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1、1第四章第四章 药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证2 第四章第四章 药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证定量分析样品前处理方法定量分析样品前处理方法定量分析方法特点定量分析方法特点药品质量标准分析方法验证药品质量标准分析方法验证1 12 23 33第一节、定量分析样品前处理方法第一节、定量分析样品前处理方法 Pretreatment of sample used in quantitative analysis定量分析样品前处理方法定量分析样品前处理方法 概概 述述124泛影酸泛影酸碘番酸碘番酸碘苯酯碘苯酯 概概 述述本节重点：含金属或含卤素、氮硫磷等特殊元素
2、的药物。本节重点：含金属或含卤素、氮硫磷等特殊元素的药物。5磺溴酞钠磺溴酞钠三氯叔丁醇三氯叔丁醇6酒石酸锑钾酒石酸锑钾富马酸亚铁富马酸亚铁含金属有机药物含金属有机药物7定量分析样品前处理方法定量分析样品前处理方法直接测定法直接测定法含金属原子或含金属原子或C-MC-M不牢固的有机金属原子不牢固的有机金属原子 水溶液中直接电离水溶液中直接电离经水解后测定法经水解后测定法卤素联脂肪碳链（溶于适当溶剂再水解）卤素联脂肪碳链（溶于适当溶剂再水解）直接回流后测定直接回流后测定 碱化回流后测定（碱化回流后测定（例：三氯叔丁醇的含量测定例：三氯叔丁醇的含量测定）硫酸水解后测定（硫酸水解后测定（例：十一烯酸锌
3、的含量测定例：十一烯酸锌的含量测定）经氧化还原后测定法经氧化还原后测定法卤素联芳环牢固（一般用于测碘）卤素联芳环牢固（一般用于测碘）碱性还原后测定法如泛影酸碱性还原后测定法如泛影酸 酸性还原后测定法如碘番酸酸性还原后测定法如碘番酸 利用药物中可利用药物中可游离游离的金属离子的氧化性测定含量：在碱性溶液的金属离子的氧化性测定含量：在碱性溶液中加还原剂（如锌粉）回流，使中加还原剂（如锌粉）回流，使C-IC-I键破坏键破坏不经有机破坏不经有机破坏的分析方法的分析方法:8经有机破坏经有机破坏的分析方法的分析方法 含金属原子及卤素、氮、硫、磷等有机药物结构中待测原子与含金属原子及卤素、氮、硫、磷等有机药
4、物结构中待测原子与C C原原子结合牢固。子结合牢固。湿法破坏：湿法破坏：适用于含氮有机合成药物和生物制品中氮、磷、硫柳汞、适用于含氮有机合成药物和生物制品中氮、磷、硫柳汞、氯化钠分析的前处理。氯化钠分析的前处理。H2SO4-HClO4：氧化剂和分解剂氧化剂和分解剂H2SO4-HNO3：H2SO4-MSO4：金属以高价态存在金属以高价态存在H2SO4-KMnO4：凯氏定氮法：略凯氏定氮法：略干法破坏：干法破坏：适用于适用于卤素、硫、磷等有机药物中硒和砷盐的分析卤素、硫、磷等有机药物中硒和砷盐的分析 高温炽灼法：用于卤素。加高温炽灼法：用于卤素。加无水碳酸钠或氧化镁等，注意温度无水碳酸钠或氧化镁等
5、，注意温度氧瓶燃烧法：待测药物有机结构氧瓶燃烧法：待测药物有机结构+O2=CO2+H2O，待测元素转变成氧，待测元素转变成氧化物。化物。9A.燃烧瓶燃烧瓶B.铂丝网铂丝网C.D.盛固体样品滤纸及其折叠法盛固体样品滤纸及其折叠法E.F.G.称取液体样品方法称取液体样品方法7mm50mm30mm尾尾部部7mm13mm20mm25mm35 6mm16 6mm滤滤纸纸滤滤纸纸AGFEDCB氧瓶燃烧装置及称样方法氧瓶燃烧装置及称样方法10氧瓶燃烧法氧瓶燃烧法样品样品吸收液吸收液测定方法测定方法含含氟氟有机药物有机药物H2OpH4.3HAc-NaAcBuffer茜素氟蓝茜素氟蓝分光光度法分光光度法含含氯氯
6、有机药物有机药物NaOH溶液溶液银量法银量法汞量法汞量法分光光度法分光光度法含含溴溴有机药物有机药物H2O2-NaOH液液或或NaOH液液-银量法银量法分光法分光法硫酸肼饱和液硫酸肼饱和液含含碘碘有机药物有机药物NaOH液液-银量法银量法碘量法碘量法硫酸肼饱和液硫酸肼饱和液汞量法汞量法分光法分光法11碘苯酯含量测定碘苯酯含量测定取本品约取本品约20mg，精密称定，照氧瓶燃烧法进行有机破坏，用，精密称定，照氧瓶燃烧法进行有机破坏，用NaOHT.S.2ml与与H2O10ml为吸收液，待吸收完全后，加为吸收液，待吸收完全后，加溴醋酸溴醋酸溶液溶液10ml，密，密塞，振摇放置数分钟，加塞，振摇放置数分
