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1、第1节重组DNA技术的基本工具1.什么叫基因工程？P65基因工程的原理是什么？基因工程有什么优点？基因工程的发展？2.重组DNA技术的用到的基本工具是哪三个？3.限制酶的主要从哪类生物中分离纯化出来的？切割的化学键是？4.EcoR限制酶和Sma限制酶切割DNA后，分别产生什么样的末端？5.DNA连接酶的作用？作用的化学键？6.EcoliDNA连接酶和T4DNA连接酶分别来自什么生物？它们连接的末端有什么差异？7.基因工程中用的载体起什么作用？作为载体要具备哪些条件？种类有哪些？8.质粒的化学本质是什么？只有原核生物才有质粒吗9.限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、解旋酶、DNA酶的作用分别是什
2、么？10.DNA粗提取的原理？11.DNA和蛋白质在酒精中溶解性有什么差异？12.DNA在NaCl溶液中溶解度与NaCl溶液的浓度存在怎样的关系？13.鉴定DNA的原理？（条件？试剂？现象？）第三章第三章 基因工程基因工程第第1 1节节重组重组DNADNA技术的基本工具技术的基本工具 背景资料1 我国是棉花的生产和消费大国，棉花在种植过程中常常会受到棉铃虫的我国是棉花的生产和消费大国，棉花在种植过程中常常会受到棉铃虫的侵袭，这会使棉花大量减产。大量施用农药不仅提高了生产成本，还可能造侵袭，这会使棉花大量减产。大量施用农药不仅提高了生产成本，还可能造成农产品和环境的污染，如果能培育出自身能抵抗棉
3、铃虫的棉花就能解决这成农产品和环境的污染，如果能培育出自身能抵抗棉铃虫的棉花就能解决这个问题。个问题。普通棉花不抗虫，苏云芽孢杆菌可以合成抗虫毒素普通棉花不抗虫，苏云芽孢杆菌可以合成抗虫毒素BtBt毒蛋毒蛋白，请思考如何生产抗虫棉？白，请思考如何生产抗虫棉？杂交育种？诱变育种？等技术能否实现？为什么？杂交育种？诱变育种？等技术能否实现？为什么？杂交育种：同种生物之间进行；诱变育种：在原有基因基础上发生基因突变，结果产生新的等位基因（不定向）克服远缘杂交不亲和的障碍；定向改造生物性状基因工程一思考：能否将苏云金杆菌的思考：能否将苏云金杆菌的“抗虫基因抗虫基因”导入棉花细胞，使棉花自导入棉花细胞，
4、使棉花自身产生抗虫蛋白来抵抗棉铃虫呢？身产生抗虫蛋白来抵抗棉铃虫呢？就是按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品，从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组DNA技术。1.1.原理：原理：2.2.操作水平：操作水平：3.3.结果：结果：分子水平基因重组赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品工具工具酶分子运输车：。（）。（）。限制酶连接酶载体【易错警示】工具酶工具质粒噬菌体的衍生物动植物病毒“手术刀”“缝合针”重组DNA技术的基本工具限制性内切核酸酶“分子手术刀”二 1
5、、来源：主要从原核生物中分离纯化来的 2、种类：数千种【P71P71旁栏思考题】限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？旁栏思考题】限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？原核生物易受自然界外源原核生物易受自然界外源DNADNA的入侵的入侵，但生物在长期的进化过程中，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶限制酶就就是细菌的一种是细菌的一种防御性工具防御性工具，当外源，当外源DNADNA侵入时，会侵入时，会利用限制酶利用限制酶将外将外源源DNADNA切割掉切割掉，以保证自身的安全，以保证自身的安全。所以，限制
6、酶在原核生物中主。所以，限制酶在原核生物中主要起到要起到切割外源切割外源DNADNA、起防御作用、起防御作用。原核细胞原核细胞DNADNA中中不存在限制酶的识别序列或能被识别的序列被修饰了。不存在限制酶的识别序列或能被识别的序列被修饰了。【P74P74拓展应用拓展应用1 1】为什么限制酶不切割细菌本身的】为什么限制酶不切割细菌本身的DNADNA分子？分子？限制性内切核酸酶“分子手术刀”二 1、来源：主要从原核生物中分离纯化来的 2、种类：数千种3、特点:能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。识别序列有何特点？识别序列有何特点？大多数限制酶的识别序列由6
7、个核苷酸组成，少数4个、8个或其他数量均有中心轴线，且中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向重复排列，即回文序列。中心轴线EcoR Sam 4、限制酶切割结果:产生黏性末端和平末端EcoREcoR限制酶限制酶 SmaSma限制酶限制酶DNA连接酶“分子缝合针”三磷酸二酯键什么样的末端什么样的末端才能连接才能连接起来？起来？教材P74课后题拓展应用2：有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶Spe进行切割，B片段分别用限制酶Hind、Xba、EcoR和Xho进行切割，各限制酶的识别序列和切割位点如下：哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶Spe切割的A片段产生的DNA片段相连接，为
8、什么？Xba因为Xba与Spe切割产生了相同的黏性末端（可互补）DNA连接酶“分子缝合针”三磷酸二酯键大肠杆菌黏性末端黏性末端根据所学知识，完成以下填空：限制酶解旋酶DNA连接酶DNA聚合酶ba1.切断a处的酶为_2.连接a处的酶为_3.切断b处的酶为_a：磷酸二酯键；b：氢键解旋酶 DNADNA复制时复制时断：断：DNA酶限制酶能够能够识别识别双链双链DNADNA分子的分子的特特定核苷酸序列定核苷酸序列,并使每一条链中并使每一条链中特定部位的特定部位的磷酸二酯键磷酸二酯键断开。断开。连：连：DNA聚合酶只能将单个核苷酸连接到已只能将单个核苷酸连接到已有的有的DNADNA片段上片段上 DNA连
9、接酶只能催化两个只能催化两个DNADNA片段之间片段之间形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键问题三：如何目的基因运送到细胞呢？基因导入受体细胞的载体“分子运输车”四任务：分析归纳载体需要具备的条件：任务：分析归纳载体需要具备的条件：问题问题1 1：载体要与外源基因连接，需要具备什么条件？：载体要与外源基因连接，需要具备什么条件？问题问题2 2：要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在，载体需要具备：要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？什么条件？问题问题3 3：我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重：我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组组DNADN
