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1、蛋白质分离纯化第1页，本讲稿共43页操作基本注意事项操作基本注意事项刻度吸管刻度吸管专管专用专管专用血清血清 2ml 一支一支PBS 2ml 一支一支(NH4)2SO4 2ml、0.5ml 各一支各一支实验前用蒸馏水清洗实验前用蒸馏水清洗3次备用次备用实验过程中：清水实验过程中：清水7次次蒸馏水蒸馏水3次次洗耳球不要被污染洗耳球不要被污染每次吸取液体液面不要过高每次吸取液体液面不要过高视线要与观察刻度水平视线要与观察刻度水平 不要污染不要污染第2页，本讲稿共43页刻度吸管读数刻度吸管读数刻度吸管数据读取，视线要与液面保持平齐。第3页，本讲稿共43页蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯
2、化蛋白质的分离纯化 Isolation and Purification of ProteinIsolation and Purification of Protein第4页，本讲稿共43页实验目的掌握盐析、凝胶层析分离纯化蛋白质的掌握盐析、凝胶层析分离纯化蛋白质的基本原理和操作步骤基本原理和操作步骤掌握离心机的操作掌握离心机的操作熟悉蛋白质定性检测方法熟悉蛋白质定性检测方法第5页，本讲稿共43页实验原理1盐析法盐析法23层析法层析法离心技术离心技术4检测蛋白质、检测蛋白质、NHNH4 4+的方法的方法第6页，本讲稿共43页盐析11 1 逐滴：边摇边缓慢滴入逐滴：边摇边缓慢滴入2 2 混匀：盖
3、子拧上在手心或桌上磕动混匀：盖子拧上在手心或桌上磕动不完全流出式刻度吸管：有不完全流出式刻度吸管：有“红色彩环红色彩环”，当液体流出后，再停留当液体流出后，再停留1515秒并转动。秒并转动。清洗刻度吸管：自来水清洗刻度吸管：自来水7 7次次蒸馏水蒸馏水3 3次次注意不要污染洗耳球。注意不要污染洗耳球。第7页，本讲稿共43页盐析法定义：定义：盐析是指溶液中加入大量中性无机盐以破坏蛋盐析是指溶液中加入大量中性无机盐以破坏蛋白质的稳定因素，而使蛋白溶解度降低并使之从溶液中白质的稳定因素，而使蛋白溶解度降低并使之从溶液中沉淀析出的现象。沉淀析出的现象。原理：原理：破坏蛋白质的稳定因素：水化膜、电荷层。
4、破坏蛋白质的稳定因素：水化膜、电荷层。中性盐：中性盐：(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl优点：优点：蛋白质不变性蛋白质不变性1第8页，本讲稿共43页盐析法1影响因素：影响因素：pHpH值：值：被分离的蛋白质在其等电点附近被分离的蛋白质在其等电点附近效果最好效果最好盐的饱和度盐的饱和度：盐的饱和度不同析出的蛋白质也不相同盐的饱和度不同析出的蛋白质也不相同 100%(NH100%(NH4 4)2 2SOSO4 4 ：主要清蛋白沉淀：主要清蛋白沉淀50%(NH50%(NH4 4)2 2SOSO4 4 ：主要球蛋白都沉淀：主要球蛋白都沉淀33%(NH33%(NH4 4)2 2SOSO4 4：主
5、要主要-球蛋白沉淀球蛋白沉淀温度要求不太严格：温度要求不太严格：对对温度敏感的蛋白温度敏感的蛋白质质在低温（在低温（44）一般一般可在可在室温室温进行操作。进行操作。蛋白质浓度：蛋白质浓度：浓度过高时，常常出现共沉现象浓度过高时，常常出现共沉现象浓度过稀时回收率太低。因此盐析蛋白质含量浓度过稀时回收率太低。因此盐析蛋白质含量25-30g/L25-30g/L。蛋白质分子颗粒大小和亲水程度蛋白质分子颗粒大小和亲水程度不同不同相对分子质量和所带电荷不同相对分子质量和所带电荷不同第9页，本讲稿共43页盐析111逐滴：边摇边缓慢滴入逐滴：边摇边缓慢滴入22混匀：盖子拧上在手心或桌上磕动混匀：盖子拧上在手