7、钟，加甲酸甲酸约约1ml，用水洗涤瓶口，并通入空气流约，用水洗涤瓶口，并通入空气流约35min，以除去剩余的溴蒸气，加，以除去剩余的溴蒸气，加KI2g，密塞，摇匀，用，密塞，摇匀，用Na2S2O3液液(0.02mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml的硫代硫酸钠液的硫代硫酸钠液(0.02mol/L)相当相当于于1.388mg的的C19H29IO21213日本和英国生物学家共同获得日本和英国生物学家共同获得诺贝尔生理学或医学奖诺贝尔生理学或医学奖 山中
8、伸弥（山中伸弥（Shinya Yamanaka），），1962年出生于日本大阪府，年出生于日本大阪府，日本医学家，京都大日本医学家，京都大学再生医科研究所干学再生医科研究所干细胞生物系教授，大细胞生物系教授，大阪市立大学医学博士阪市立大学医学博士(1993年年)，美国加利，美国加利福尼亚州旧金山心血福尼亚州旧金山心血管疾病研究所高级研管疾病研究所高级研究员。究员。约翰约翰戈登戈登(JohnB.Gurdon)，1933年出生于英国汉年出生于英国汉普郡。普郡。1971年当选英年当选英国皇家学会会员，国皇家学会会员，1983年进入剑桥大学年进入剑桥大学动物系，担任细胞生动物系，担任细胞生物学讲座教授
9、，现任物学讲座教授，现任职于剑桥大学戈登学职于剑桥大学戈登学院。院。1989年获得以色年获得以色列沃尔夫医学奖。被列沃尔夫医学奖。被誉为动物细胞全能型誉为动物细胞全能型研究的先驱。研究的先驱。14151617近年诺贝尔生理学或医学奖近年诺贝尔生理学或医学奖得主及其主要成就得主及其主要成就2011年，美国科学家布鲁斯博伊特勒、法国科学家朱尔斯霍夫曼和加拿大科学家拉尔夫斯坦曼。他们发现了免疫系统激活的关键原理，这使人们对人体免疫系统的认识有了革命性的改变。2010年，英国生理学家罗伯特爱德华兹。他在体外受精技术领域做出的开创性贡献。2009年，美国科学家伊丽莎白布莱克本、卡萝尔格雷德和杰克绍斯塔克
10、。他们解决了一个生物学的重要课题，即染色体在细胞分裂过程中是怎样实现完全复制，同时染色体如何受到保护而不至于发生降解。18两位美国科学家分享两位美国科学家分享2012年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖 美国科学家罗伯特J勒夫科维兹(Robert J.Lefkowitz)与科学家布莱恩K卡比尔卡(Brian K.Kobilka)因在G蛋白偶联受体方面的研究获得2012年诺贝尔化学奖。人物介绍 罗伯特J勒夫科维兹，1943年04月15日出生在纽约，毕业于哈佛大学，研究领域为受体生物学与生物化学，目前在杜克大学任职，在霍华德休斯医学研究所从事研究工作。2007年获得美国国家科学奖章。布莱恩科比尔卡，195
11、5年出生，美国斯坦福大学医学院教授，分子细胞生理学和医学部博士。他是ConfometRx(一家专注于G-蛋白偶联受体的生物技术公司)的共同创办人。他在2011年成为美国国家科学院院士。19 G蛋白偶联受体是一种与三聚体G蛋白偶联的细胞表面受体。含有7个穿膜区，是迄今发现的最大的受体超家族，其成员有1000多个。与配体结合后通过激活所偶联的G蛋白，启动不同的信号转导通路并导致各种生物效应。G蛋白偶联受体蛋白偶联受体20近年诺贝尔化学奖得主及其主要成就回顾近年诺贝尔化学奖得主及其主要成就回顾2011年，以色列科学家达尼埃尔谢赫特曼因发现准晶体而获奖。准晶体是一种介于晶体和非晶体之间的固体，准晶体的
12、发现不仅改变了人们对固体物质结构的原有认识，由此带来的相关研究成果也广泛应用于材料学、生物学等多种有助于人类生产、生活的领域。2010年，美国科学家理查德赫克与日本科学家根岸荣一和铃木章因在有机合成领域中钯催化交叉偶联反应方面的卓越研究成果而获奖。这一成果广泛应用于制药、电子工业和先进材料等领域，可以使人类造出复杂的有机分子。2009年，英国科学家文卡特拉曼拉马克里希南、美国科学家托马斯施泰茨和以色列科学家阿达约纳特因对“核糖体的结构和功能”研究的贡献而获奖。21容量分析法：容量分析法：将已知浓度的滴定液（标准物质溶液）由滴定管滴加到将已知浓度的滴定液（标准物质溶液）由滴定管滴加到被测药物的溶
