基因筛选哺乳动物转基因细胞常用的报告基因筛选哺乳动物转基因细胞常用的报
26、告基因真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。提供甲基。二氢叶酸二氢叶酸四氢叶酸四氢叶酸二氢叶酸还原酶（二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）胸苷激酶（胸苷激酶（thymidine kinase,tk）（1）TK选择原理选择原理四氢叶酸的必要性四氢叶酸的必要性DHFRn n胸腺核苷激酶基因（胸腺核苷激酶基因（胸腺核苷激酶基因（胸腺核苷激酶基因（tktktktk）、二氢叶酸还原酶基因（）、二氢叶酸还原酶基因（）、二氢叶酸还原酶基因（）、二氢叶酸还原酶基因（dhfrdhfrdhfrdhfr）及次黄嘌呤及次黄嘌呤及次黄嘌呤及次黄嘌
27、呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（hgprthgprthgprthgprt）等的）等的）等的）等的表表表表达产物直接或间接参与核苷酸合成代谢。达产物直接或间接参与核苷酸合成代谢。达产物直接或间接参与核苷酸合成代谢。达产物直接或间接参与核苷酸合成代谢。n n这些基因缺失的缺陷型细胞因核苷酸合成代谢失调而死亡，这些基因缺失的缺陷型细胞因核苷酸合成代谢失调而死亡，这些基因缺失的缺陷型细胞因核苷酸合成代谢失调而死亡，这些基因缺失的缺陷型细胞因核苷酸合成代谢失调而死亡，只有在添加某些核苷酸的培养基中才能生长。如果用这样只有在添加某
28、些核苷酸的培养基中才能生长。如果用这样只有在添加某些核苷酸的培养基中才能生长。如果用这样只有在添加某些核苷酸的培养基中才能生长。如果用这样的的的的缺陷型细胞作为受体细胞缺陷型细胞作为受体细胞缺陷型细胞作为受体细胞缺陷型细胞作为受体细胞，导入含有这些基因的外源，导入含有这些基因的外源，导入含有这些基因的外源，导入含有这些基因的外源DNADNADNADNA，补充原来缺失的基因，使核苷酸合成代谢恢复正常，补充原来缺失的基因，使核苷酸合成代谢恢复正常，补充原来缺失的基因，使核苷酸合成代谢恢复正常，补充原来缺失的基因，使核苷酸合成代谢恢复正常，可以在不添加核苷酸的培养基中正常生长可以在不添加核苷酸的培养
29、基中正常生长可以在不添加核苷酸的培养基中正常生长可以在不添加核苷酸的培养基中正常生长。n n根据这一性质可以在根据这一性质可以在根据这一性质可以在根据这一性质可以在不添加核苷酸的培养基中筛选出转化不添加核苷酸的培养基中筛选出转化不添加核苷酸的培养基中筛选出转化不添加核苷酸的培养基中筛选出转化子。子。子。子。利用插入的外源基因的利用插入的外源基因的表达产物表达产物特性进行直特性进行直接选择。（只在特定条件下）。接选择。（只在特定条件下）。转化进来的外源基因产物能够弥补受转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。体菌株的突变型缺陷。一、原理：一、原理：二、利用插入序列提供的表型特征筛选二
30、、利用插入序列提供的表型特征筛选1.弥补缺陷弥补缺陷his-his+受体菌：受体菌：外源基因：外源基因：在不含组氨酸的在不含组氨酸的培养基中生长培养基中生长小鼠的二氢叶酸还原酶（小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。苄二氨嘧啶有抗性。DHFR载体载体连接连接转化受转化受体菌体菌三甲氧苄二氨嘧三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板啶培养基平板含含DHFR的克隆才能生长的克隆才能生长例：例：使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。2.增加新性状增加新性状利用有插入片段的重组载体的分子量比利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。野生
31、型载体分子量大。一、直接电泳检测法一、直接电泳检测法从转化后的菌体克隆从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、中分离质粒，电泳、比较其分子量。比较其分子量。8.2 DNA电泳检测法电泳检测法 分子量分子量 Marker载体重重组组克克隆隆二、酶切电泳筛选法二、酶切电泳筛选法-物理检测法物理检测法1.原理：原理：根据根据已知的外源已知的外源DNA序列的限制性酶切序列的限制性酶切图谱图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。带数和长度）。或用合适的内切酶切下插入片断，再用或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电
32、泳后比较结果是其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。否符合预计的结果。ABA或或B三、三、PCR扩增检测法扩增检测法1.原理原理PCR能在模板序列上扩增出预期能在模板序列上扩增出预期DNA片断。片断。2.过程过程（1）从重组克隆中提取质粒（或）从重组克隆中提取质粒（或DNA）（2）用外源）用外源DNA插入片断引物作插入片断引物作PCR（3）电泳）电泳PCR产物产物（4）检查是否有）检查是否有PCR产物产物（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致产物的长度是否与外源基因一致1.核酸杂交核酸杂交8.3 核酸分子杂交检测核酸分子杂交检测 一、原理：一、原理：重组克隆与探针杂交重组克隆与
