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1、蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化第1页，此课件共39页哦蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化n n透析和超过滤透析和超过滤n n超速离心超速离心n n层析（色谱）层析（色谱）(chromatography)n n电泳电泳(electrophoresis)第2页，此课件共39页哦1 透析和超过滤透析和超过滤 P P302302第3页，此课件共39页哦2 超速离心超速离心 P P302302第4页，此课件共39页哦 基本原理：基本原理：层析由层析由流动相流动相和和固定相固定相组成组成样品作为流动样品作为流动相流过固定相相流过固定相各组分在两相中各组分在两相中分布程度不同分布程度不同各成分各成分迁移迁移
2、率不同率不同分离分离3 层析（色谱）层析（色谱）（Chromatography）P P148148第5页，此课件共39页哦n n两相：两相：固定相（静相）和流动相（动相）固定相（静相）和流动相（动相）n n有效分配系数：有效分配系数：第6页，此课件共39页哦层析层析n n按流动相按流动相：气相、液相色谱等；：气相、液相色谱等；n n按操作形式不同按操作形式不同：纸层析、薄层层析、柱层：纸层析、薄层层析、柱层析等；析等；n n按分离机制按分离机制：凝胶层析、离子交换层析、亲：凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、吸附层析等。和层析、吸附层析等。第7页，此课件共39页哦3.1 纸层析纸层析（Filte
3、r-paper chromatography）相对迁移率相对迁移率相对迁移率相对迁移率 P P151151第8页，此课件共39页哦3.2 薄层层析薄层层析（Thin-layer chromatography）P P152152第9页，此课件共39页哦3.3 柱层析第10页，此课件共39页哦 凝胶过滤层析凝胶过滤层析(分子排阻层析分子排阻层析、分子筛层析、分子筛层析）（Gel-filtration chromatography）n n根据根据蛋白质分子大小不同蛋白质分子大小不同来分离纯化蛋白质来分离纯化蛋白质的一种方法。的一种方法。P P303303第11页，此课件共39页哦n n介质：介质：凝
4、胶颗粒凝胶颗粒（多孔的网状结构）（多孔的网状结构）交联度或孔度（网孔大小）交联度或孔度（网孔大小）凝胶的分级凝胶的分级分离范围分离范围n n交联葡聚糖交联葡聚糖Sephadex G-50（1500-300001500-30000）n n琼脂糖琼脂糖 Sepharose或或或或Bio-Gel ABio-Gel An n聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺Bio-Gel PBio-Gel P第12页，此课件共39页哦原理：原理：第13页，此课件共39页哦 离子交换层析离子交换层析（Ion-exchange chromatography）n n根据蛋白质根据蛋白质根据蛋白质根据蛋白质所带电荷的不同所带电荷的不同所带
5、电荷的不同所带电荷的不同进行分离纯化。进行分离纯化。n n介质：介质：介质：介质：离子交换树脂离子交换树脂离子交换树脂离子交换树脂n n溶液中的离子与树脂上的带电基团进行交换反应；溶液中的离子与树脂上的带电基团进行交换反应；n n各种离子交换能力不同，与树脂结合的牢固程度就不各种离子交换能力不同，与树脂结合的牢固程度就不同；同；n n在洗脱过程中，各种离子迁移率不同，达到分离的目在洗脱过程中，各种离子迁移率不同，达到分离的目的。的。P P152152和和和和310310第14页，此课件共39页哦第15页，此课件共39页哦第16页，此课件共39页哦第17页，此课件共39页哦第18页，此课件共39
6、页哦茚三酮反应：茚三酮反应：生成紫色物质生成紫色物质 脯氨酸和羟脯氨酸生成黄色物质脯氨酸和羟脯氨酸生成黄色物质 氨基酸的定性定量氨基酸的定性定量第19页，此课件共39页哦第20页，此课件共39页哦 根据根据蛋白质与特异的配体相互作用蛋白质与特异的配体相互作用来分离的。来分离的。来分离的。来分离的。蛋白质蛋白质 配体配体 蛋白质配体复合物蛋白质配体复合物 亲和层析亲和层析(Affinity chromatography)P P313313第21页，此课件共39页哦第22页，此课件共39页哦第23页，此课件共39页哦第24页，此课件共39页哦第25页，此课件共39页哦 高效液相层析高效液相层析（H
