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1、蛋白质分离纯化与检测技术自动分布收集器凝胶过滤层析示意图凝胶过滤层析示意图凝胶的结构与性能葡聚糖凝胶特点阳离子交换基阴离子交换基原理亲和层析过程：分配层析o柱层析o纸层析o薄层层析聚丙烯酰胺凝胶电泳PolyAcrylamide Gel Electrophoresiso聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺（Acr）和交联剂亚甲双丙烯酰胺(Bis)在加速剂N，N，N，N四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)或核黄素(C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。凝胶聚合时所形成的微孔影响了不同分子的迁移率，当施加一定电压时小分子的物质的迁移速率将快于大分子的物质，即所谓的分子筛
2、效应。聚丙烯酰胺凝胶电泳原理蛋白质并非线形的，它蛋白质并非线形的，它存在二级结构、三级结存在二级结构、三级结构及四级结构构及四级结构蛋白质分子所蛋白质分子所带的电荷不同带的电荷不同分离蛋白质解离成单个多分离蛋白质解离成单个多肽亚基并可能尽可能减少肽亚基并可能尽可能减少期间的相互间的聚集期间的相互间的聚集消除蛋白质分消除蛋白质分子形状的影响子形状的影响掩盖不同类蛋白质分子原掩盖不同类蛋白质分子原有的电荷差别有的电荷差别蛋白质分子与一种带电荷蛋白质分子与一种带电荷非常多的物质结合非常多的物质结合蛋白质分子的电泳迁移蛋白质分子的电泳迁移率与分子量成线形关系率与分子量成线形关系SDS-聚丙烯酰胺凝胶电
3、泳原理o在电泳中，蛋白样品与上样缓冲液混合变性，上样缓冲液中含有SDS和巯基乙醇使得蛋白质分子中的二硫键还原，氢键、疏水键打开，SDS按1.4g SDS/1g蛋白质的比例结合到蛋白质多肽链分子上，形成SDS-多肽复合物。由于十二烷基磺酸根带负电，SDS覆盖于蛋白质的表面，破坏了蛋白质分子的四级结构而使多肽复合物具有近似的形状（长椭圆棒状），并且复合物所带有的负电荷大大超过了多肽分子原有的电荷量，因而掩盖了多肽分子原有的电荷差别。聚丙烯酰胺凝胶电泳原理如图所示，蛋白质所带的电性主要取决于氨基酸R集团所带的电性。图中的H代表无极性的R集团为了躲避水而聚集于内部。当SDS结合到蛋白质多肽链分子上，形
4、成SDS-多肽复合物后，SDS均匀覆盖于蛋白质的表面，破坏蛋白质分子的疏水作用而成为线性分子。oSDS-聚丙烯酰胺凝胶使用一种不连续的缓冲系统。在这一系统中，一般凝胶分为低浓度的成层胶（浓缩胶）和较高浓度的分离胶。在电泳时，SDS-多肽复合物向两胶界面迁移，在分离胶表面形成了一个极薄的层，极大地浓缩了样品的体积，使样品在分离之前处于同一起跑线。试剂 o30%凝胶贮备液：含29%（W/V）丙烯酰胺 1%（W/V）N，N-亚甲双丙烯酰胺o10%SDSoTEMED（N，N，N，N-四甲基乙烯二胺）o10%过硫酸胺oTris-甘氨酸电泳缓冲液：25mmol/L Tris 250mmol/L甘氨酸（pH
5、8.3）0.1%SDSo1.5mol/L TrisCl(pH8.8)分离胶o1.0mol/L TrisCl(pH6.8)浓缩胶 表3.4 分子量范围与凝胶浓度的关系 分子量范围 适用的凝胶浓度/(%)蛋 白 质 104 20-30 1-4104 15-20 1-5104-1105 10-15 1105 5-10 5105 2-5 核酸(RNA)104 15-20 104-105 5-10 105-2106 2-2.6原理图像分析图像分析离心技术离心技术的原理沉降系数相对离心力离心机的分类蔗糖密度梯度离心CSCl密度梯度离心超速离心1.凯氏定氮法2.双缩脲法3.Folin-酚法特点：4.蛋白质的
6、紫外吸收5.考马斯亮蓝法缺点抗体的制备佐剂o佐剂：延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。o常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant），其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：29（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入120mg卡介苗就成为完全佐剂。效价定 义：抗血清的效价，就是指血清中所含抗体的浓 度或含量。测定方法：双向琼脂糖扩散、ELISA等方法测定。抗体制备过程1.制备纯净的抗原2
7、.测定抗原浓度，0.5mg/mL。3.抗原用佐剂乳化4.一般常用皮下或背部多点皮内注射，首次剂量为300500g，使用完全佐剂。加强免疫的剂量约为首次剂量为1/4左右。每23周加强免疫一次，加强免疫时用不完全佐剂。5.在第2次加强免疫后2周，从耳缘静脉取23ml，制备血清，检测抗体效价。如未达到预期效价，需再进行加强免疫，直到满意时为止。当抗体效价达到预期水平时，即可放血制备抗血清。血清的采集 收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm，10min。在无菌条件，吸出血清，分装（0.050.2mL），贮于-40以下冰箱，或冻干后贮存于4冰箱保存。
