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1、第四章第四章 药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证何淑华何淑华 吉林大学珠海分院吉林大学珠海分院 第四章第四章 药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证定量分析方法特点定量分析方法特点定量分析样品前处理方法定量分析样品前处理方法药品质量标准分析方法验证药品质量标准分析方法验证1 12 23 3容容量量分分析析法法第一节第一节 定量分析方法特点定量分析方法特点1 1容量分析的计算问题容量分析的计算问题 滴定度的定义：每滴定度的定义：每1ml1ml某摩尔浓度的滴某摩尔浓度的滴定液所相当的被测药物的重量。中国药定液所相当的被测药物的重量。中国药典用典用mgmg表示。表示。
2、（1 1）滴定度（）滴定度（T T）的计算：在容量分析）的计算：在容量分析中，被测物质（中，被测物质（B B）与标准溶液（）与标准溶液（A A）之）之间都按一定的摩尔比进行反应的，反应间都按一定的摩尔比进行反应的，反应可表示为：可表示为：第四章第四章容容量量分分析析法法第一节第一节 定量分析方法特点定量分析方法特点（2 2）百分含量的计算）百分含量的计算直接滴定法：含量直接滴定法：含量%=V%=VT/WT/W100%100%间接滴定法：间接滴定法：不做空白试验时百分含量计算不做空白试验时百分含量计算 做空白试验时百分含量计算做空白试验时百分含量计算 含量含量%=%=（V V空白空白 VB VB
3、）T TF/WF/W100%100%第四章第四章F=F=实际摩尔浓度实际摩尔浓度/规定摩尔浓度规定摩尔浓度光光谱谱分分析析法法第一节第一节 定量分析方法特点定量分析方法特点2.2.分光光度法分光光度法 （1 1）对照品比较法）对照品比较法 D D为稀释倍数。为稀释倍数。第四章第四章光光谱谱分分析析法法第一节第一节 定量分析方法特点定量分析方法特点 （2 2）吸收系数法）吸收系数法 第四章第四章色色谱谱分分析析法法第二节第二节 定量分析方法特点定量分析方法特点 HPLCHPLC法法系统适用性试验系统适用性试验 1 1，色谱柱的理论塔板数，色谱柱的理论塔板数 2 2，分离度，分离度 1.51.53
4、 3，重复性，重复性 对照液，连续进样对照液，连续进样5 5次，次，RSD2.0%RSD2.0%4 4，拖尾因子，拖尾因子 d1d1为极大峰至峰前沿之间的距离。为极大峰至峰前沿之间的距离。T T应在应在0.950.950.950.951.051.051.051.05之间。之间。第四章第四章2.含量测定结果的计算实例含量测定结果的计算实例原料药原料药：百分含量百分含量m测得量测得量m取样取样量量100片剂（相当于标示量的百分数）：片剂（相当于标示量的百分数）：标示量（标示量（%）=每片测得量每片测得量/标示量（标示量（B）X100%X100%非非那那西西丁丁含含量量测测定定：精精密密称称取取本本
5、品品0.3630g加加稀稀盐盐酸酸回回流流1小小时时后后，放放冷冷，用用亚亚硝硝酸酸钠钠液液（0.1010mol/L）滴滴定定，用用去去20.00m1。每每1ml亚亚硝硝酸酸钠钠液液（0.1mol/L）相相当当于于17.92mg的的C10H13O2N。计算非那西丁的含量。计算非那西丁的含量例：精密称取青霉素钾供试品0.4021g，按药典规定用剩余碱量法测定含量。先加入氢氧化钠液(0.1mol/L)25.00ml，回滴时消0.1015mol/l的盐酸液14.20ml，空白试验消耗0.1015mol/l的盐酸液24.68ml。求供试品的含量，每1ml氢氧化钠液(0.1mol/L)相当于37.25m
6、g的青霉素钾。容量分析法（1）直接滴定法（2）剩余滴定法 紫外分光光度法（1）吸收系数法（2）对照法 例：取司可巴比妥钠胶囊（标示量为例：取司可巴比妥钠胶囊（标示量为0.1g）20粒，除去胶囊后粒，除去胶囊后测得内容物总重为测得内容物总重为3.0780g，称取，称取0.1536g，按药典规定用溴量，按药典规定用溴量法测定。加入溴液（法测定。加入溴液（0.1mol/L）25ml，剩余的溴液用硫代硫，剩余的溴液用硫代硫酸钠液（酸钠液（0.1025mol/L）滴定到终点时，用去）滴定到终点时，用去17.94ml。空白试。空白试验用去硫代硫酸钠液验用去硫代硫酸钠液25.00ml。按每。按每1ml溴液（