13、液中，直至滴定液与被测药物反应完全（用适当方法被测药物的溶液中，直至滴定液与被测药物反应完全（用适当方法指示），然后根据滴定液的浓度和被消耗的体积，按化学计量关系指示），然后根据滴定液的浓度和被消耗的体积，按化学计量关系计算出被测药物的含量。计算出被测药物的含量。光谱分析方法光谱分析方法UV-VIS分光光度法分光光度法荧光分析法荧光分析法色谱分析法色谱分析法HPLC法法GC法法液质联用法液质联用法第二节、定量分析方法的特点第二节、定量分析方法的特点22目的：证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求 效能指标：评价分析方法的尺度评价分析方法的尺度效能指标内
14、容包括:精密度精密度,准确度准确度,检测限检测限,定量限定量限,选择性选择性,线性和范围线性和范围,耐用性耐用性第三节、药品分析方法验证第三节、药品分析方法验证23(1)准确度准确度（Accuracy）：）：测量值与真实值接近的程度测量值与真实值接近的程度表表示示:回收率回收率测定方法：回收试验测定方法：回收试验加样回收试验加样回收试验数据要求：至少用数据要求：至少用9个测定结果进行评价（个测定结果进行评价（3浓浓度，度，3次）；报告中包括回收率（次）；报告中包括回收率（%）、）、RSD或可或可信度。信度。效能指标效能指标24(2)精密度（精密度（Precision）：）：定定 义：义：同一样
15、品多次测量值之间相互接近的程度同一样品多次测量值之间相互接近的程度表表 示：示：偏差（偏差（Deviation，d），标准偏差（），标准偏差（Standarddeviation,SD）,相对标准偏差（相对标准偏差（RelativeStandarddeviation,RSD），至少用），至少用6次结果进行评价。次结果进行评价。重复性：重复性：同一实验室，同一人多次测定的精密度同一实验室，同一人多次测定的精密度中间精密度：中间精密度：同一实验室，不同人，不同仪器测定的精同一实验室，不同人，不同仪器测定的精密度密度重现性：重现性：不同实验室，不同人测定的精密度不同实验室，不同人测定的精密度25(3)
16、专属性（专属性（Specificity）：）：指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性。在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性。鉴别反应鉴别反应 含量测定和杂质测定含量测定和杂质测定26(4)检测限（检测限（limit of detection，LOD）：）：药物能被检出的最低浓度（药物能被检出的最低浓度（g/ml）测测定定:信噪比法（信噪比法（S:N=3）(5)定量限（定量限（1imit of quantitation，LOQ）：）：药物能被定量测出的最低浓度（药物能被定量测出的最低浓度（g/ml）测测
17、定定:信噪比法（信噪比法（S:N=10）27(6)线性与范围（线性与范围（linearity and range）：）：待测物浓度与响应值成线性关系的浓度范围待测物浓度与响应值成线性关系的浓度范围 线性关系：线性关系：Y=a+bx（r=0.9999)r=0.9999)线性程度：相关系数线性程度：相关系数 至少至少5 5个浓度个浓度原料药和制剂含量测定：范围应为测试浓度的原料药和制剂含量测定：范围应为测试浓度的80%-120%。制剂含量均匀度检查：范围应为测试浓度的制剂含量均匀度检查：范围应为测试浓度的70%-130%。溶出度或释放度中的溶出量测定：范围应为限度的溶出度或释放度中的溶出量测定：范
