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1、第3章基因工程第1节 重组DNA技术的基本工具提取提取抗虫基因抗虫基因棉花细胞棉花细胞苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌(有抗虫特征有抗虫特征)普通棉花普通棉花(无抗虫特征无抗虫特征)与载体与载体DNADNA拼接，导入拼接，导入(含抗虫基因含抗虫基因)棉花植株棉花植株(有抗虫特征有抗虫特征)培育培育抗虫棉抗虫棉的简要过程的简要过程基因工程实例：基因工程实例：基因工程的概念：基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，通过基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术转基因等技术，赋予生物，赋予生物新的遗传特性新的遗传特性，创造出更符合人们需要的，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制新的生物类型和
2、生物制品品。从技术操作层面看，由于基因工程是在。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNADNA分子水平分子水平上进行设上进行设计和施工的，因此又叫计和施工的，因此又叫重组重组DNADNA技术技术。1.1.别名：别名：2.2.原理：原理：3.3.操作对象：操作对象：4.4.操作水平：操作水平：5.5.结果：结果：重组重组DNADNA技术技术基因基因分子水平分子水平基因重组基因重组赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品新的生物类型和生物制品1 1、不同生物的基因为什么能拼接？、不同生物的基因为什么能拼接？2 2、外源基因为什么
3、能在受体细胞中表达？、外源基因为什么能在受体细胞中表达？思考-讨论(1)DNA(1)DNA的基本组成的基本组成单位单位都是四种脱氧核苷酸。都是四种脱氧核苷酸。(2)(2)双链双链DNADNA分子分子的的空间结构空间结构都是规则的双螺旋结构。都是规则的双螺旋结构。(1)(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。基因是控制生物性状的独立遗传单位。(2)(2)遗传遗传信息的传递信息的传递都遵循中心法则。都遵循中心法则。(3)(3)生物界生物界共用一套遗传密码共用一套遗传密码。相同的遗传信息在。相同的遗传信息在 不同的生物体内表达出相同的蛋白质。不同的生物体内表达出相同的蛋白质。基因工程诞生的理论基础基
4、因工程诞生的理论基础 “工欲善其事，必先利其器工欲善其事，必先利其器”。在培育转基因番木瓜时，。在培育转基因番木瓜时，既要在体外对含有所需基因的既要在体外对含有所需基因的DNADNA分子分子“切割切割”、改造和、改造和“拼拼接接”；又要将重组；又要将重组DNADNA分子导入番木瓜体内，并使其表达。分子导入番木瓜体内，并使其表达。DNA分子极小，实现这些精确操作需要哪些“分子工具”呢？从社会中来 番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用通过精心设计，用“分子
5、工具分子工具”培育出了转基因培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。DNADNA双螺旋的直径只有双螺旋的直径只有2nm,2nm,对如此微小的分子对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的的“分子工具分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具分子工具”？这些？这些“分子工具分子工具”各具有什么特各具有什么特征呢？征呢？转基因番木瓜转基因番木瓜(左）与非转基左）与非转基因番木瓜因番木瓜(右）右）工具工具分子手术刀分子手术刀分子缝合针分子缝合针分子运输车分子运输车限