6、心或桌上磕动33弃上清：直接倾倒（管口在滤纸上沾干净）弃上清：直接倾倒（管口在滤纸上沾干净）44环壁：环绕离心管壁滴下环壁：环绕离心管壁滴下清洗刻度吸管：自来水清洗刻度吸管：自来水7 7次次蒸馏水蒸馏水3 3次次第10页，本讲稿共43页离心技术离心技术离心原理：离心原理：利用离心力将悬浮液中的悬浮颗粒快速利用离心力将悬浮液中的悬浮颗粒快速沉降，借以分离比重（密度）不同的各沉降，借以分离比重（密度）不同的各种物质成分的方法。种物质成分的方法。3第11页，本讲稿共43页离心技术离心技术离心机分类离心机分类 根据离心机的最大转速分类可以分为三类根据离心机的最大转速分类可以分为三类 5000rpm 低
7、速离心机低速离心机 5,000-25,000rpm 高速离心机高速离心机 25,000-100,000rpm 超速离心机超速离心机3第12页，本讲稿共43页离心操作要领离心操作要领根据待离心的溶液性质和体积选择合适根据待离心的溶液性质和体积选择合适的离心管的离心管离心管连外套管一起平衡离心管连外套管一起平衡对称方向放入离心机中（转子对角线）对称方向放入离心机中（转子对角线）当离心速度减为零时，方可打开离心机盖当离心速度减为零时，方可打开离心机盖第13页，本讲稿共43页离心操作要领离心操作要领离心前一定要配平，配平后放入离心机转子对角线第14页，本讲稿共43页盐析111逐滴：边摇边缓慢滴入逐滴：
8、边摇边缓慢滴入22混匀：盖子拧上在手心或桌上磕动混匀：盖子拧上在手心或桌上磕动33弃上清：直接倾倒干净（管口在滤纸上沾干净）弃上清：直接倾倒干净（管口在滤纸上沾干净）44环壁：环绕离心管壁滴下环壁：环绕离心管壁滴下清洗刻度吸管：自来水清洗刻度吸管：自来水7 7次次蒸馏水蒸馏水3 3次次第15页，本讲稿共43页血液成分血浆（血浆（plasmaplasma）：）：将新鲜血液，经抗凝处理后，通过离心将新鲜血液，经抗凝处理后，通过离心沉淀，所获得的不含细胞成分的液体沉淀，所获得的不含细胞成分的液体（上层淡黄色清液）。（上层淡黄色清液）。第16页，本讲稿共43页人血清中几种主要蛋白质组分*血清蛋白质血清
9、蛋白质等电点等电点分子量分子量占蛋白质总量占蛋白质总量%清蛋白清蛋白4.6469,00057721-球蛋白球蛋白5.06200,000252-球蛋白球蛋白5.06300,00049-球蛋白球蛋白5.1290,000150,0006.512-球蛋白球蛋白6.857.3156,000950,0001220*醋酸纤维素膜电泳。醋酸纤维素膜电泳。-球蛋白是一类结构及功能相似的多种蛋白质。血清含量为球蛋白是一类结构及功能相似的多种蛋白质。血清含量为0.7-1.5%0.7-1.5%。第17页，本讲稿共43页血清血清血清(serum）:指血液凝固后，析出淡黄色透明液体指血液凝固后，析出淡黄色透明液体。血清与
10、血浆的区别：血清与血浆的区别：血清中没有纤维蛋白原等凝血因子血清中没有纤维蛋白原等凝血因子第18页，本讲稿共43页 层析法层析法层析法是利用混合物中各组分物理化学性层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使其在随流分子亲和力、分配系数等），使其在随流动相流经固定相时，在固定相中的分布程动相流经固定相时，在固定相中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。而达到分离的目的。脱盐常用脱盐常用透析法透析法和和凝胶过滤层析法。凝胶过滤层析法。2第19页，