7、溴液（0.1mol/L）相当相当13.01mg的司可巴比妥钠，计算该胶囊中按标示量表示的百的司可巴比妥钠，计算该胶囊中按标示量表示的百分含量。分含量。注射液：注射液：容量分析法容量分析法（1）直接滴定法）直接滴定法（2）剩余滴定法 Vs供试品的体积（ml）紫外分光光度法（1）吸收系数法）吸收系数法（2）对照法）对照法 中国药典（1990年版）规定维生素B12注射液规格为0.1mgm1，含量测定如下：精密量取本品7.5m1，置25ml量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，混匀，置lcm石英池中，以蒸馏水为空白，在3611nm波长处吸收度为0.593，按 为207计算维生素B12按标示量计算的百分含量 例：
8、用异烟肼比色法测定复方己酸孕酮注射液的含量。当己例：用异烟肼比色法测定复方己酸孕酮注射液的含量。当己酸孕酮对照品的浓度为酸孕酮对照品的浓度为50 g/ml，按中国药典规定显色后在，按中国药典规定显色后在380nm波长处测得吸收度为波长处测得吸收度为0.160。取标示量为。取标示量为250mg/ml(己己酸孕酮酸孕酮)的供试品的供试品2ml配成配成100ml溶液，再稀释溶液，再稀释100倍后，按对倍后，按对照品显色法同样显色，测得吸收度为照品显色法同样显色，测得吸收度为0.154。求供试品中己。求供试品中己酸孕酮的含量为标示量的多少？酸孕酮的含量为标示量的多少？例例：维维生生素素C注注射射液液（
9、规规格格2ml：0.1g）的的含含量量测测定定：精精密密量量取取本本品品2ml，加加水水15ml与与丙丙酮酮2ml，摇摇匀匀，放放置置5分分钟钟，加加稀稀醋醋酸酸4ml与与淀淀粉粉指指示示液液1ml，用用碘碘滴滴定定液液（0.1003mol/L）滴滴定定，至至溶溶液液显显兰兰色色并并持持续续30秒秒钟钟不不褪褪，消消耗耗10.56ml。每每1ml碘碘滴滴定定液液（0.1mol/L）相相当当于于8.806mg的的C6H8O6。计计算算维维生生素素C注射液的标示量注射液的标示量%。第二节第二节 定量分析样品前处理方法定量分析样品前处理方法 Pretreatment of sample used i
10、n quantitative analysis定量分析样品前处理方法定量分析样品前处理方法 概概 述述12概述概述含金属或卤素的药物，含金属或卤素的药物，在分析前需要经过不同在分析前需要经过不同方法处理之后，方可进行测定。处理方法因金属或方法处理之后，方可进行测定。处理方法因金属或卤素在分子中结合的牢固程度而异，如：卤素在分子中结合的牢固程度而异，如：有机卤素有机卤素有机卤素有机卤素药物，药物，药物，药物，所含卤素原子均直接与碳原子相连，但不同所含卤素原子均直接与碳原子相连，但不同药物中卤素所处的位置不同，则与碳原子结合的牢药物中卤素所处的位置不同，则与碳原子结合的牢固程度就有差异。如果卤素和
11、芳环相连接，则结合固程度就有差异。如果卤素和芳环相连接，则结合牢固，与脂肪链的碳原子相连接，则结合不牢固牢固，与脂肪链的碳原子相连接，则结合不牢固。泛影酸泛影酸碘番酸碘番酸碘苯酯碘苯酯 概概 述述 概概 述述磺溴酞钠磺溴酞钠三氯叔丁醇三氯叔丁醇酒石酸锑钾酒石酸锑钾富马酸亚铁富马酸亚铁 概概 述述金属原子不与碳相连金属原子不与碳相连 概概 述述含金属有机药物含金属有机药物卡巴胂卡巴胂金属有机药物金属有机药物金属原子直接与碳原子以共价键相连接金属原子直接与碳原子以共价键相连接定量分析样品前处理方法定量分析样品前处理方法直接测定法含金属或直接测定法含金属或C-MC-M不牢固的有机金属不牢固的有机金属
12、经水解后测定法卤素联脂肪碳链（溶于适当溶剂再水解）经水解后测定法卤素联脂肪碳链（溶于适当溶剂再水解）碱化回流后测定碱化回流后测定 硫酸水解后测定硫酸水解后测定经氧化还原后测定法卤素联芳环牢固（一般用于测碘）经氧化还原后测定法卤素联芳环牢固（一般用于测碘）碱性还原后测定法如泛影酸碱性还原后测定法如泛影酸 酸性还原后测定法如碘番酸酸性还原后测定法如碘番酸 利用药物中可利用药物中可游离游离的金属离子的氧化性测定含量的金属离子的氧化性测定含量不经有机破坏不经有机破坏的分析方法的分析方法:不不经经有有机机破破坏坏的的方方法法 （1 1）金属离子不直接与碳原子相连）金属离子不直接与碳原子相连第四章第四章乳
