《重组体的筛选与鉴定.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《重组体的筛选与鉴定.ppt（77页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、第六章第六章 重组体的筛选与鉴定重组体的筛选与鉴定转化子：转化子：在在DNA分子克隆中，通常将导分子克隆中，通常将导入外源入外源DNA分子后能稳定存在的受体分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子；细胞称为转化子；重组子：重组子：含有重组含有重组DNA分子的转化子；分子的转化子；期望重组子（目的重组子）：期望重组子（目的重组子）：含有外源含有外源目的基因的重组子。目的基因的重组子。*为什么要进行筛选和鉴定？（1）不带任何外源DNA插入片段，仅由线形载体分子自身连接形成的环状分子；（2）由一个载体分子和数个外源DNA片段组成的重组分子；（3）单纯由数个外源DNA片段连接而成的多聚DNA分子；转化后的
2、克隆群体：*鉴定的方法有哪些？载体表型选择法根据插入序列的表型特征选择DNA电泳检测法核酸杂交检测法免疫化学检测法转译筛选法第一节、载体表型选择法第一节、载体表型选择法根据载体所携带的标记基因的表型根据载体所携带的标记基因的表型进行选择。进行选择。一、抗药性标记插入失活选择法一、抗药性标记插入失活选择法二、二、-半乳糖苷酶显色反应选择法半乳糖苷酶显色反应选择法一、抗药性标记插入失活选择法一、抗药性标记插入失活选择法 插入效应插入效应:外源外源DNA片段与载体特定片段与载体特定部位连接后，使载体的相关功能发生部位连接后，使载体的相关功能发生改变，为重组子的筛选提供信息。改变，为重组子的筛选提供信
3、息。插入失活插入失活 插入表达插入表达 抗药性插入失活抗药性插入失活指的是外源指的是外源DNA插插入载体的抗药性筛选标记中，导致入载体的抗药性筛选标记中，导致该基因结构破坏而失活，使细胞丧该基因结构破坏而失活，使细胞丧失对抗生素抗性的功能。失对抗生素抗性的功能。transfer of colonies+ampicillin+ampicillin+tetracycline这些克隆是有重组质粒的细菌lacZAmN2H 片段片段COOHCOOH 片段片段二、二、-半乳糖苷酶显色反应选择法半乳糖苷酶显色反应选择法 在在LacZ体体系系中中，两两个个彼彼此此互互补补的的突突变变基基因因各各自自编编码码产
4、产生生的的多多肽肽产产物物均均无无活活性性，但但两两个个突突变变体体间间通通过过肽肽互互补补作作用用可可呈呈现现有有功功能能的的-半半乳乳糖糖苷苷酶酶活活性性，进进而而可可分分解解底底物物X-gal（5-溴溴-4-氯氯-3-吲吲哚哚-D-半半乳乳糖糖苷苷）而而产产生生深深蓝蓝色色物物质，使菌落呈现蓝色。质，使菌落呈现蓝色。当当外外源源基基因因DNA片片段段插插入入载载体体中中LacZ 肽肽区区段段的的多多克克隆隆位位点点后后，会会阻阻断断序序列列的的读读码码结结构构，使使其其编编码码的的肽肽失失去去活活性性，使使重重组组子子所所在在的的细细菌菌不不能能完完成成-互互补补而而形形成成白白色色菌菌
5、落落。根根据据这这种种-半半乳乳糖糖苷苷酶酶的的显显色色反反应应，可可以以检检测测和和筛筛选选出出携携有有外外源源基基因因重重组组子子克隆。此法又称蓝白筛选法。克隆。此法又称蓝白筛选法。X-galLac Z蓝色化合物蓝色化合物X-gal第二节、根据插入序列的表型特征选择第二节、根据插入序列的表型特征选择根据克隆片段为寄主提供的新的表型特征选择重组体DNA分子 例如：亮氨酸（Leu)缺陷菌在无Leu培养基中不生长,当含Leu外源基因在此缺陷菌中表达时可生长，以此来筛选阳性克隆。*局限性：克隆的DNA片断是一个完整的基因序列 能在原核生物中实现功能表达 第三节、第三节、DNA电泳检测法电泳检测法一
6、、直接电泳检测法二、酶切电泳筛选法三、PCR扩增检测法一、直接电泳检测法一、直接电泳检测法菌落菌落 提取质粒提取质粒 单酶切单酶切 电泳电泳适于插入片段较大的重组子初筛适于插入片段较大的重组子初筛二、酶切电泳筛选法二、酶切电泳筛选法 经初筛鉴定有重组子的菌落，小量培养后，再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的内切酶切割，释放出插入片断。三、三、PCR扩增检测法扩增检测法 利用外源DNA插入位点两侧存在的特定序列设计引物，对外源DNA进行PCR分析。电泳检测法凝胶电泳检测加样孔DNA MarkerDNA Marker空质粒空质粒重组质粒重组质粒 重组质粒酶切重组质粒酶切重组质粒的重组质粒的
7、PCRPCR扩增片段扩增片段第四节、核酸杂交检测法第四节、核酸杂交检测法 一、原理一、原理 具有一定同源性的两条核酸单链具有一定同源性的两条核酸单链（DNA或或RNA）在适宜的温度和离）在适宜的温度和离子强度等条件下，可按碱基互补配子强度等条件下，可按碱基互补配对原则高度特异的复性形成双链。对原则高度特异的复性形成双链。二、核酸杂交检测方法二、核酸杂交检测方法 1.核酸探针核酸探针 概念：核酸探针是指带有标记的与目概念：核酸探针是指带有标记的与目 的基因同源互补的一段核苷酸序列。的基因同源互补的一段核苷酸序列。大小：长度以大小：长度以50-300个碱基为宜个碱基为宜 种类：种类：DNADNA探
