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1、关于基因的转移与重组关于基因的转移与重组体的筛选和鉴定体的筛选和鉴定第一页，讲稿共二十七页哦一、粘性末端的连接DNA连接酶把相互靠近的5端磷酸与3-OH连到一起单酶切、双酶切第一节 DNA的体外重组DNA的体外重组：将目的基因与载体连接，这种重新组合的DNA称为重组DNA。第二页，讲稿共二十七页哦（一）直接连接T4 DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的110%。5 5 5 5 3 3 3 3-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5 3-OH-PP-HO-5 3 二、平末端（blunt end）的连接第三页，讲稿共二十七页哦（1）同聚加尾法 （二）人工加尾形成“粘性末端”D
2、NA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3-OH端加上脱氧核苷酸。原理：分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。加尾碱基互补第四页，讲稿共二十七页哦缺点：优点：能把任何片段连接起来操作繁琐；外源片段难以回收；同聚物尾巴影响外源基因表达。非酶切位点第五页，讲稿共二十七页哦（2）衔接物（linker）连接Linker：用化学合成法合成的一段10-12bp的，具有一个或数个限制性内切酶识别位点的平末端双链寡核苷酸GGAATTCC CCTTAAGGEcoR I linker：（二）人工加尾形成“粘性末端”第六页，讲稿共二十七页哦（1）多核苷酸激酶处理（2）T4连接酶连接（3）限制性内切酶消化（4）目
3、的片段与载体连接第七页，讲稿共二十七页哦（二）人工加尾形成“粘性末端”DNA接头（adapter）连接法 adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 3HO-GGCC-p5 BamHI adapterP-P5p-GATCCCGG-GGCC-CCGG-GGCCCTAG-P5 第八页，讲稿共二十七页哦接头与接头以粘末端连接，影响与DNA片段的连接 优点：连上后就能用。缺点：先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5端的磷酸，防止自我连接。防止自我连接5p-GATCCCGG-GGCC-CCGG GGCCCTAG-p
4、5 第九页，讲稿共二十七页哦Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-3 GGCC-p5 BamHI adapterP-P 5HO-GATCCCGG-GGCC CCGG-GGCCCTAG-OH5 5HO-GATCCCGG3 GGCC-OH5 nick缺口nick缺口HO-OHCIP处理T4 ligase虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接T4多核苷酸激酶处理使5磷酸化第十页，讲稿共二十七页哦三、PCR产物的连接1.在引物的5端设计酶切位点符合载体的多克隆位点；（1）设计原则（2）带酶切位点的引物的结构3端1520bp与模板互补；5端内切酶识别序列保护碱基避免与所扩增的DNA片断内部
5、酶切位点重复。第十一页，讲稿共二十七页哦带酶切位点的PCR产物GCAGAATTC PCR产物5-3 CCTAGGCGC PCR产物-5 3-CGTCTTAAGGGATCCGCGEcoR I位点BamH I位点AATTC PCR产物5-3 CCTAG PCR产物-5 3-GGEcoR IBamH I两头各有一个粘性末端！第十二页，讲稿共二十七页哦AAdNTPTTdTTPTaq DNA聚合酶载体PCR产物TATA三、PCR产物的连接2.与T载体直接连接第十三页，讲稿共二十七页哦第二节 重组体导入受体细胞一、重组DNA导入大肠杆菌（一）转化（transformation）大肠杆菌捕获质粒DNA的过程
6、。（三）转染（transfection）受体菌直接捕获噬菌体DNA的过程。（二）转导（transduction）借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。第十四页，讲稿共二十七页哦（一）导入酵母细胞n原生质体转化n碱金属离子介导的完整细胞转化nPEG1000转化法n电击法（二）导入植物细胞（三）导入动物细胞第十五页，讲稿共二十七页哦1.利用原生质体进行转化 酵母原生质体感受态酶去壁CaCl2 PEG插入外源基因的载体共转化：将两个以上的基因同时导入感受态细胞的方法转化转化细胞达原生质体总数的1%2%，转化率受再生率影响共转化的原生质体占转化子总数的25%33%第十六页，讲稿共二十七页哦 酵母0.1
7、mol/L LiCl处理感受态插入外源基因的载体40%PEG 4000热激涂布选择性平板，筛选转化子 吸收线性DNA能力明显大于环状DNA，两者相差80倍转化率：103个/g DNA；共转化现象极少第十七页，讲稿共二十七页哦（1）适于原生质体和完整细胞（2）转化率高，105个/g DNA（3）单链转化率高于双链单链含有酵母复制子可转化为双链并复制，无复制子可同源整合到受体菌染色体上缺点：需要特定仪器，成本较高PEG处理酵母细胞，可获得类感受态，用于转化第十八页，讲稿共二十七页哦（一）导入酵母细胞载体介导的转化（农杆菌介导）DNA直接导入（基因抢法、电击法等）种质系统法（花粉管通道法等）（二）导
8、入植物细胞（三）导入动物细胞第十九页，讲稿共二十七页哦1.农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法将目的基因插入到载体的T-DNA区，形成重组DNA将重组DNA转入含有Vir致病基因的农杆菌通过农杆菌侵染植物外植体将含有外源目的基因的T-DNA整合到植物细胞基因组中，获得转基因植株第二十页，讲稿共二十七页哦在饲养平皿的滤纸上培养2天第二十一页，讲稿共二十七页哦又称生物弹击法、微弹轰击法，借助高速金属微粒将DNA分子引入活细胞的转化技术。DNA1.2m钨弹头 吸附金属微粒加速，进入受体细胞基因枪装入外植体制备轰击外植体培养及选择第二十二页，讲稿共二十七页哦第二十三页，讲稿共二十七页哦第二十四页，讲稿共二十七页哦植物细胞原生质体纤维素酶和果胶酶DNA混合入电击缓冲液电击处理愈伤组织幼苗分化选择培养第二十五页，讲稿共二十七页哦（一）导入酵母细胞1.磷酸钙沉淀法2.脂质体介导法3.显微注射法4.DEAE-葡萄糖转染法（二）导入植物细胞（三）导入动物细胞第二十六页，讲稿共二十七页哦感谢大家观看第二十七页，讲稿共二十七页哦