7、igh-Performance liquid chromatography,HPLC）P154和和314也分为凝胶过滤层析、离子交换层析和亲也分为凝胶过滤层析、离子交换层析和亲和层析等和层析等特点：特点：固定相支持剂颗粒细固定相支持剂颗粒细 采取高压，洗脱速度增大采取高压，洗脱速度增大第26页，此课件共39页哦第27页，此课件共39页哦4 电泳电泳(Electrophoresis)n n在外电场存在下，利用在外电场存在下，利用蛋白质分子携带的蛋白质分子携带的净电荷不同净电荷不同以分离混合物以分离混合物Arne Tiselius获获1948年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖 P307第28页，此课件共
8、39页哦4.1 凝胶电泳凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶（蛋白质和多核苷酸）聚丙烯酰胺凝胶（蛋白质和多核苷酸）琼脂糖凝胶（核酸琼脂糖凝胶（核酸）第29页，此课件共39页哦电泳仪电泳仪水平电泳槽水平电泳槽垂直电泳槽垂直电泳槽第30页，此课件共39页哦聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）不连续：不连续：浓缩胶和分离胶浓缩胶和分离胶电泳迁移率电泳迁移率决定于所带的净电荷以及分子决定于所带的净电荷以及分子大小和形状等因素。大小和形状等因素。+凝胶凝胶加样加样 P P309309第31页，此课件共39页哦巯基乙醇巯基乙醇：打开二硫键。打开二硫键。SDS：变性剂，变性剂，破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作
9、用。破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用。破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用。破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用。SDSSDS以其氢键与蛋白质分子的侧链结合成复合体。以其氢键与蛋白质分子的侧链结合成复合体。以其氢键与蛋白质分子的侧链结合成复合体。以其氢键与蛋白质分子的侧链结合成复合体。带有很多负电荷带有很多负电荷带有很多负电荷带有很多负电荷远远超过蛋白质分子原有电荷远远超过蛋白质分子原有电荷远远超过蛋白质分子原有电荷远远超过蛋白质分子原有电荷 改变了蛋白质单体分子的构象：近似雪茄烟形的长椭改变了蛋白质单体分子的构象：近似雪茄烟形的长椭改变了蛋白质单体分子的构象：近似雪茄烟形的长椭改变了蛋白质单体分子的
10、构象：近似雪茄烟形的长椭圆棒，圆棒，圆棒，圆棒，短轴长度相同，长轴长度随蛋白质的相对分子质短轴长度相同，长轴长度随蛋白质的相对分子质量成正比例变化量成正比例变化。迁移率主要取决于蛋白质相对分子量迁移率主要取决于蛋白质相对分子量SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGESDS-PAGE）第32页，此课件共39页哦第33页，此课件共39页哦迁移率迁移率第34页，此课件共39页哦4.2 等电聚焦电泳等电聚焦电泳高分辨率高分辨率的蛋白质分离技术。的蛋白质分离技术。在具有在具有pH梯度的介质梯度的介质梯度的介质梯度的介质中进行的。在外电场的作用下中进行的。在外电场的作用下各种各种蛋白
11、质将移向并聚焦（停留）在等于其等电点的蛋白质将移向并聚焦（停留）在等于其等电点的pH梯度处梯度处梯度处梯度处，并形成一个很窄的区带。，并形成一个很窄的区带。特别适用于特别适用于同功酶同功酶同功酶同功酶的鉴定。只要它们的的鉴定。只要它们的的鉴定。只要它们的的鉴定。只要它们的pI有有0.02pH单位单位的差别就能分开。的差别就能分开。P310第35页，此课件共39页哦第36页，此课件共39页哦等电聚焦电泳等电聚焦电泳电泳时，每种蛋白迁移至电泳时，每种蛋白迁移至与它的与它的pI相一致的相一致的pH处处加入加入蛋白样品蛋白样品电场作用下在凝胶中建电场作用下在凝胶中建立稳定的一个立稳定的一个pH梯度梯度第37页，此课件共39页哦第38页，此课件共39页哦n n等电聚焦电泳等电聚焦电泳 +SDS-PAGE+SDS-PAGEn n第一向进行等电聚焦，蛋白质沿第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pHpH梯度分离至各自的等电梯度分离至各自的等电梯度分离至各自的等电梯度分离至各自的等电点；点；点；点；n n再沿垂直的方向进行分子量的分离再沿垂直的方向进行分子量的分离再沿垂直的方向进行分子量的分离再沿垂直的方向进行分子量的分离.4.3 双向电泳双向电泳pI降低降低分子量分子量减小减小第39页，此课件共39页哦