6、制性内切核酸酶：限制性内切核酸酶：DNADNA连接酶：连接酶：载体：载体：准确切割准确切割DNA分子分子将将DNADNA片段连接起来片段连接起来将体外重组好的将体外重组好的DNADNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞培育转基因番木瓜培育转基因番木瓜“分子手术刀分子手术刀”准确切割准确切割DNA分子分子“分子缝合针分子缝合针”“分子运输车分子运输车”将将DNA片片段连接起段连接起来来将体外重组好的将体外重组好的DNA分子导入受体分子导入受体细胞细胞一、限制性内切核酸酶一、限制性内切核酸酶“分子手术刀分子手术刀”1.1.简称：简称：限制酶限制酶2.2.来源：来源：主要是从主要是从原核生物原核生物中
7、分离中分离纯化出来的。化出来的。3.3.作用：作用：识别双双链DNADNA分子的特定核苷酸序列分子的特定核苷酸序列，并且，并且使每一条使每一条链中中特定部位的磷酸二特定部位的磷酸二酯键断开断开。4.4.作用部位：作用部位：特定部位的磷酸二酯键特定部位的磷酸二酯键ATCGTAGC5353磷磷酸酸二二酯酯键键5.5.识别序列：识别序列：大多数限制大多数限制酶的的识别序列序列由由6 6个核苷酸个核苷酸组成，也有成，也有少数限制少数限制酶的的识别序列由序列由4 4个个、8 8个个或或其他数量其他数量的核苷酸的核苷酸组成。成。EcoREcoR5 5G-A-A-T-T-G-A-A-T-T-CC3 33 3
8、C-T-T-A-A-C-T-T-A-A-G5G5SmaSma5 5C-C-C-G-G-C-C-C-G-G-GG3 33 3G-G-G-C-C-G-G-G-C-C-C5C56.6.限制限制酶的命名：的命名：用生物属名的用生物属名的头一个字母与种加一个字母与种加词的的头两个字母两个字母，组成了成了3 3个字母的略个字母的略语，以此来表示以此来表示这个个酶是从哪种生物中分离出来的是从哪种生物中分离出来的。例如，一种限制。例如，一种限制酶是从是从大大肠杆菌杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)的的R R型菌株型菌株分离来的，就用字母分离来的，就用字母EcoREco
9、R表示；如表示；如果它是从大果它是从大肠杆菌杆菌R R型菌株中分离出来的第一种限制型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成一步表示成EcoRIEcoRI。7.7.切割结果：切割结果：DNA DNA分子经限制酶切割产生的分子经限制酶切割产生的DNADNA片段末端通常有两片段末端通常有两种形式种形式_和和_黏性末端黏性末端平末端平末端当限制酶在它识别序列的当限制酶在它识别序列的_将将DNADNA分子的两条链分别切开时，产生的是分子的两条链分别切开时，产生的是_；当限制酶在它识别序列的当限制酶在它识别序列的_切开切开时，产生的是时，产生的是_；中轴线两侧中轴线两侧黏性末端黏性末端中轴线处中轴线
10、处平末端平末端黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端2024/1/22 实例实例1EcoR1EcoR限制酶：限制酶：识别序列识别序列为为GAATTCGAATTC，切割部位切割部位为为GAGA之间的磷酸之间的磷酸二酯键二酯键。实例实例2Sma2Sma限制酶限制酶：识别序列识别序列为为CCCGGGCCCGGG 切割部位切割部位为为CGCG之间的磷之间的磷酸二酯键酸二酯键。形成黏性末端形成黏性末端平末端平末端形成平末端形成平末端课堂练习：写出下列限制酶切割形成的黏性末端课堂练习：写出下列限制酶切割形成的黏性末端BamH_ EcoRBamH_ EcoR_Hind_ Bgl _ Hind_ Bgl _ GAT
11、CGATCAATTAATTAGCTAGCTGATCGATC思考：你从中发现什么现象了？思考：你从中发现什么现象了？不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端你你能能根根据据所所掌掌握握的的知知识，推推测限限制制酶存存在在于于原原核核生生物物中中的主要作用是什么的主要作用是什么吗？原核生物容易受到自然界原核生物容易受到自然界外源外源DNADNA的入侵的入侵，所以它在，所以它在长长期的进化期的进化过程中形成了一套完善的过程中形成了一套完善的防御机制防御机制。限制酶就。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源是它的一种防御性工具。当外源DNADNA入侵时，它会利用限入侵