13、酸钙乳酸钙1 1 直接测定法直接测定法 例例1 1：乳酸钙含量测定：乳酸钙含量测定 0.3g+0.3g+水水100ml 100ml 放冷放冷+NaOH 15ml+NaOH 15ml EDTA EDTA滴定滴定 钙紫红素指示剂钙紫红素指示剂第二节第二节 定量分析样品的前处理方法定量分析样品的前处理方法 样样品品前前处处理理 第四章第四章(2)(2)金属离子不直接与碳原子相连金属离子不直接与碳原子相连富马酸亚铁富马酸亚铁 例例2 2：富马酸亚铁含量测定：富马酸亚铁含量测定 富马酸亚铁溶于热的稀硫酸富马酸亚铁溶于热的稀硫酸,同时同时分解释放出亚铁离子分解释放出亚铁离子,可选用铈量法可选用铈量法进行测
14、定进行测定.邻二氮菲为指示剂邻二氮菲为指示剂.第二节第二节 定量分析样品的前处理方法定量分析样品的前处理方法适用于适用于卤素原子与脂肪链的碳原卤素原子与脂肪链的碳原子子相连相连,结合不牢固药物结合不牢固药物 （1 1）碱水解后测定法碱水解后测定法三氯叔丁醇三氯叔丁醇(乙醇液乙醇液)+NaOH-)+NaOH-加热回流加热回流-NaCl+AgNO3（过量）（过量）-硫氰酸铵滴定硫氰酸铵滴定 不不经经有有机机破破坏坏的的方方法法 第四章第四章2 2 经水解后测定法经水解后测定法 第二节第二节 定量分析样品的前处理方法定量分析样品的前处理方法 不不经经有有机机破破坏坏的的方方法法 第四章第四章 硬脂酸
15、镁与定量硫酸共沸、水解硬脂酸镁与定量硫酸共沸、水解生成硬脂酸和硫酸镁生成硬脂酸和硫酸镁,剩余的酸以氢氧剩余的酸以氢氧化钠滴定化钠滴定.Mg(C17H35COO)2+H2SO4 MgSO4+2 C17HCOOH H2SO4+NaOH Na2SO4+H2O 适用于适用于金属原子与脂肪链的碳原子金属原子与脂肪链的碳原子相连相连,结合不牢固药物结合不牢固药物.（2 2）用硫酸水解后测定法用硫酸水解后测定法第二节第二节 定量分析样品的前处理方法定量分析样品的前处理方法 不不经经有有机机破破坏坏的的方方法法 3 3 经氧化还原后测定法经氧化还原后测定法（1 1）碱性还原后测定）碱性还原后测定 卤素结合于芳
16、环上卤素结合于芳环上,由于分子碘由于分子碘的结合较牢固的结合较牢固,需在碱性溶液中加还需在碱性溶液中加还原剂（如锌粉）原剂（如锌粉）,加热回流加热回流,使碳使碳-碘碘键断裂键断裂,形成无机碘化物后测定形成无机碘化物后测定.第四章第四章第二节第二节 定量分析样品的前处理方法定量分析样品的前处理方法泛影酸（卤素原子与芳环相连泛影酸（卤素原子与芳环相连,化学键牢固）化学键牢固）+3NaI+2CH3COONa+3Na2ZnO2+3H2O 第四章第四章ZnZn粉粉NaI+AgNO3 AgI +NaNO3曙红钠为吸附指示剂曙红钠为吸附指示剂 黄色黄色玫瑰红色玫瑰红色 不不经经有有机机破破坏坏的的方方法法
17、（2 2）酸性还原后测定）酸性还原后测定在醋酸酸性条件下加还原剂锌在醋酸酸性条件下加还原剂锌粉粉,加热回流加热回流,使碳使碳-碘键断裂碘键断裂,形成形成无机碘化物后用银量法测定无机碘化物后用银量法测定.如：碘番酸含量测定如：碘番酸含量测定第四章第四章第二节第二节 定量分析样品的前处理方法定量分析样品的前处理方法经有机破坏经有机破坏的分析方法的分析方法湿法破坏湿法破坏HNO3-HClO4生物样品的破坏，金属以高价态存在生物样品的破坏，金属以高价态存在HNO3-H2SO4用于大多数有机物破坏，碱土金属不适合用于大多数有机物破坏，碱土金属不适合H2SO4-MSO4金属以低价态存在，用于含砷、锑、氮，
18、金属以低价态存在，用于含砷、锑、氮，凯氏定氮法凯氏定氮法凯氏定氮法以“氮测定法”收录于2010版药典附录中。分为：第一法（常量法常量法）凯氏烧瓶500ml第二法（半微量法半微量法）凯氏烧瓶3050ml应用：ChP主要用于测定含有氨基氨基或酰胺结酰胺结构构的药物的含量。干法破坏干法破坏 氧瓶燃烧法氧瓶燃烧法氧瓶燃烧法原理：氧瓶燃烧法原理：系系将将有有机机药药物物放放入入充充满满氧氧气气的的密密闭闭的的燃燃烧烧瓶瓶中中进进行行燃燃烧烧，并并将将燃燃燃燃烧烧烧烧所所所所产产产产生生生生的的的的欲欲欲欲测测测测物物物物质质质质吸吸收收于于适适适适当当当当的的的的吸吸吸吸收收收收液液液液中中，然然后后根