8、针、探针、C CDNADNA探针、探针、RNARNA探针探针2.2.探针标记物探针标记物 放射性标记物放射性标记物 常用的有常用的有32P、35S;非放射性标记物非放射性标记物 常用的有生物素、地高辛和荧光素等。常用的有生物素、地高辛和荧光素等。3.核酸杂交方法核酸杂交方法 液相杂交液相杂交 固相杂交固相杂交4杂交膜的选用杂交膜的选用 硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜:本底浅，与小片段核酸(200bp)结合不牢，质地脆，不易操作；尼龙膜尼龙膜:韧性好，耐用，结合力强，可与小至10 bp的片段共价结合。5.固相核酸杂交的主要过程：固相核酸杂交的主要过程：1）核酸的变性；）核酸的变性；2）变性核酸在膜上的
9、固定；）变性核酸在膜上的固定；3）预杂交；）预杂交；4）杂交；）杂交；5）洗膜；）洗膜；6）结果显示。）结果显示。1）菌落杂交或噬菌体杂交）菌落杂交或噬菌体杂交 把生长在培养基平板上的菌落或噬菌把生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑按照其原来的位置不变地转移到滤膜上，斑按照其原来的位置不变地转移到滤膜上，在原位发生溶菌、在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用，变性和杂交作用，以从成千上万的菌落或噬菌斑中鉴定出含以从成千上万的菌落或噬菌斑中鉴定出含有重组体分子的菌落或噬菌斑的方法。有重组体分子的菌落或噬菌斑的方法。*适于从基因文库中筛选目的基因适于从基因文库中筛选目的基因 6.几种常用固相核酸杂交方法
10、几种常用固相核酸杂交方法菌落杂交筛选法菌落杂交筛选法2）Southern杂交 提取总DNA 酶切 琼脂糖凝胶电泳 碱变性 转膜 固定 杂交 3）Northern印迹杂交 (Northern blot hybridization)：*不能采用碱变性法。*常采用甲醛、聚乙二醛、二甲基亚砜、甲基氢氧化汞等变性方法。4.斑点杂交(dot hybridization)：直接将变性DNA样品点于硝酸纤维素膜上，固定好后再进行杂交。（1）DNA斑点杂交（2）RNA斑点杂交（3）完整细胞斑点杂交Control样品标记探针浓度检测四类核酸分子杂交法的技术路线比较四类核酸分子杂交法的技术路线比较菌落原位杂交菌落原
11、位杂交菌落或噬菌斑转菌落或噬菌斑转印到膜上印到膜上抽提抽提DNA/RNA提取提取DNA提取提取RNA裂解细菌或噬菌斑裂解细菌或噬菌斑变性核酸样品变性核酸样品琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳变性变性DNA将核酸点加到膜上将核酸点加到膜上将凝胶上核酸变性，转将凝胶上核酸变性，转移到膜上移到膜上将核酸固定在膜上将核酸固定在膜上预杂交预杂交杂交杂交漂洗膜漂洗膜放射自放射自显影或显色反应示踪显影或显色反应示踪斑点杂交斑点杂交Southern印迹Northern印迹第五节、免疫化学检测法第五节、免疫化学检测法一、放射性抗体检测法二、免疫沉淀检测法三、酶联免疫吸附测定（ELISA）四、免疫印迹（western
12、blotting）法一、放射性抗体检测法一、放射性抗体检测法 1、原理：原理：一种抗原产生的免疫血清含有好几种一种抗原产生的免疫血清含有好几种IgG抗体，分别识别抗原分子上的不同定抗体，分别识别抗原分子上的不同定子（决定簇），并分别同各自识别的抗子（决定簇），并分别同各自识别的抗原定子相结合；原定子相结合；抗体分子能够十分牢固地吸附在固体抗体分子能够十分牢固地吸附在固体基质基质(如聚乙烯等塑料制品如聚乙烯等塑料制品)上，而不会上，而不会被洗脱掉；被洗脱掉；通过体外碘化作用，通过体外碘化作用，IgG抗体便会迅抗体便会迅速地被放射性同位素速地被放射性同位素125I标记上。标记上。2、放射性抗体检测
13、法的过程二、免疫沉淀检测法二、免疫沉淀检测法1.1.原理原理2.2.抗原抗原抗体凝集反应。抗体凝集反应。3.3.2.2.方法方法4.4.把非放射性抗体加到平板培养基中，当把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈沉淀圈”。菌落沉淀素免疫沉淀检测法免疫沉淀检测法3.缺点：缺点：只能检测分泌出细胞的蛋白质只能检测分泌出细胞的蛋白质改良：改良：采用采用cI857cI857溶原性大肠杆菌做受体细溶原性大肠杆菌做受体细胞；胞；将含有抗体和溶菌酶的琼脂小心倒在将含有抗体和溶菌酶的琼脂小心
14、倒在菌落上。菌落上。三、酶联免疫吸附测定（三、酶联免疫吸附测定（ELISA）（enzyme linked immunosorbent assay）固相的抗原或抗体；固相的抗原或抗体；酶标记的抗原或抗体；酶标记的抗原或抗体；酶作用的底物。酶作用的底物。1.1.原理：原理：一抗（一抗（primary antibody）:与目标分子的特异结合。与目标分子的特异结合。二抗（二抗（secondary antibody）：）：与一抗的特异性结合。与一抗的特异性结合。酶连（酶连（enzyme-linke）：二抗上携带一种酶二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光
