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1、1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至1966年，64个密码子均被破译成功。1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性核酸内切酶（简称限制酶）1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复
2、制能力，并可以在细菌细胞间转移。20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。1985年，穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。科 技 探 索 之 路 基因工程的发展历程例如1：通过重组DNA技术，可以实现利用大肠杆菌生产人的胰岛素。在此实例中，目的基因是_，受体细胞是_，目的基因的表达产物是_。1.基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，通过_等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新
3、的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做_技术。转基因重组DNA人胰岛素基因大肠杆菌细胞人胰岛素例如2：萤火虫萤火虫发光基因发光基因普通动植物普通动植物2.对基因工程概念的理解：基因工程的别名：操作对象：操作水平：基本过程：原 理：结 果：重组DNA技术、转基因技术基因DNA 分子水平剪切拼接导入表达基因重组创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品克服远缘杂交不亲和障碍、定向改造生物性状 优 点：“分子手术刀”“分子缝合针”“分子运输车”金P80例1、例2拼接的基础DNA的基本组成单位相同（四种脱氧核苷酸）表达的基础都遵循碱基互补配对原则DNA分子
4、的空间结构都是规则的双螺旋结构基因是控制生物性状的结构与功能单位遗传信息的传递都遵循中心法则生物界几乎共用一套遗传密码基因基因 工程工程问题问题问题问题1:1:1:1:不同生物的基因为什么能不同生物的基因为什么能拼接？拼接？为什么一种生物的基因可以在另一种为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内生物细胞内表达表达?ATGC腺嘌呤胸腺嘧啶胞嘧啶鸟嘌呤4种脱氧核苷酸种类？o12345脱氧核糖【回顾】DNADNA的基本单位？脱氧（核糖）核苷酸中文全称？脱氧核糖核酸5533AP脱氧核糖GP脱氧核糖TP脱氧核糖CP脱氧核糖脱氧核糖GPAPCPTP脱氧 核糖脱氧 核糖脱氧核糖氢键DNA的平面结构一端有一
5、个游离的磷酸基团另一端有一个羟基（OH）磷酸二酯键第第3 3章章 基因工程工程基因工程工程第第1 1节节 重组重组DNADNA技术的基本工具技术的基本工具情境视频一：情境视频一：从社会中来从社会中来 转基因木瓜（视频）番番木木瓜瓜容容易易受受番番木木瓜瓜环环斑斑病病毒毒的的侵侵袭袭。当当番番木木瓜瓜被被这这种种病病毒毒感感染染后后，产产量量会会大大大大下下降降。科科学学家家通通过过精精心心设设计计，用用“分分子子工工具具”培培育育出出了了转转基基因因番番木木瓜瓜，它它可可以以抵抵御御番番木木瓜瓜环环斑斑病病毒毒。DNADNA双双螺螺旋旋的的直直径径只只有有2nm,2nm,对对如如此此微微小小的
6、的分分子子进进行行操操作作，是是一一项项非非常常精精细细的的工作，更需要专门的工作，更需要专门的“分子工具分子工具”。转基因番木瓜非转基因番木瓜问问题题1:1:解解决决培培育育番番木木瓜瓜的的关关键键步步骤骤需需要要哪哪些些分分子子工工具具呢呢？这这些些“分分子子工工具具”各各具具有有什什么么特特征征呢？呢？一、限制性内切核酸酶“分子手术刀”主要是原核生物来源种类数千种限制酶不是一种酶，而是一类酶特点（1）识别双链DNA分子特定核苷酸序列（2）断开磷酸二酯键识别序列长度一般为48个或其他数量的核苷酸，最常见的为6个核苷酸。专一性专一性TGCCGTAA5353一、限制性内切核酸酶“分子手术刀”结
7、果形成黏性末端或平末端(1)产生黏性末端 EcoR I识别序列为 GAATTC切割部位为 GA之间当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端。GCA AT TTATACG5335GC T T A AA A T T CG黏性末端错位切一、限制性内切核酸酶“分子手术刀”结果形成黏性末端或平末端(1)产生平末端 Sma I识别序列为 CCCGGG切割部位为 CG之间平末端当限制酶在它识别序列的中轴线处将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是平末端。CGC CG GGCGCGC5335CGC CG GGCGCGC平切一、限制性内切核酸酶“分子手术刀”限制酶的命名限
8、制酶的命名 EcoR属名Escherichia首字母种名coli 前两个字母R型菌株从中分离的第一个限制酶例如：例如：流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)d株株中先后分离到中先后分离到3种限制酶，种限制酶，则分别命名为则分别命名为:Hind IHind IIHind III一、限制性内切核酸酶“分子手术刀”问问题题2:2:你你能能根根据据所所掌掌握握的的知知识识，推推测测限限制制酶酶存存在在于于原原核核生生物物中中的的主主要要作用是什么吗？作用是什么吗？原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了套完善的防御机制。限制酶就是它的一种