12、时，它会利用限制酶来制酶来切割外源切割外源DNADNA，使之失效使之失效，以，以保证自身安全保证自身安全。所以，简单来说：限制酶在原核生物中起到的作用为：所以，简单来说：限制酶在原核生物中起到的作用为：切割外源切割外源DNADNA、使之失效，以保证自身安全、使之失效，以保证自身安全试推测限制酶为什么不会切割自身的试推测限制酶为什么不会切割自身的DNADNA？原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰二、分子缝合针二、分子缝合针DNADNA连接酶连接酶1.1.作用：作用：将将两个两个DNADNA片段片段连接起来接起来，恢复恢复被限制被限制酶切
13、开的切开的磷酸二磷酸二酯键。G C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C GDNADNA连接酶和连接酶和DNADNA聚合酶是一回事吗？为什么？聚合酶是一回事吗？为什么？A A T T G A A T T GC CA AA AT TT TA AA AT TT TDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶种类种类DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA连接酶连接酶不不同同点点作用作用实质实质作用结果作用结果模板模板相同点相同点催化单个核苷酸催化单个核苷酸加到已有加到已有核苷酸片段的核苷酸片段的3末端的羟末端的羟基上，形成磷酸二酯键基上，形成磷酸二酯键催
14、化两个催化两个DNADNA片段片段之之间形成磷酸二酯键间形成磷酸二酯键催化催化形成与模板链互补形成与模板链互补的的DNADNA链链，形成新的双链，形成新的双链DNADNA分子分子催化具有互补黏性末端或催化具有互补黏性末端或平末端的平末端的DNADNA片段连接起片段连接起来，来，形成重组形成重组DNADNA分子分子需要需要不需要不需要化学本质都是蛋白质化学本质都是蛋白质都是催化形成磷酸二酯键都是催化形成磷酸二酯键DNADNA连接酶和连接酶和DNADNA聚合酶功能比较聚合酶功能比较2.2.分分类：种类种类EcoliEcoli DNADNA连接酶连接酶T4 DNAT4 DNA连接酶连接酶来源来源功能
15、特功能特性性相同点相同点大肠杆菌大肠杆菌T4T4噬菌体噬菌体只能将只能将具有具有互补黏性末端互补黏性末端的的DNADNA片段片段连接起来连接起来，不能连，不能连接具有平末端的接具有平末端的DNADNA片段片段既可以连接双链既可以连接双链DNADNA片段互补片段互补的黏性末端，又可以连接双的黏性末端，又可以连接双链链DNADNA片段的平末端（但连接片段的平末端（但连接平末端的效率相对较低）平末端的效率相对较低）恢复恢复的都是的都是磷酸二酯键磷酸二酯键三、三、基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体“分子运输车分子运输车”1.1.作用：作用：将外源基因送入受体细胞将外源基因送入受体细胞2.2.
16、种种类：质粒粒、噬菌体噬菌体和和动植物病毒植物病毒等。等。种种类用途用途不同点不同点质粒、噬菌体粒、噬菌体植物病毒植物病毒动物病毒物病毒将外源基因导入大肠杆菌等将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞受体细胞将外源基因导入植物细胞将外源基因导入植物细胞将外源基因导入动物细胞将外源基因导入动物细胞来源不同，在大小、结来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以构、复制方式以及可以插入外源插入外源DNADNA片段的大片段的大小也有很大差别小也有很大差别3.3.作作为载体需具体需具备的条件的条件（1 1）有一个至多个限制有一个至多个限制酶切割位点切割位点，供外源供外源DNADNA片段（基因）插入其中片段（基因）
17、插入其中。（2 2）能）能在在细胞中胞中进行自我复制行自我复制或或整合到受体整合到受体DNADNA上，上，随受体随受体DNADNA同步复制同步复制。（3 3）常有特殊的常有特殊的标记基因（基因（如四如四环素抗性基因、氨素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等）青霉素抗性基因等），便于重便于重组DNADNA分子的分子的筛选。利用利用标记基因基因进行行筛选示例：示例：4.4.最常用的运载体最常用的运载体质粒质粒（1 1）质粒的化学本质：）质粒的化学本质：质粒是一种质粒是一种_的、的、结构简结构简单单的、独立于的、独立于_或或_之外，并具有之外，并具有自自我复制我复制能力的能力的_分子分子裸露裸露真核细胞细