10、A分子，载体需要具备什么条件？分子，载体需要具备什么条件？条件条件：具有一个或多个限制酶切割位点；：具有一个或多个限制酶切割位点；条件条件：能在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体：能在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体DNADNA上，随受体上，随受体DNADNA同步复制；同步复制；条件条件：具有标记基因，便于重组：具有标记基因，便于重组DNADNA分子的筛选。分子的筛选。条件条件：载体：载体DNADNA必须是安全的，不会对受体细胞有害。必须是安全的，不会对受体细胞有害。载体种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等质粒：一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，具有自我复制
11、能力的环状双链DNA分子。真正被用作载体的质粒，都是真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。在天然质粒的基础上进行过人工改造的。思考：思考：若想要利用质粒将人的胰岛素基因导入大肠杆菌需要进行哪若想要利用质粒将人的胰岛素基因导入大肠杆菌需要进行哪些操作才能形成含有目的基因的质粒？些操作才能形成含有目的基因的质粒？首先用一定的限制酶首先用一定的限制酶切割质粒切割质粒，使它出现一个切口；，使它出现一个切口；然后用同种限制酶（或能产生相同末端的限制酶）然后用同种限制酶（或能产生相同末端的限制酶）切割切割含有目的基因的含有目的基因的DNADNA片段片段；再利用；再利用DNADNA连
12、接酶连接酶将目的基因片段拼接到质粒切口处突破：用限制酶切割时需注意的事项获取目的基因和切割载体时,通常使用同种限制酶,目的是。但是使用该法缺点是容易发生，为了避免上述情况发生，可采取的措施是。获取一个目的基因需限制酶切割次,共产生个游离的磷酸基团。为了产生相同的黏性末端，便于连接两4分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接限制酶切质粒DNA连接酶连接连接产物如何表示？重组质粒GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG目的基因、质粒自身环化目的基因、质粒自身环化目的基因与质粒反向连接目的基因与质粒反向连接例2.如图是培育表达人乳铁蛋白的
13、乳腺生物反应器的技术路线用图2中的人乳铁蛋白目的基因和图1所示的质粒构建重组质粒时，选用的限制酶是（从“EcoR”、“BamH/Hind”、“Sma/Hind”中选择）不能选择其他限制酶的理由分别是：。BamH/HindBamH/Hind若选若选EcoREcoR会破坏质粒的复制原点；若选会破坏质粒的复制原点；若选Sma/HindSma/Hind，则构建的重组质粒没有，则构建的重组质粒没有标记基因标记基因(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中Pst；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择Pst和EcoR
14、两种限制酶。(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择Pst，而不选择Sma。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择Sma。延伸应用图解限制酶的选择原则如何将DNA提取出来，并进行鉴定呢?DNA的粗提取与鉴定探究和实践一、实验原理1.提取DNA的原理利用利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，对它们进行提取。(1)DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于的NaCl溶液。2mol/L
15、2.鉴定DNA的原理在一定温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺（现配现用）试剂会呈现蓝色。DNA的粗提取与鉴定探究和实践二、目的要求：1.了解DNA的物理化学性质，理解DNA粗提取和鉴定的原理。2.学会DNA粗提取的方法以及利用二苯胺试剂对DNA进行鉴定。三、材料用具：1.材料：哺乳动物成熟的红细胞哺乳动物成熟的红细胞洋葱花菜香蕉猪肝鸡血菠菜DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。四、操作过程：1.在基因工程中，已知限制酶的识别序列和切点是GGATCC，限制酶的识别序列和切点是GATC。根据下图示判断下列操作错误的是()A.质粒用限制酶切割，目的基因用限制酶切割B.用限
16、制酶切割获得目的基因时，有四个磷酸二酯键被水解C.限制酶和限制酶切割后获得的黏性末端相同D.质粒中标记基因便于筛选出目的基因已经表达的细胞E.用酶I和酶II形成相同的黏性末端，且用DNA连接酶连接的重组DNA还能用上面两种酶切割DE2.某线性DNA分子含有3000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所示。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法正确的是()a酶切割产物(bp)b酶再次切割产物(bp)1600；1100；300800；300A.在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列分别有3个和2个B.a酶与b酶切出的黏性末端不能
17、相互连接C.a酶与b酶切断的化学键不相同D.用这两种酶和DNA连接酶对该DNA分子进行反复切割、连接操作，若干循环后，D序列会明显增多例1.下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法中，错误的是（）注：注：Y为C或T，R为A或G。A.Hind、Sma两种限制酶切割后形成平末端B.Sau3A限制酶的切割位点在识别序列的外部C.BamH和Sau3A两种限制酶切割后形成相同的黏性末端D.一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列限制酶名称识别序列和切割位点 限制酶名称 识别序列和切割位点BamHGGATCCKpnGGTACCEcoRCAATTCSau3AGATCHindGTYRACSmaCCCGGGC