19、根据据欲欲欲欲测测测测物物物物质质质质的的的的性性性性质质质质，采采用用适适宜宜的的分分析析方方法法进进行行鉴鉴别别、检检查查或或测测定定含含含含卤卤卤卤素素素素有有有有机机机机药药药药物物物物或或含含含含硫硫硫硫、氮氮氮氮、硒硒硒硒等等其其它它元元素素的有机药物。的有机药物。本法是快速分解有机物的简单方法，它不需本法是快速分解有机物的简单方法，它不需要复杂设备，就能使有机化合物中的待测元素定要复杂设备，就能使有机化合物中的待测元素定量分解成离子型。该方法被各国药典所收载。量分解成离子型。该方法被各国药典所收载。1仪器装置仪器装置燃烧瓶为燃烧瓶为500ml、1000ml、或、或2000ml磨口
20、、硬质玻璃锥形瓶，瓶塞应严密、空磨口、硬质玻璃锥形瓶，瓶塞应严密、空心、底部熔封铂丝一根（直径为心、底部熔封铂丝一根（直径为1mm），铂丝下），铂丝下端做成网状或螺旋状，长度约为瓶身长度的端做成网状或螺旋状，长度约为瓶身长度的23，如图如图空心空心A.燃烧瓶燃烧瓶B.铂丝网铂丝网C.D.盛固体样品滤纸及其折叠法盛固体样品滤纸及其折叠法E.F.G.称取液体样品方法称取液体样品方法7mm50mm30mm尾部尾部7mm13mm20mm25mm35 6mm16 6mm滤纸滤纸滤纸滤纸AGFEDCB氧瓶燃烧装置及称样方法氧瓶燃烧装置及称样方法氧瓶燃烧法氧瓶燃烧法样品样品吸收液吸收液测定方法测定方法含含氟
21、氟有机药物有机药物H2OpH4.3HAc-NaAcBuffer茜素氟蓝茜素氟蓝分光光度法分光光度法含含氯氯有机药物有机药物NaOH溶液溶液银量法银量法汞量法汞量法分光法分光法含含溴溴有机药物有机药物H2O-NaOHSO2银量法银量法分光法分光法含含碘碘有机药物有机药物NaOH-H2O银量法银量法碘量法碘量法SO2汞量法汞量法分光法分光法经经有有机机破破坏坏的的方方法法卤素化合物的燃烧产物卤素化合物的燃烧产物氟化物、氯化物氟化物、氯化物 氟或氯以离子状态氟或氯以离子状态存在存在,吸收后吸收后可直接测定可直接测定.第四章第四章第二节第二节 定量分析样品的前处理方法定量分析样品的前处理方法经经有有机
22、机破破坏坏的的方方法法溴化物溴化物碘化物碘化物 溴化物或碘化物溴化物或碘化物,燃烧后以多种燃烧后以多种价态存在价态存在,吸收后应转化为统一价态吸收后应转化为统一价态再测定再测定.第四章第四章第二节第二节 定量分析样品的前处理方法定量分析样品的前处理方法经经有有机机破破坏坏的的方方法法（七）实例（七）实例-碘苯酯的含量测定碘苯酯的含量测定第四章第四章燃烧燃烧吸收吸收加溴加溴加甲酸加甲酸加加KI滴定滴定 第二节第二节 定量分析样品的前处理方法定量分析样品的前处理方法经经有有机机破破坏坏的的方方法法第四章第四章将将-、2氧化为氧化为O3 2Na+Br2=2NaBr+2 2+5Br2+6H2O=2HO
23、3+10HBr3 3 加甲酸：除去过量的溴加甲酸：除去过量的溴2 2 溴溴-醋酸氧化剂：醋酸氧化剂：2 2+2Na2S+2Na2S2 20 03 3 2HNa +Na+Na2 2S S4 40 06 64 4 加加KI滴定滴定 K +O3 3 3 3 2 2+H2OR-CO2+H2O+Na+2+NaO3+NaCl1 1 燃烧燃烧吸收吸收O第二节第二节 定量分析样品的前处理方法定量分析样品的前处理方法碘苯酯含量测定碘苯酯含量测定取本品约取本品约20mg，精密称定，照氧瓶燃烧法进行有机破坏，精密称定，照氧瓶燃烧法进行有机破坏，用用NaOHT.S.2ml与与H2O10ml为吸收液，待吸收完全后，加为
24、吸收液，待吸收完全后，加溴醋酸溴醋酸溶液溶液10ml，密塞，振摇放置数分钟，加，密塞，振摇放置数分钟，加甲酸甲酸约约1ml，用水洗涤瓶口，并通入空气流约用水洗涤瓶口，并通入空气流约35min，以除去剩余的溴蒸，以除去剩余的溴蒸气，加气，加KI2g，密塞，摇匀，用，密塞，摇匀，用Na2S2O3液液(0.02mol/L)滴定，滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每定的结果用空白试验校正。每1ml的硫代硫酸钠液的硫代硫酸钠液(0.02mol/L)相当于相当于1.388mg的的C19H29IO2 药品质量
25、标准分析方法验证药品质量标准分析方法验证p指导原则指导原则p药品质量标准分析方法验证药品质量标准分析方法验证p药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则指导原则p药物稳定性试验药物稳定性试验指导原则指导原则p缓释、控释制剂缓释、控释制剂指导原则指导原则p微囊、微球与脂质体制剂微囊、微球与脂质体制剂指导原则指导原则p细菌内毒素检查法应用细菌内毒素检查法应用指导原则指导原则第三节第三节 药品质量标准分析方法验证药品质量标准分析方法验证目的：证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求 效能指标:评价分析方法的尺度评价分析