33、探针杂交3.识别标记识别标记32P 或或 125I。（1）放射性同位素）放射性同位素2.检测用的探针检测用的探针与外源与外源DNA插入片断互补的序列插入片断互补的序列（2）非放射性标记）非放射性标记荧光素、生物素荧光素、生物素地高辛地高辛二、核酸杂交检测方法二、核酸杂交检测方法用用DNA（或（或RNA）探针检测）探针检测DNA样品。样品。1.Southern blotting从宿主细胞中提取从宿主细胞中提取DNA（或质粒载（或质粒载体），再用探针杂交。体），再用探针杂交。只有带有插入片断的重组载体才能只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。与探针杂交，在底片上曝光显示。So
34、uthernBlottingDNA分子分子限制片段限制片段限制性酶切割限制性酶切割琼脂糖电泳琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜上转移至硝酸纤维素膜上与放射性标记与放射性标记DNA探针杂交探针杂交放射自显影放射自显影带有带有DNA片片段的凝胶段的凝胶凝胶凝胶滤膜滤膜用缓冲液用缓冲液转移转移DNA吸附有吸附有DNA片段的膜片段的膜-+Southern blot探针探针探针探针（1）原位杂交筛选）原位杂交筛选特点：特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。可以直接找出阳性菌落。原位杂交筛选原位杂交筛选DNA重组体重组体图解图解复印至硝酸复印至硝酸纤维素膜上纤维素膜
35、上用用NaOH菌体裂解菌体裂解DNA变性变性杂交杂交放射自显影放射自显影32P-cDNA与放射性与放射性cDNA杂杂交的菌落的斑点交的菌落的斑点细菌菌落细菌菌落单链单链DNA结结合到膜上合到膜上（2）R-环检测法环检测法DNA-RNA杂交杂交1）原理：）原理：2）选择过程）选择过程在在70%甲酰胺中，把甲酰胺中，把DNA双链变性，复双链变性，复性的时候，性的时候，DNA-RNA杂交分子比杂交分子比DNA-DNA双链更稳定。电镜下可见一种双链更稳定。电镜下可见一种R-环环形结构。形结构。用外源基因的用外源基因的mRNA与重组载体杂交。与重组载体杂交。缺点：需要电镜！缺点：需要电镜！2.North
36、ern blotting用用DNA（或（或RNA）探针检测）探针检测RNA样品。样品。主要检测插入片主要检测插入片断是否被转录。断是否被转录。从宿主细胞中提从宿主细胞中提取取RNA，再用探，再用探针杂交。针杂交。Northern BlottingWestern Blotting Southern和和Western印迹法印迹法DNA frangmentElectrophoresisTransfer of DNA by blotting32P-labled DNA probeAutoradiographyAgarrose gelAutoradiogramNitrocellulose sheetAu
37、toradiogramPolymer sheetSDS-Polyacrylamide gelTransfer proteinAdd radiolabled spesfic antibody,Wash to remove unboud antibodyProtein band detected by specific antibodyAutoradiography利用抗体作为利用抗体作为“探针探针”来检测转入受体菌来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。并且表达出相应的蛋白质的外源基因。根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式
38、：的性质可分为几种作用方式：一、放射免疫测定法一、放射免疫测定法8.4 免疫化学类检测法免疫化学类检测法 1.抗体与产物的结合方式抗体与产物的结合方式对表达产物的检测。对表达产物的检测。蛋白蛋白蛋白蛋白“杂交杂交”待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗二抗二抗125I 标记的二标记的二 抗结合蛋白抗结合蛋白固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗125I标记的二抗标记的二抗固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗固相支固相支持滤膜持滤膜固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗 二抗二抗125I 标记的二抗标记的二
39、抗 结合蛋白结合蛋白125I标记的二抗标记的二抗2.放射免疫测定法过程放射免疫测定法过程细菌菌落溶解，释放出抗原蛋白质细菌菌落溶解，释放出抗原蛋白质免疫化学法检测克隆在载体免疫化学法检测克隆在载体pUC8上的小鸡原肌球蛋白基因上的小鸡原肌球蛋白基因滤膜抗体溶液放射性标记抗体检测法的操作程序聚乙烯薄膜培养皿及菌落放射性标记抗体检测法的操作程序3.Broome-Gilbert双定位检测法双定位检测法质粒基因质粒基因A插入基因插入基因B表达表达质粒蛋白质粒蛋白A 外源蛋白外源蛋白B融合蛋白融合蛋白检测融合蛋白检测融合蛋白既检测外源基因产物又检测载体基因产物既检测外源基因产物又检测载体基因产物固相支固