15、），再通过的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。推测目标分子的含量。待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗二抗二抗酶酶 待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗 二抗二抗无色的底物无色的底物有色的产物有色的产物比色观察比色观察酶酶 2.ELISA检测的一般步骤（1）固定样品：将待测样品加入96孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。孔底孔底（2）一抗结合：加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。一抗一抗（3）二抗结合：加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二
16、抗冲洗掉。二抗只识别一抗。二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。酶、脲酶等）。二抗二抗（4）显色反应：加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。（5）比色：在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。四、免疫印迹法（四、免疫印迹法（western blotting）1、蛋白质的电泳分离、蛋白质的电泳分离-SDS-聚丙聚丙烯酰胺凝胶电泳烯酰胺凝胶电泳(SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)点样点样电泳方向电泳方向l凝胶中的蛋白质的染色：考马斯亮蓝：灵敏度底、只
17、能检出g/带，但可褪色回收。硝酸银：灵敏度高、可检出2-5ng/带。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳2、将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上转膜电转移常用的膜：硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等。Western装置3、免疫学检测原理与ELISA相同待测蛋白待测蛋白硝酸纤硝酸纤 维素膜维素膜一抗一抗 二抗二抗辣根过氧辣根过氧 化物酶化物酶底物底物产物产物(显色显色)PAGE胶胶待测蛋白待测蛋白辣根过氧化物酶：辣根过氧化物酶：HRPO第六节、转译筛选法第六节、转译筛选法一、无细胞翻译系统一、无细胞翻译系统 指保留蛋白质生物合成能力的细胞抽指保留蛋白质生物合成能力的细胞抽取物取物。用于蛋白质的生物合成
18、研究的体外翻用于蛋白质的生物合成研究的体外翻译系统主要有：译系统主要有：*大肠杆菌无细胞翻译系统大肠杆菌无细胞翻译系统 *兔网织红细胞无细胞翻译系统兔网织红细胞无细胞翻译系统 *麦胚无细胞翻译系统麦胚无细胞翻译系统 二、转译筛选二、转译筛选1、杂交抑制转译法、杂交抑制转译法 适用于筛选那些高丰度的适用于筛选那些高丰度的mRNA 2、杂交释放转译法、杂交释放转译法 可用于检出低丰度可用于检出低丰度mRNA1、杂交抑制转译法原理：mRNA一旦与DNA杂交成RNA-DNA双链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）。单链单链mRNA核糖体核糖体 小亚基小亚基核糖体核糖体 大亚基大亚基能翻译能翻译m
19、RNADNA核糖体核糖体 小亚基小亚基核糖体核糖体 大亚基大亚基不能翻译不能翻译过程过程2、杂交释放转译法原理：在高甲酰胺溶液中载体上克隆的cDNA与它的mRNA杂交吸附，然后洗脱，释放出与它对应的mRNA，进行体外转录。研究其转录产物的性质是否是预期的基因产物（如分子量、免疫原性等）。过程硝酸纤硝酸纤 维素滤膜维素滤膜载体和插载体和插 入的入的cDNA总总mRNAcDNA基因的基因的 mRNA杂交杂交洗脱洗脱cDNA基因的基因的 mRNA体外翻译体外翻译cDNA编编码的蛋白码的蛋白电泳电泳凝胶放射自显影凝胶放射自显影cDNA编编 码的蛋白码的蛋白硝酸纤硝酸纤 维素滤膜维素滤膜载体和插载体和插 入的入的cDNA硝酸纤硝酸纤 维素滤膜维素滤膜载体和插载体和插 入的入的cDNA收集收集35S标记的氨基酸标记的氨基酸三、DNA-蛋白质相互作用筛选法专门设计检测能同DNA特异结合的蛋白质因子。待测蛋白质待测蛋白质硝硝 酸酸 纤纤 维维 素素 滤滤 膜膜能与蛋白质结能与蛋白质结 合的合的DNA序列序列放射性标记放射性标记待测蛋白质待测蛋白质硝硝 酸酸 纤纤 维维 素素 滤滤 膜膜能与蛋白质结能与蛋白质结 合的合的DNA序列序列放射性标记放射性标记一般克隆与筛选策略