26、方法的尺度 用用途途 （一）药品质量标准起草时，分析方法（一）药品质量标准起草时，分析方法需经验证。需经验证。（二）药物合成方法变更、制剂的组分（二）药物合成方法变更、制剂的组分变更、原分析方法进行修订时，分析方变更、原分析方法进行修订时，分析方法需经验证。法需经验证。方法验证过程和结果均应记载在药品方法验证过程和结果均应记载在药品标准起草和修订说明中。标准起草和修订说明中。第四章第四章第三节第三节 药品质量标准分析方法验证药品质量标准分析方法验证验验证证分分析析项项目目1 1 鉴别试验、杂质定量或限度检查鉴别试验、杂质定量或限度检查.2原料药或制剂中有效成分含量测定原料药或制剂中有效成分含量
27、测定.3 3 制剂中其他成分（降解产物、防制剂中其他成分（降解产物、防 腐剂等）的测定腐剂等）的测定.4 4 药品溶出度、释放度等功能检查药品溶出度、释放度等功能检查.第四章第四章第三节第三节 药品质量标准分析方法验证药品质量标准分析方法验证验验证证内内容容1 1 准确度准确度2 2 精密度精密度3 3 专属性专属性4 4 检测限检测限5 5 定量限定量限6 6 线线 性性7 7 范范 围围8 8 耐用性耐用性第四章第四章第三节第三节 药品质量标准分析方法验证药品质量标准分析方法验证(1)(1)准确度准确度（accuracyaccuracy）：）：测量值与真实值接近的程度测量值与真实值接近的程
28、度表表示示:回收率回收率测定方法：回收试验测定方法：回收试验加样回收试验加样回收试验一一 准准确确度度 回收试验回收试验 空白空白+已知量已知量A A的对照品（或标准品）测的对照品（或标准品）测定，测定值为定，测定值为MM第四章第四章第三节第三节 药品质量标准分析方法验证药品质量标准分析方法验证加样回收试验加样回收试验 已准确测定药物含量已准确测定药物含量P的真实样的真实样品品+已知量已知量A的对照品（或标准品）测定，测定的对照品（或标准品）测定，测定值为值为(2)精密度精密度（precision precision）：）：定定 义义:同一样品多次测量值之间相互接近的程度同一样品多次测量值之间
29、相互接近的程度表表 示：示：标准偏差标准偏差(s),相对标准偏差相对标准偏差(RSD)重复性重复性:同一实验室同一实验室,同一人多次测定的精密度同一人多次测定的精密度中间精密度中间精密度:同一实验室，不同人，不同仪器测定的精密度同一实验室，不同人，不同仪器测定的精密度重现性重现性:不同实验室，不同人测定的精密度不同实验室，不同人测定的精密度(3)(3)专属性专属性（specificityspecificity）:指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性。被测物的特性。药物分析中考
30、虑药物分析中考虑:杂质、降解产物、相关物质、制剂辅料杂质、降解产物、相关物质、制剂辅料.生物药物分析中考虑生物药物分析中考虑:内源性物质干扰内源性物质干扰,代谢产物的干扰代谢产物的干扰,同时服同时服药时的干扰药时的干扰.(4)检测限检测限检测限检测限（limitofdetectionlimitofdetection，LODLOD）：）：）：）：药物能被药物能被检出检出检出检出的的最低浓度最低浓度最低浓度最低浓度(g/ml)测测定定:信噪比法信噪比法信噪比法信噪比法(S:N=3:1)(5)定量限定量限定量限定量限（1imitofquantitation1imitofquantitation，LO
31、QLOQ）：）：）：）：药物能被定量测出的最低浓度药物能被定量测出的最低浓度(g/ml)测测定定:信噪比法信噪比法信噪比法信噪比法(S:N=10:1)第三节第三节 药品质量标准分析方法验证药品质量标准分析方法验证 -性能指标性能指标线性线性(linearity)指在一定的浓度范围内指在一定的浓度范围内,测试结果测试结果与供试物浓度呈正比关系的程度与供试物浓度呈正比关系的程度.六六 线线 性性第四章第四章方法方法 用作图法或计算回归方程建立用作图法或计算回归方程建立.Y=ax+b r=0.999X Y=ax+b r=0.999X浓度浓度 应包括一定梯度的应包括一定梯度的5-85-8个浓度个浓度.