9、防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。问问题题3:3:为为什什么么限限制制酶酶不不切切割割细细菌菌本本身身的的DNADNA分分子子？书P71一、限制性内切核酸酶“分子手术刀”问问题题3:3:为为什什么么限限制制酶酶不不切切割割细细菌菌本本身身的的DNADNA分分子子？含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。书P74 实战训练实战训练1.写出下列限制酶切割形成的末端序列BamH EcoR_ Hind Bgl _-G-CCTAG-G-CTTAA-A-TT
10、CGA-A-TCTAGor GATCC-G-or AATTC-G-or AGCTT-A-or GATCT-A-【思考】同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？相同可能会相同【问题探究1】请判断：以下黏性末端是由 种限制酶作用产生的。3结论：不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端结论：不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端金P82 例3C5.下面是下面是4种限制酶所识别的种限制酶所识别的DNA分子序列和切割位点图分子序列和切割位点图(表示切割位点表示切割位点,切切口为黏性末端口为黏性末端),下列叙述正确的是下列叙述正确的是()A.限制酶限制酶1和和3切出的
11、黏性末端相同切出的黏性末端相同B.限制酶限制酶1、2、4识别的序列都由识别的序列都由4个脱氧个脱氧核苷酸组成核苷酸组成C.在使用限制酶的同时还需要解旋酶在使用限制酶的同时还需要解旋酶D.限制酶限制酶1和和2切出的切出的DNA片段可通过片段可通过T4 DNA 连接酶拼接连接酶拼接限制酶限制酶2:限制酶限制酶3:限制酶限制酶4:限制酶限制酶1:A作P34 【问题探究2】下图甲是一个DNA片段，箭头处代表不同限制酶的切点，据图回答：（1）用EcoR 酶切，能得到 种DNA片段；（2）用Pst 完全酶切，能得到 种DNA片段；（3）同时用Sma 和Pst 完全酶切，能得到 种DNA片段；（4）只用Ps
12、t 酶切，最多能得到 种DNA片段。2355用同种限制酶切割(EcoEcoR)R)T G A A T T C GA C T T A A G CA G A A T T C TT C T T A A G A问题问题5:5:把两种来源不同的把两种来源不同的DNADNA进行重组，应该怎样处理？进行重组，应该怎样处理？缺口怎么办缺口怎么办将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。1.作用：2.DNA连接酶“分子缝合针”3.种类：类型Ecoli DNA连接酶T4DNA连接酶来源_功能只缝合_缝合_和_结果恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_大肠杆菌T4噬菌体黏性末端黏性末
13、端平末端磷酸二酯键磷酸二酯键2.作用部位：两个DNA片段要具有互补（相同的）黏性末端才能连接起来把两个DNA片段黏性末端间的缝隙“缝合”起来，注意：DNA连接酶可连接两个双链DNA片段中的DNA单链缺口，但不能直接连接两条单链的DNA！（1）.Ecoli DNA连接酶的缝合作用：DNA连接酶将两个双链DNA片段“缝合”连接起来，形成一个双链DNA分子，恢复被限制酶切开的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。T4 DNA连接酶还可以把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率相对较低。（1）.T4 DNA连接酶的缝合作用：【问题探究2】请判断：和 可形成重组DNA分子，但和 之间不能。【P74P74拓展应用
14、拓展应用2 2】有】有2 2个不同来源的个不同来源的DNADNA片段片段A A和和B B，A A片段用限制酶片段用限制酶SpeSpe进行切割，进行切割，B B片段分别用限制酶片段分别用限制酶HindHind、XbaXba、EcoREcoR和和XhoXho进行切割，各限制酶的识别序列和进行切割，各限制酶的识别序列和切割位点如下：切割位点如下：(1)(1)哪种限制酶切割哪种限制酶切割B B片段产生的片段产生的DNA DNA 片段能与限制酶片段能与限制酶SpeSpe切割的切割的A A片段产生的片段产生的DNADNA片段片段相连接，为什么？相连接，为什么？XbaXba 因为因为XbaXba与与SpeS
15、pe切割产生了相同的黏性末端（可互补）切割产生了相同的黏性末端（可互补）C CA AA AT TT TG GA AG GT TA AT TC CDNADNA聚合酶聚合酶连接单个脱氧核苷酸形成单链连接单个脱氧核苷酸形成单链DNA聚合酶作用示意图：聚合酶作用示意图：易混易错DNADNA连接酶连接酶DNADNA聚合酶聚合酶相同相同点点作用实质作用实质化学本质化学本质不不同同点点模板模板作用对象作用对象作用结果作用结果用途用途都能催化形成磷酸二酯键都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质都是蛋白质不需要不需要需要需要DNADNA的一条链作模板的一条链作模板形成完整的重组形成完整的重组DNADNA分子分子形成形