40、相支 持滤膜持滤膜抗抗A抗体抗体125I标记的标记的 抗抗B抗体抗体质粒蛋白质粒蛋白A 外源蛋白外源蛋白B质粒蛋白质粒蛋白A外源蛋白外源蛋白B固相支固相支 持滤膜持滤膜抗抗A抗体抗体发光，底片曝光发光，底片曝光二、免疫沉淀检测法二、免疫沉淀检测法把非放射性抗体加到平板培养基中，把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈沉淀圈”(白色圆圈白色圆圈)。1.原理原理抗原抗原抗体凝集反应。抗体凝集反应。检测分泌型产物。检测分泌型产物。2.方法方法对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进
41、行对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。三、酶联免疫吸附测定（三、酶联免疫吸附测定（ELISA）Enzyme-linked immunosorbant assay1.原理：原理：一抗（一抗（primary antibody）:与目标分子的特异结合。与目标分子的特异结合。二抗（二抗（secondary antibody）：）：与一抗的特异性结合。与一抗的特异性结合。酶连（酶连（enzyme-linke）：二抗上携带一种酶二抗上携带一种酶能催化一种反应将无能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再色的底物转变
42、为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。从而推测目标分子的含量。待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗二抗二抗酶酶 待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗 二抗二抗无色的底物无色的底物有色的产物有色的产物比色观察比色观察酶酶 192.ELISA检测的一般步骤检测的一般步骤（1）固定样品）固定样品将待测样品加入将待测样品加入96孔微量滴定板孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后）的孔中，干燥后就被固定在就被固定在孔底孔底。孔底孔底加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。加入一抗，
43、反应后冲洗掉未结合的抗体。（2）一抗结合）一抗结合一抗一抗加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。抗冲洗掉。二抗只识别一抗。二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。酶、脲酶等）。（3）二抗结合）二抗结合二抗二抗加入无色的底物，被二抗上所带的酶催加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。化反应转变成有色物质（或发光）。（4）显色反应）显色反应在特殊的分光光度仪（在特殊的分光光度仪（酶标仪酶标仪）上比色，打）上比色，打印出结果。印出结果。（5）比色）比色3.ELISA
44、的局限性的局限性有效，但准确性稍差（有效，但准确性稍差（主要取决于一抗主要取决于一抗的特异性的特异性）。）。必须与其他方法一起综合考虑。必须与其他方法一起综合考虑。无细胞翻译系统无细胞翻译系统8.5 转译筛选法转译筛选法 能把外源的能把外源的mRNA翻译成蛋白质的细胞提翻译成蛋白质的细胞提取物。取物。如：如：麦胚提取物系统麦胚提取物系统、网织红细胞网织红细胞提取物系统提取物系统。借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选其产物是否符合预期。其产物是否符合预期。要求：要求：被研究的目的基
45、因编码有丰富的被研究的目的基因编码有丰富的mRNA mRNA。DNADNA蛋白质蛋白质mRNAmRNA蛋白质蛋白质杂交杂交原理：原理：步骤：步骤：转化菌落转化菌落提取重组提取重组DNADNA与与mRNAmRNA总杂交总杂交形成形成DNA-RNADNA-RNA杂种分子杂种分子将总将总mRNAmRNA（包括（包括DNA-RNADNA-RNA分子分子提取出来提取出来体外转译体外转译蛋白电泳放射自显影蛋白电泳放射自显影 （1）总总mRNAmRNA体外转译体外转译蛋白电泳放射自显影蛋白电泳放射自显影 （2）经对比，（经对比，（1）比）比（2）中少了一种蛋）中少了一种蛋白质白质找到一种转译作用找到一种转译作用被抑制了的被抑制了的mRNA 筛选出重组菌落筛选出重组菌落（或噬菌斑）（或噬菌斑）1.杂交抑制的转译杂交抑制的转译 敏感；适于研究目的基因编码低丰度的敏感；适于研究目的基因编码低丰度的mRNAmRNA重组体库重组体库提取提取DNA固定在固定在NC膜上膜上与与mRNA或总或总RNA杂交杂交目的基因与对应的目的基因与对应的mRNA杂杂交，交，mRNA固定在固定在NC膜上膜上将杂交分离的将杂交分离的mRNA进行体外进行体外转译转译凝胶电泳或生物活性检测凝胶电泳或生物活性检测找出单菌落重组体找出单菌落重组体2.杂交释放的转译杂交释放的转译 一般克隆与筛选策略一般克隆与筛选策略