32、对于对于含量测定要求浓度上限为样品最高浓度的含量测定要求浓度上限为样品最高浓度的120%,120%,下限为样品最低浓度的下限为样品最低浓度的80%,80%,但应高但应高于于LOQ.LOQ.第三节第三节 药品质量标准分析方法验证药品质量标准分析方法验证七七 范范 围围 指达到一定精密度、准确度和线性指达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测试方法适用的高低限浓度的条件下，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。或量的区间。第四章第四章原料药和制剂含量测试浓度原料药和制剂含量测试浓度 80%120%80%120%制剂含量均匀度测试浓度制剂含量均匀度测试浓度 70%130%70%130%溶出度或释放度的
33、溶出量溶出度或释放度的溶出量 限度限度20%20%第三节第三节 药品质量标准分析方法验证药品质量标准分析方法验证耐用性耐用性(robusness)目的目的 为常规检验提供依据为常规检验提供依据.体现耐用性因素：体现耐用性因素：被测溶液的稳定性被测溶液的稳定性 样品提取次数、时间、试剂来源样品提取次数、时间、试剂来源 流动相的组成，不同品牌的色谱柱等流动相的组成，不同品牌的色谱柱等八八 耐耐 用用 性性第四章第四章 指在指在测定条件稍有变动时测定条件稍有变动时测定条件稍有变动时测定条件稍有变动时,分析相同样分析相同样分析相同样分析相同样品所测得的试验结果的重现程度品所测得的试验结果的重现程度品所
34、测得的试验结果的重现程度品所测得的试验结果的重现程度.第三节第三节 药品质量标准分析方法验证药品质量标准分析方法验证检验项目和验证内容：检验项目和验证内容：项目内容项目内容 鉴别鉴别杂质测定杂质测定含量测定及溶出含量测定及溶出量测定量测定定量定量限度限度准确度准确度精密度精密度重复性重复性中间精密度中间精密度专属性专属性检测限检测限定量限定量限线性线性范围范围耐用性耐用性已有重现已有重现性验证，性验证，不需验证不需验证中间精密中间精密度度如一种方如一种方法不够专法不够专属，可用属，可用其他分析其他分析方法予以方法予以补充补充视具体情视具体情况予以验况予以验证证1用于鉴别方法用于鉴别方法专属性专
35、属性耐用性耐用性2 2 用于原料药中主成分或制剂中有效用于原料药中主成分或制剂中有效 成分含量测定方法成分含量测定方法除不需检测限、定量限外其余除不需检测限、定量限外其余6 6项项 验验证证方方法法应应用用3 3 原料药中杂质测定或制剂中降解产原料药中杂质测定或制剂中降解产 物等其他杂质测定方法物等其他杂质测定方法 -除检测限外其余除检测限外其余7 7项项用于限度检查用于限度检查-专属性专属性 耐用性耐用性 检测限检测限第四章第四章第三节第三节 药品质量标准分析方法验证药品质量标准分析方法验证第四节第四节 生物样品分析方法的基本要求生物样品分析方法的基本要求一、常用样品的种类一、常用样品的种类
36、二、生物样品分析前处理技术二、生物样品分析前处理技术三、定量分析方法验证三、定量分析方法验证第四节第四节 生物样品分析方法的基本要求生物样品分析方法的基本要求一一生生物物样样品品的的种种类类第四章第四章生物样本生物样本：生物体的任何脏器、组织、生物体的任何脏器、组织、体液均可作为生物样本体液均可作为生物样本.常用样本常用样本:血液（血浆、血清血液（血浆、血清 ）、）、尿液、唾液、毛发尿液、唾液、毛发二二生生物物样样品品的的处处理理（一）去蛋白质（一）去蛋白质第四章第四章 加入与水混溶的有机溶剂加入与水混溶的有机溶剂 蛋白质脱水沉淀蛋白质脱水沉淀 加加入入水水溶溶性性的的有有机机溶溶剂剂；可可使
37、使蛋蛋白白质质的的分分子子内内及及分分子子间间的的氢氢键键发发生生变变化化而而使使蛋蛋白白质质凝凝聚聚，使使与与蛋蛋白白质质结结合合的的药药物物释释放放出出来来。常常用用的的水水溶溶性性有有机机溶溶剂剂有有：乙乙腈腈、甲甲醇醇、乙乙醇醇、丙丙醇醇、丙丙酮酮、四四氢氢呋呋喃喃等等。含含药药物物的的血血浆浆或或血血清清与与水水溶溶性性有有机机溶溶剂剂的的体体积积比比为为11（1 13 3）时，就可以将）时，就可以将9090以上的蛋白质除去以上的蛋白质除去。第四节第四节 生物样品分析方法的基本要求生物样品分析方法的基本要求二二生生物物样样品品的的处处理理第四章第四章 加入中性盐加入中性盐 “盐析盐析