18、胞核真核细胞细胞核原核细胞拟核原核细胞拟核DNADNA环状双链环状双链DNADNA（2 2）基因工程中使用质粒的特点：）基因工程中使用质粒的特点：在基因工程操作中，真正被用在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是作载体的质粒，都是天然质粒的基天然质粒的基础上础上进行过进行过_的；的；这些质这些质粒上常有粒上常有特殊的标记基因，特殊的标记基因，便于便于_；人工改造人工改造重组重组DNADNA分子的筛选分子的筛选重组重组DNADNA分子分子 TATCGTACGATAGGTACTTAA TATCGTACGATAGGTACTTAA ATAGCATGCTATCCATGATAGCATGCTATCCAT
19、G AATTCGGCATAC AATTCGGCATAC GCCGTATGGCCGTATGTCCTAGTCCTAGAGGATCTTAAAGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGAATTCTCGGTATG AATTCCATAC AATTCCATAC GGTATGGGTATGGAGCCATACTTAAGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGAATTCTCGGTATG重组重组DNADNA分子分子1.1.剪刀和透明胶条分剪刀和透明胶条分别代表哪种代表哪种“分子工具分子工具”？剪刀代表限制剪刀代表限制酶；透明胶条代表；透明胶条代表DNAD
20、NA连接接酶。2.2.你制作的黏性末端的碱基能不能互你制作的黏性末端的碱基能不能互补配配对?如果不能，如果不能，可能是什么原因造成的？可能是什么原因造成的？如果制作的黏性末端的碱基不能互如果制作的黏性末端的碱基不能互补配配对，可能是剪切位点可能是剪切位点或或连接位点接位点选得不得不对，也，也可能是其他原因可能是其他原因。3.3.你插入的你插入的DNADNA片段能称得上一个基因片段能称得上一个基因吗？不能，因不能，因为基因的基因的长度一般在度一般在100100个碱基个碱基对以上。以上。DNADNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定1.1.实验原理：原理：（1 1）DNADNA不溶于酒精不溶于酒精，但，
21、但某些蛋白某些蛋白质溶于酒精溶于酒精。（2 2）DNADNA在不同在不同浓度的度的NaClNaCl溶液中溶解度不同溶液中溶解度不同，能，能溶于溶于2mol/L 2mol/L NaClNaCl溶液溶液。（3 3）在一定温度下，）在一定温度下，DNADNA遇遇二苯胺二苯胺试剂会呈会呈现蓝色色。DNA DNA、RNARNA、蛋白、蛋白质和脂和脂质等在物理和化学性等在物理和化学性质方面存在方面存在差异差异，可以利用，可以利用这些差异，些差异，选用适当的物理或化学方法去除用适当的物理或化学方法去除其他成分，其他成分，对DNADNA进行提取行提取。DNA DNA含量相对较高含量相对较高的生物组织，如的生物
22、组织，如新鲜洋葱新鲜洋葱、香蕉、菠、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等菜、菜花和猪肝等 不能选择不能选择哺乳动物成熟的红细胞哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体没有细胞核和线粒体，几乎，几乎不含不含DNADNA二、材料用具二、材料用具1.1.选材：选材：注意：注意：2.2.试剂：试剂：研磨液研磨液体积分数为体积分数为95%95%的酒精的酒精2mol/L 2mol/L 的的NaClNaCl溶液溶液二苯胺试剂二苯胺试剂蒸馏水蒸馏水含有含有NaClNaCl、EDTAEDTA、SDSSDS、TrisTris和和HClHCl析出析出DNADNA溶解溶解DN