18、围应为限度的20%20%。28(7)耐用性（耐用性（robustness）:测定条件稍有变动时，对测定结果的影响程度。测定条件稍有变动时，对测定结果的影响程度。HPLC法变动因素有：法变动因素有：流动相组成与流动相组成与pH，色谱柱，色谱柱，柱温，流速等。柱温，流速等。GC法变动因素有：法变动因素有：色谱柱，固定相，担体、柱温、色谱柱，固定相，担体、柱温、进样口和检测器温度等。进样口和检测器温度等。29检验项目和验证内容：检验项目和验证内容：项目内容项目内容 鉴别鉴别杂质测定杂质测定含量测定及溶出含量测定及溶出量测定量测定定量定量限度限度准确度准确度精密度精密度重复性重复性中间精密度中间精密度
19、专属性专属性检测限检测限定量限定量限线性线性范围范围耐用性耐用性已有重现已有重现性验证，性验证，不需验证不需验证中间精密中间精密度度如一种方如一种方法不够专法不够专属，可用属，可用其他分析其他分析方法予以方法予以补充补充视具体情视具体情况予以验况予以验证证30第四节第四节 生物样品分析的基本要求生物样品分析的基本要求一、常用样品的种类、采集和储贮藏一、常用样品的种类、采集和储贮藏二、生物样品分析前处理技术二、生物样品分析前处理技术三、三、定量分析方法验证定量分析方法验证31生物样品包括各种体液和组织，但实际上最常用的是比生物样品包括各种体液和组织，但实际上最常用的是比较容易得到的血液（血浆、血
20、清、全血）尿液、唾液。较容易得到的血液（血浆、血清、全血）尿液、唾液。血样血样:血浆（血浆（plasma）和血清（）和血清（serum）是最常用的生物样品。）是最常用的生物样品。唾液唾液:尿液尿液:一、常用样品的种类、采集和储贮藏一、常用样品的种类、采集和储贮藏32（一）去除蛋白质（一）去除蛋白质1加入与水相混溶的有机溶剂加入与水相混溶的有机溶剂2加入中性盐加入中性盐3加入强酸加入强酸4加入含锌盐及铜盐的沉淀剂加入含锌盐及铜盐的沉淀剂:与与Pr羧酸羧酸5酶解法酶解法（二）缀合物的水解（二）缀合物的水解（三）有机破坏：金属离子（三）有机破坏：金属离子-消解剂消解剂（四）分离、纯化与浓集（四）分离
21、、纯化与浓集1液液-液萃取法（液萃取法（liquid-liquidextraction,LLE）2液液-固萃取法（固萃取法（liquidsolidextraction,LSE）3被测组分的浓集被测组分的浓集二、生物样品分析前处理技术二、生物样品分析前处理技术（五）（五）化学衍生化化学衍生化1GC中化学衍生化法中化学衍生化法2HPLC中化学衍生化法中化学衍生化法33三、三、定量分析方法的验证定量分析方法的验证 -生物样品分析生物样品分析（一）特异性（一）特异性内源性物质不得干扰原药、代谢物内源性物质不得干扰原药、代谢物（二）标准曲线（二）标准曲线r0.9900，至少，至少5个浓度，不许外延个浓度
22、，不许外延（三）精密度和准确度（三）精密度和准确度批内和批间批内和批间RSD15、20相对回收率相对回收率85115（80120）34（四）最低定量限（四）最低定量限LOQLOQ35倍倍t1/2，或，或1/101/20倍倍Cmax（五）样品稳定性（五）样品稳定性室温、冻融、长期冰冻室温、冻融、长期冰冻（六）提取回收率（绝对回收率）（六）提取回收率（绝对回收率）一般低于一般低于100100，须稳定，须稳定（七）质控样品（七）质控样品已知浓度样品均匀放入待测生物样品序列中，以已知浓度样品均匀放入待测生物样品序列中，以确保定量测定的准确度确保定量测定的准确度定量分析方法的验证定量分析方法的验证 -生
23、物样品分析生物样品分析35样品样品 固相净化固相净化 及及 反相高效液相色谱法反相高效液相色谱法测定血浆中茶碱测定血浆中茶碱伍朝筼等伍朝筼等药学学报药学学报,1989,24(10):76977336净化前空白血浆净化前空白血浆 净化后空白血浆净化后空白血浆 血浆样品血浆样品方法：Column Zorbax C18 5m 2.5cm4.6mm 254nm Precolumn YWG-ODS 9-11m 54.6mm Mobile Phase:甲醇-醋酸钠(0.05mol/L pH3.0)500512 8 4 0min茶碱咖啡因12 8 4 0min12 8 4 0min3750 100 150 200252015105茶碱(g/ml)(min)五例病人血浆茶碱浓度测定五例病人血浆茶碱浓度测定6.412.8 19.225.6 3232.41.81.20.60茶碱(g/ml)标准曲线标准曲线Y=9.566 10-2X+6.153 10-3r=0.9995