38、”沉淀蛋白质沉淀蛋白质 加入强酸加入强酸 与与蛋蛋白白质质阳阳离离子子(铵铵基基)形形成不溶性盐沉淀成不溶性盐沉淀 加入重金属盐（锌盐、铜盐）加入重金属盐（锌盐、铜盐）与与蛋蛋白白质质阴阴离离子子(羧羧基基)形形成不溶性盐沉淀成不溶性盐沉淀第四节第四节 生物样品分析方法的基本要求生物样品分析方法的基本要求二二生生物物样样品品的的处处理理第四章第四章 酶水解法酶水解法 蛋白分解酶分解蛋白质蛋白分解酶分解蛋白质适适用用于于与与蛋蛋白白结结合合牢牢固固、且且对对酸酸不稳定的药物。不稳定的药物。枯草菌溶素枯草菌溶素-碱性蛋白酶碱性蛋白酶 pH 7.0pH 7.011.011.0 第四节第四节 生物样品
39、分析方法的基本要求生物样品分析方法的基本要求二二生生物物样样品品的的处处理理 尿中药物多数呈缀合状态尿中药物多数呈缀合状态,为测定为测定尿液中药物总量尿液中药物总量,需将需将缀合物中药物释缀合物中药物释出出.酸水解酸水解 酶水解酶水解第四章第四章 （二）缀合物的水解（二）缀合物的水解第四节第四节 生物样品分析方法的基本要求生物样品分析方法的基本要求质控样品（质控样品（QC）在在空白生物介质空白生物介质中加入中加入已知量待已知量待测物的标准物质制成的样品测物的标准物质制成的样品，均匀放均匀放入待测生物样品序列中，入待测生物样品序列中，用于用于监测生监测生物分析方法的效能和评价每一分析批物分析方法
40、的效能和评价每一分析批中未知样品分析结果的完整性和正确中未知样品分析结果的完整性和正确性。确保定量测定的准确度。性。确保定量测定的准确度。定量分析方法的验证定量分析方法的验证 -生物样品分析生物样品分析（一）特异性（专属性、专一性）一）特异性（专属性、专一性）方法的特异性系用以证明使用该方法所测的物方法的特异性系用以证明使用该方法所测的物质是预期的待测物，所含内源性物质和相应代谢物、质是预期的待测物，所含内源性物质和相应代谢物、降解产物不得干扰对样品的测定。降解产物不得干扰对样品的测定。（二）标准曲线（二）标准曲线r0.9900，至少，至少6个浓度，不许外延个浓度，不许外延（三）（三）最低定量
41、限最低定量限LLOQLLOQ（符合准确度、精密度要求的最低符合准确度、精密度要求的最低药物浓度药物浓度）3535倍倍t t1/21/2，或，或C Cmax max 的的1/101/101/201/20药物浓度的测定药物浓度的测定（四）（四）精密度和准确度精密度和准确度 一般情况下一般情况下RRRR在在85%85%115%115%（ER15%ER15%）LLOQ LLOQ 附近附近RRRR在在80%80%120%120%（ER20%ER20%）（五）样品稳定性（五）样品稳定性室温、冻融、冰冻长期室温、冻融、冰冻长期（六）提取回收率（六）提取回收率 R=R=A(A(A(A(质控质控质控质控)/A(
42、)/A()/A()/A(对照对照对照对照)X100%X100%X100%X100%一般一般高、中、低高、中、低高、中、低高、中、低3 3 3 3个浓度的个浓度的提取回收率提取回收率提取回收率提取回收率应一致，应一致，中、高中、高中、高中、高RSDRSDRSDRSD不大于不大于不大于不大于15%15%15%15%，低浓度低浓度低浓度低浓度RSDRSDRSDRSD不大于不大于不大于不大于20%20%20%20%定量分析方法的验证定量分析方法的验证 -生物样品分析生物样品分析三三定定量量分分析析方方法法验验证证第四章第四章（七）质量控制（七）质量控制 每个每个未知样品未知样品未知样品未知样品一般测定
43、一次，必要时进一般测定一次，必要时进行复测，每批生物样品测定时应建立新的标行复测，每批生物样品测定时应建立新的标准曲线，并准曲线，并随行测定随行测定随行测定随行测定高中低高中低高中低高中低3 3 3 3个浓度个浓度个浓度个浓度的质控的质控的质控的质控样品。样品。样品。样品。质控样品数应大于未知样品总数的质控样品数应大于未知样品总数的5%5%5%5%。质控样品的测定结果的质控样品的测定结果的RSDRSDRSDRSD一般应小于一般应小于一般应小于一般应小于15 15 15 15%。低浓度点的低浓度点的低浓度点的低浓度点的RSDRSDRSDRSD应小于应小于应小于应小于20 20 20 20%。第四
44、节第四节 生物样品分析方法的基本要求生物样品分析方法的基本要求（八）未知体内样品浓度超出定量范围的处理（八）未知体内样品浓度超出定量范围的处理1、浓度高于、浓度高于ULOQ 用空白生物介质稀释，依法重新测定；用空白生物介质稀释，依法重新测定；制备相适应的质控样品，同法稀释测定，确认制备相适应的质控样品，同法稀释测定，确认稀释的有效性。稀释的有效性。2、浓度低于、浓度低于LLOQ 增加未知样品的体积，使制备样品的浓增加未知样品的体积，使制备样品的浓度高于度高于LLOQ。相同条件下制备质控样品，验。相同条件下制备质控样品，验证方法的特异性不降低，准确度精密度符合要证方法的特异性不降低，准确度精密度