23、ADNA鉴定鉴定DNADNA，要现配现用，要现配现用三、方法步骤：三、方法步骤：取材、研磨取材、研磨过滤或离心取上清液过滤或离心取上清液预冷酒精析出预冷酒精析出DNADNA或离心收集沉淀中的或离心收集沉淀中的DNADNANaClNaCl溶液溶解溶液溶解DNADNA并鉴定并鉴定 抑制核酸水解酶的活性，进而抑制抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNADNA降解；降解；抑制抑制DNADNA分子运动，使分子运动，使DNADNA易形成沉淀析出；易形成沉淀析出；1.1.取材、研磨：取材、研磨：称取称取30g30g洋葱，洋葱，切碎切碎，然后放入，然后放入研钵研钵中，倒入中，倒入10mL10mL 研磨液研磨液，充
24、分充分研磨研磨研磨的目的：研磨的目的：破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中2.2.过滤或离心取上清液：过滤或离心取上清液：在漏斗中垫上在漏斗中垫上纱布纱布，将洋葱研磨液，将洋葱研磨液过滤过滤到烧杯中，在到烧杯中，在44冰箱中放置冰箱中放置几分几分钟钟后，再后，再取上清液取上清液。也可也可直接直接将研磨液将研磨液倒入塑料离心管倒入塑料离心管中，中，1500r/min1500r/min的转速下离心的转速下离心5min5min，再，再取上清液取上清液放入烧杯中。放入烧杯中。上清液中除上清液中除DNADNA之外，可能含有哪些杂质？之外，可能含有哪些杂质？可能含有核蛋
25、白、多糖等杂质可能含有核蛋白、多糖等杂质低温放置几分钟的作用：低温放置几分钟的作用：3.3.预冷酒精析出预冷酒精析出DNADNA或离心收集沉淀中的或离心收集沉淀中的DNADNA 在上清液中加入在上清液中加入体积相等体积相等的、的、预冷预冷的的酒精溶液酒精溶液(体积分数为体积分数为95%95%)，静置，静置2 2-3min3min，溶液中出现的，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的白色丝状物就是粗提取的DNADNA。用玻璃棒。用玻璃棒沿一个方向搅拌沿一个方向搅拌，卷起丝，卷起丝状物，并用状物，并用滤纸吸去滤纸吸去上面的上面的水分水分；或将溶液倒入或将溶液倒入塑料离心管塑料离心管中，在中，在1000
26、0r/min10000r/min的转速下离心的转速下离心5min5min，弃上清液，弃上清液，将管底的将管底的沉淀物沉淀物(粗提取的粗提取的DNA)DNA)晾干晾干。搅拌时应搅拌时应轻缓、并沿一个方向：轻缓、并沿一个方向：减少减少DNADNA断裂，断裂，以便获得较完整的以便获得较完整的DNADNA分子分子4.4.NaClNaCl溶液溶解溶液溶解DNADNA并鉴定并鉴定 取两支取两支20mL20mL的试管，各加入的试管，各加入2mol/L2mol/L的的NaClNaCl溶液溶液5mL5mL。将。将丝状丝状物或沉淀物物或沉淀物溶于其中溶于其中一支一支试管的试管的NaCINaCI溶液中。向溶液中。向
27、两支两支试管中各试管中各加入加入4mL4mL的的二苯胺试剂二苯胺试剂。混合均匀后，将试管。混合均匀后，将试管置于沸水中加热置于沸水中加热5min5min。待试管。待试管冷却冷却后，比较两支试管中溶液后，比较两支试管中溶液颜色的变化颜色的变化。实验组实验组对照组对照组水浴水浴加热加热结果分析与评价结果分析与评价1.1.你提取出白色你提取出白色丝状物或沉淀物了状物或沉淀物了吗？用二苯胺？用二苯胺试剂鉴定的定的结果果如何？如何？观察提取的察提取的DNADNA的的颜色，色，如果不是白色如果不是白色丝状物，状物，说明明DNADNA中的中的杂质较多多。二苯胺二苯胺试剂鉴定定呈呈现蓝色色说明明实验基本成功基
28、本成功；如果不呈如果不呈现蓝色，可能的原色，可能的原因有所提取的因有所提取的DNADNA含量低，或者在含量低，或者在实验操作操作过程中出程中出现了失了失误等。等。2.2.你能分析出粗提取的你能分析出粗提取的DNADNA中可能含有哪些中可能含有哪些杂质吗？可能仍然可能仍然含有核蛋白、多糖等含有核蛋白、多糖等杂质杂质。3.3.与其他同学提取的与其他同学提取的DNADNA进行比行比较，看看，看看实验结果有何不同，分析果有何不同，分析产生差异的原因。生差异的原因。本本实验实验可以采取分可以采取分组组的方式的方式进进行。可以行。可以选选取不同的取不同的实验实验材料材料；也可以也可以查查阅资阅资料了解料了解其他提取其他提取DNADNA的方法，的方法，对对同种材料采用不同的方法同种材料采用不同的方法。最后从多方。最后从多方面比面比较实验结较实验结果，如果，如DNADNA的的纯纯度、度、DNADNA的的颜颜色、二苯胺色、二苯胺试剂显试剂显色的深浅等，色的深浅等，看看哪种看看哪种实验实验材料、哪种提取方法的效果更好。材料、哪种提取方法的效果更好。