16、成DNADNA的一条链的一条链基因工程基因工程DNADNA复制复制只能将只能将单个核苷酸单个核苷酸连接连接到已有的到已有的DNADNA片段上，形片段上，形成磷酸二酯键成磷酸二酯键在在两个两个DNADNA片段之间片段之间形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键名称作用部位作用底物作用结果限制酶DNA连接酶DNA聚合酶DNA(水解)酶解旋酶归纳总结与DNA相关的五种酶的比较DNA磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对之间的氢键将双链DNA切成两个或多个片段将两个DNA片段连接为一个DNA分子将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸将双链DNA分子局部解旋为单链DNADNA片段脱氧核苷酸
17、磷酸二酯键DNA作P35 99.下图表示下图表示DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化分子在不同酶的作用下所发生的变化,图中依次表图中依次表示限制酶、示限制酶、DNA聚合酶、聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是连接酶、解旋酶作用的正确顺序是()A.B.C.D.作P35 9C TATCGTACGATAGGTACTTAA ATAGCATGCTATCCATG AATTCGGCATAC GCCGTATGTCCTAGAGGATCTTAAGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG AATTCCATAC GGTATGGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG53535353重组重
18、组DNADNA分子分子思考思考.讨论讨论问题问题1:1:剪刀和透明胶条分别代表哪种剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具分子工具”？剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。问题问题2:2:你插入的你插入的DNADNA片段能称得上一个基因吗片段能称得上一个基因吗？不能。真正的基因是有遗传效应的DNA片段，且含有几百至几千个不等的碱基对。P73将外源基因送入受体细胞，相当于一种运输工具，比喻为“分子运输车”1.种类：质粒、噬菌体和动植物病毒等。种类用途不同点质粒、噬菌体植物病毒动物病毒将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞将外源基因导入植物细胞将外源基因导入动物细胞来源不同，在大小、结构、复制方式以及可
19、以插入外源DNA片段的大小也有很大差别基因进入受体细胞的载体“分子运输车”三2.最常用的载体质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。DNA分子复制的起点特殊的标记基因用于鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞标记基因通常有标记基因通常有:抗生素的抗性基因抗生素的抗性基因，如，如:抗氨苄青霉素基因抗氨苄青霉素基因(amp(ampr r)、抗四环素基因、抗四环素基因(tet(tetr r)荧光蛋白基因荧光蛋白基因，如，如:绿色荧光蛋白基因绿色荧光蛋白基因(GFP)(GFP)、红色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因(RFP)(RFP)质
20、粒有质粒有_个游离的磷酸基团个游离的磷酸基团0 03.载体作为载体所具备的条件及原因有一个至多个限制酶切割位点供外源DNA片段（基因）插入其中在受体细胞中稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制使外源基因在受体细胞中稳定存在并复制，以扩增外源基因的数量具有特殊的标记基因便于重组DNA分子的筛选无毒害作用避免受体细胞受到损伤4.质粒的作用作为运输工具，将外源基因导入受体细胞。质粒携带外源DNA片段在细胞内大量复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的1 1、选目的基因两端和运载体、选目的基因两端和运载体都有都
21、有的的酶切位点；酶切位点；2 2、所选酶切位点、所选酶切位点不能破坏不能破坏目的基因目的基因以及标记基因以及标记基因规律：-选择酶切位点的原则：金P82 例4、51.“分子手术刀”1）来源：2）作用：3）作用结果：2.“分子缝合线”1）作用：2）分类：3.“分子运输车”1）作用：2）种类：3）应具备条件：限制酶 产生黏性末端、平末端 DNA连接酶将不同的DNA片段连接起来 磷酸二酯键将外源基因送入受体细胞质粒（最常用）、噬菌体、动植物病毒E.Coli DNA连接酶、T4DNA连接酶（来源、区别？）主要从原核生物中分离纯化出来。载体识别特定的核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯键断开。作用部位：能在
22、细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。有一个至多个限制酶切割位点具有标记基因对受体细胞无害便于重组DNA分子的筛选供外源DNA片段（目的基因）插入其中小结：基因工程的基本工具原理一原理一原理二原理二原理三思路思路：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精DNA能溶于物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液在一定温度下，DNA被二苯胺试剂染成蓝色 DNA DNA的粗提取和鉴定的粗提取和鉴定探究探究.实验实验一、实验原理：不同生物的组织中DNA含量不同。在选