45、符合要求。求。样品样品 固相净化固相净化 及及 反相高效液相色谱法反相高效液相色谱法测定血浆中茶碱测定血浆中茶碱血浆样品血浆样品 净化后空白血浆净化后空白血浆 净化前空白血浆净化前空白血浆Column Zorbax C18 5m 2.5cm4.6mm 254nmPrecolumn YWG-ODS 9-11m 54.6mmMobile Phase:甲醇-醋酸钠(0.05mol/L pH3.0)500512 8 4 0min茶碱咖啡因12 8 4 0min12 8 4 0min50 100 150 200252015105茶碱(g/ml)(min)五例病人血浆茶碱五例病人血浆茶碱浓度测定浓度测定6
46、.412.8 19.225.6 3232.41.81.20.60茶碱(g/ml)标准曲线标准曲线Y=9.566 10-2X+6.153 10-3r=0.9995练习题练习题1.1.精密度是指精密度是指 A.A.测得的测量值与真值接近的程度测得的测量值与真值接近的程度 B.B.测得的一组测量值彼此符合的程度测得的一组测量值彼此符合的程度 C.C.表示该法测量的正确性表示该法测量的正确性 D.D.对供试物准确而专属的测定能力对供试物准确而专属的测定能力 E.E.在各种正常试验条件下，对同一样品分析所得结果的准确程度在各种正常试验条件下，对同一样品分析所得结果的准确程度2 2精密度是指该法精密度是指
47、该法 A.A.测得的测量值与真值接近的程度测得的测量值与真值接近的程度 B.B.测得的测量值与回收率接近的程度测得的测量值与回收率接近的程度 C.C.测量的正确性测量的正确性 D.D.测得的一组测量值彼此符合的程度测得的一组测量值彼此符合的程度 E.E.对供试物准确而专属的测定能力对供试物准确而专属的测定能力 （BB）（DD）3 3在药物分析中，精密度是表示该法的在药物分析中，精密度是表示该法的 A.A.测量值与真值接近程度测量值与真值接近程度 B.B.一组测量值彼此符合程度一组测量值彼此符合程度 C.C.正确性正确性 D.D.重现性重现性 E.E.专属性专属性4 4药物杂质限量检查所要求的效
48、能指标为药物杂质限量检查所要求的效能指标为 A.A.准确度准确度 B.B.精密度精密度 C.C.专属性专属性 D.D.检测限检测限 E.E.耐用性耐用性 （BDBD）（CDECDE）5.5.应要求的效能指标：应要求的效能指标：A.A.检测限检测限 B.B.定量限定量限 C.C.两者均要求两者均要求 D.D.两者均不要求两者均不要求(1)(1)含量测定方法评估含量测定方法评估(2)(2)杂质限量检查杂质限量检查(3)(3)杂质定量测定杂质定量测定(4)(4)溶出度测定溶出度测定(5)(5)中间体含量测定中间体含量测定（DDD）（AA）（BB）（DD）（DD）6 6评价药物分析所用的测定方法的效能
49、指标有评价药物分析所用的测定方法的效能指标有A.A.含量均匀度含量均匀度 B.B.精密度精密度 C.C.准确度准确度 D.D.耐用性耐用性 E.E.溶出度溶出度7(1-5)7(1-5)A.A.精密度精密度 B.B.定量限定量限 C.C.两者皆是两者皆是 D.D.两者皆不是两者皆不是(1)(1)某法测得一组测量值间彼此符合程度某法测得一组测量值间彼此符合程度(2)(2)测量值和真值接近的程度测量值和真值接近的程度(3)(3)测定结果的重现性测定结果的重现性(4)(4)可定量测得被测药物的最低水平参数可定量测得被测药物的最低水平参数(5)(5)药物分析方法的效能指标药物分析方法的效能指标（BCDB
50、CD）（AA）（DD）（AA）（BB）（CC）8.8.相对标准差表示相对标准差表示A.A.准确度准确度 B.B.回收率回收率 C.C.精密度精密度 D.D.纯净度纯净度 E.E.限度限度9.9.精密度的一般表示方法有精密度的一般表示方法有A.A.相对标准差相对标准差 B.B.相对平均偏差相对平均偏差 C.C.相对误差相对误差 D.D.绝对误差绝对误差 E.E.标准差标准差 10.10.检测限的表示方法有检测限的表示方法有A.A.百分数百分数 B.ppm B.ppm C.ppb D.C.ppb D.g E.ngg E.ng（CC）(AE)(AE)（ABCABC）11.11.用信噪比法表示检测限时