8、双向琼脂板扩散免疫试验o双向琼脂板扩散免疫试验又称双向免疫扩散试验，将抗原和相应的抗体分别加入同一凝胶板的相邻小孔中，使两者相互扩散，当扩散到它们比例合适的部位时，就会形成抗原抗体复合物的沉淀，在琼脂中呈现一条乳白色的沉淀线。故此试验可用已知抗原检测未知抗体。o由于沉淀线形成的位置与抗原、抗体的浓度相关，抗原浓度越浓，形成的沉淀线距离抗原孔越远，同样，抗体浓度越浓，形成的沉淀线距离抗体孔越远。据此，固定抗原浓度，稀释抗体，可测定抗体效价。双向琼脂板扩散免疫试验1.配制1.5%生理盐水琼脂：100mL生理盐水中加入1.5g优质琼脂粉，置水浴中融化后，加入硫柳汞浓度为0.01%以防腐，分装于小试管
9、中，每管3mL，置于冰箱保存备用；2.将盛有3mL生理盐水琼脂的小试管置水浴中融化；3.将融化好的琼脂倾注于载玻片上，每管铺一板，厚度为1mm，共铺3块板；4.琼脂凝固后，按模板打孔，中心孔为抗原孔，四周8个孔为抗体孔，孔径3mm，孔距4mm。打孔后将载玻片于酒精灯上烘烤背面（温度不宜过高，以不烫手为宜），使琼脂与玻片贴紧；琼脂板双向扩散免疫实验5.将从兔中采得的血清按二倍稀释法稀释成1:2、1:4、1:8、1:16、1:32的不同浓度，同时也将抗原按二倍稀释法稀释成1:2、1:4、1:16；6.将已经稀释好的抗体按一定的顺序加入到四周孔中，其中一孔滴入生理盐水以做对照（均以滴满不溢出为度或用
10、微量加样器定量加入），中心孔中加入抗原，将已经稀释好的抗原分别滴入3块板的中心孔中；7.放入湿盒内，置37经24小时观察沉淀线出现的情况，记录结果。以出现明显的沉淀线的最高稀释度为该抗体的效价。a、b、c板中心孔为纯化的抗原SCMRP，稀释倍数分别是0、1/4、1/16；四周孔为制备的抗血清梯度稀释液和对照，孔1为生理盐水，孔2-7为抗血清0、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32稀释液，孔8为空白；d板为免疫的1号新西兰大耳兔。兔抗血清效价测定Western Blot Western Blot原理原理Western Blot 印迹常用转移膜及其特点 电转移流程1.配制电转移缓冲液，4预冷
11、。2.将膜与滤纸切成与胶同样的大小。注：通常情况下长宽各比胶小1mm；切一个小小的角以标识正反面和上下。3.将膜、滤纸与海绵垫在电转移缓冲液中平衡15min-1h 注：PVDF膜在使用前先用100%甲醇浸泡15 s，然后 用去离子水浸泡2min。4.压膜5.电转移6.膜固定：干燥（37干燥h）7.膜重新湿润：先用100%甲醇浸泡15 s，然后用去离子水浸泡2min标记1.将膜在室温下用封闭试剂封闭20-60分钟，期间不断摇动，如要得到最佳结果，需在室温下封闭1小时。2.移去封闭剂，加上适当的初级抗体稀释液，在不断摇动下杂交1小时。如果需要，与初级抗体的预杂交可在2-8摇动过夜。3.洗涤杂交膜，
12、时间5分钟，此过程重复4-6次，移去洗涤缓冲液。4.加入二抗(辣根过氧化物酶复合物)，在不断摇动下杂交1小时。5.洗涤杂交膜，时间5分钟，此过程重复4-6次，移去洗涤缓冲。6.重复过程3以除去没有结合上的辣根过氧化物酶复合物。显影1.工作液的制备：可以可以把过氧化物溶液与发光氨（氨基苯 二酰一肼）以等体积混合。每平方厘米膜使用0.125ml工作液，工作液可以在室温下稳定贮藏8小时。注：暴露于日光或其它强光下可以损坏工作液，为了得到最好的实验结果工作液应贮存在棕色瓶中，避免长时间暴露于任何强光下。2.膜与工作液杂交5分钟。3.将杂交膜从工作液中移出，放入一塑料膜保护器中：塑料薄膜或塑料包装。用吸
13、水组织移去多余液体，仔细排出膜杂交与塑料保护器之间的气泡。4.将膜保护器放入暗盒中，有蛋白质的一面要朝上，关闭所有的灯除了那些适合于胶片曝光的光线（如，红外线）。5.小心将胶片放在膜上。建议第一次曝光时间是60s，为了得到最佳结果应优化曝光时间，增强放射能照像光强是没有必要的，在胶片曝光之前应避免提前的放射能照像闪光。注意事项1.不要直接用手直接接触杂交膜，应该戴手套或用干净的镊子。2.上样不应过多。3.滤纸和膜的长和宽都要比胶小1mm，避免短路。4.膜要标记好正反面，在感光时要用膜的正面与胶片相贴。5.压膜时膜与胶之间、膜与滤纸间、胶与滤纸之间要避免有气泡产生；感光时，膜与胶片之间都要避免有气泡产生。6.膜用工作液处理后，应立即在暗室中使胶片感光。7.初级抗体的稀释到0.2-1.0g/ml或由1mg/ml的母液按1：1，0001：5，000稀释。8.抗原抗体的量需要优化，次级抗体的稀释到10-50ng/ml或由1mg/ml的母液按1：20，000-1：100，000稀释。9.预先统计好所用药品的量；新配制的药品不要存放时间过长最好提前一天配制好，还有一些药品要现用现配。