23、取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。你认为如下提供的材料中哪些不适合提取DNA？为什么？供选材料：（括号内为染色体条数）新鲜洋葱（16）、香蕉、菠菜（12）、菜花、猕猴桃（58）；猪肝（38）、鱼卵、鸡血（78）、哺乳动物的成熟红细胞；在液体培养基中培养的大肠杆菌（1）原则上，凡是含有DNA的生物材料都可以考虑；选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。1、实验材料的选取利用动物细胞提取利用动物细胞提取DNADNA破碎细胞的方法：破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破涨破。以血液为实验材料时，每。以血液为实验材料时，每100
24、mL100 mL血液中需要加入血液中需要加入3 g3 g柠檬酸钠柠檬酸钠，防防止血液凝固止血液凝固。二、实验材料及用具：DNA DNA的粗提取和鉴定的粗提取和鉴定探究探究.实验实验2.试剂：试剂研磨液体积分数为95%的酒精二苯胺2mol/L 的NaCl溶液 蒸馏水溶解并提取DNA析出DNA溶解DNA鉴定DNA，要现配现用研磨液成分作用SDS使蛋白质变性EDTA抑制DNA酶Tris-HCl缓冲液稳定DNA二、实验材料及用具：DNA DNA的粗提取和鉴定的粗提取和鉴定探究探究.实验实验三、实验步骤：1.破碎细胞称取 ，切碎，放入研钵，倒入 ，研磨。洋葱研磨液充分问问题题2:2:如如果果研研磨磨不不
25、充充分分会会对对实实验验结结果果产产生生怎怎样样的的影影响响？研磨不充分，会使DNA分子不能从细胞核中释放出来，从而使研磨液中的DNA含量较低，影响最终提取的DNA量。DNA DNA的粗提取和鉴定的粗提取和鉴定探究探究.实验实验三、实验步骤：2.去除杂质在漏斗中垫上 过滤研磨液，4冰箱中静置后取 ；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取 。纱布上清液上清液问问题题3:3:过过滤滤能能否否用用滤滤纸纸代代替替纱纱布布？不可以。因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。问问题题4:4:此此步步骤骤获获得得的的上上清清液液中中可可能能含含有有哪哪些些细细胞胞成成分分？可能含有DNA、
26、RNA以及蛋白质、脂质、糖类等。DNA DNA的粗提取和鉴定的粗提取和鉴定探究探究.实验实验三、实验步骤：3.DNA的粗提取在上清液中加入体积相等的 溶液,静置23min，溶液中出现的 就是粗提取的DNA。预冷的酒精白色丝状物用冷却的酒精析出DNA问问题题5:5:此此步步骤骤的的目目的的是是？使蛋白质等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。预冷的酒精的优点可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。DNA DNA的粗提取和鉴定的粗提取和鉴定探究探究.实验实验三、实验步骤：3.DNA的粗提取用玻璃棒沿 搅拌，卷起
27、 ，并用滤纸吸去上面的水分：或将溶液倒入塑料离心管中离心，取 晾干。一个方向沉淀物丝状物问题问题6:6:为什么要用玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌？为什么要用玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌？避免破坏DNA用冷却的酒精析出DNA DNA DNA的粗提取和鉴定的粗提取和鉴定探究探究.实验实验三、实验步骤：4.DNA的鉴定试管编号A（对照组）B（实验组）步骤12mol/L的NaC1溶液5mL步骤2不进行任何处理步骤3步骤4沸水浴加热5min实验现象实验结论加丝状物或沉淀物加4mL的二苯胺试剂 DNA DNA的粗提取和鉴定的粗提取和鉴定探究探究.实验实验三、实验步骤：4.DNA的鉴定将丝状物或沉淀物溶于 溶液中，加
28、入 试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。二苯胺2mol/L的NaCl空白对照组：在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。加入2mol/L氯化钠溶液不加入丝状物加入4mL二苯胺试剂加入2mol/L氯化钠溶液加入丝状物加入4mL二苯胺试剂实验组对照组水浴加热 DNA DNA的粗提取和鉴定的粗提取和鉴定探究探究.实验实验三、实验步骤：4.DNA的鉴定将丝状物或沉淀物溶于 溶液中，加入 试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。二苯胺2mol/L的NaCl实验组对照组问问题题7:7:如如何何评评价价结结果果？看提取物颜色看与二苯胺反应颜色的深浅DNA纯度DNA的量问问题题8:8:与与其其他他同同学学提提取取的的DNADNA进进行行比比较较，看看看看实实验验结结果果有有何何不不同同，分分析析产生差异的原因。产生差异的原因。DNA DNA的粗提取和鉴定的粗提取和鉴定探究探究.实验实验问问题题8:8:与与其其他他同同学学提提取取的的DNADNA进进行行比比较较，看看看看实实验验结结果果有有何何不不同同，分分析析产生差异的原因。产生差异的原因。实验结果不明显的可能原因：材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够。加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。二苯胺最好现用现配，否则二苯胺变成浅蓝色，影响鉴定效果。