11、本讲稿共43页透析法透析法透析法的优点是透析后样透析法的优点是透析后样品终体积较小、简便，但品终体积较小、简便，但所需时间较长；所需时间较长；透析法的缺点是最好低温透析法的缺点是最好低温进行，且盐不易除尽。进行，且盐不易除尽。第20页，本讲稿共43页凝胶层析法凝胶层析法凝胶过滤法优点凝胶过滤法优点是整个是整个处处理理过过程非常程非常“温和温和”，保，保护样护样品品(如蛋如蛋白白质质、酶酶等等)的生物活性，的生物活性，则是能将盐除尽，所需时间也明显则是能将盐除尽，所需时间也明显缩短，但其凝胶过滤后样品终体积较大。缩短，但其凝胶过滤后样品终体积较大。第21页，本讲稿共43页凝胶层析法凝胶层析法分子
12、分子较较大大的物的物质质先先流出流出 如如-球球蛋蛋白白，不不可可进进入入凝凝胶胶颗颗粒粒内内部部，只只沿沿凝凝胶胶颗颗粒粒外外的的间间隙隙随随流流动动相相向向下下流流动动，受受到到的的阻阻滞滞作作用用小小，流流程程短，移短，移动动速度快，先流出。速度快，先流出。分子分子较较小小的物的物质质后后流出流出 如如(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4，可可扩扩散散渗渗透透进进入入凝凝胶胶颗颗粒粒（网网孔孔）内内部部，流程流程长长，移，移动动速度慢，后流出。速度慢，后流出。第22页，本讲稿共43页层析类型：层析类型：凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法（gel filtration chromatogra
13、phy）固定相凝胶对不同组分因分子大小不同而受阻滞程度不同。固定相凝胶对不同组分因分子大小不同而受阻滞程度不同。离子交换层析法离子交换层析法（ion exchange chromatography）各组分带电性质不同与固定相离子交换剂作用力不同。各组分带电性质不同与固定相离子交换剂作用力不同。亲和层析法亲和层析法（affinity chromatography）固定相只能与一种待分离组分（生物高分子如抗原固定相只能与一种待分离组分（生物高分子如抗原-抗体、酶抗体、酶-底物）底物）间的生物特异性吸附专一可逆地结合。间的生物特异性吸附专一可逆地结合。第23页，本讲稿共43页检测蛋白质、检测蛋白质、
14、NH4+的方法的方法检测蛋白质检测蛋白质 磺基水杨酸：磺基水杨酸：白色絮状沉淀白色絮状沉淀-有蛋白质出现有蛋白质出现检测检测NH4+奈氏试剂：奈氏试剂：棕黄色沉淀棕黄色沉淀-含有含有NH4+4第24页，本讲稿共43页实验步骤1盐析盐析23层析层析检测检测第25页，本讲稿共43页盐析155洗涤：轻轻沿管壁滴入，倾斜并旋转离心管洗涤：轻轻沿管壁滴入，倾斜并旋转离心管66溶解沉淀：振摇溶解沉淀：振摇第26页，本讲稿共43页上午任务顺利结束！下午1:00正式开始第27页，本讲稿共43页层析层析 装柱 上样 加洗脱剂 收集2装柱装柱1上样上样2加洗脱剂加洗脱剂3收集收集4第28页，本讲稿共43页凝胶层析
15、法凝胶层析法层析层析PBSPBS（滴瓶滴瓶）葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G-25 G-25（配（配1 1支胶头吸管）支胶头吸管）小试管小试管1 1个（装蒸馏水）个（装蒸馏水）层析柱层析柱1 1个（个（201.5cm201.5cm）*大试管大试管(20(20个个)黑色比色盘、白色比色盘（各黑色比色盘、白色比色盘（各1 1个）个）试剂：*自自来来水水洗洗后后，蒸蒸馏馏水水少少量量冲冲一一下下，活活塞塞关关上上。加加蒸蒸馏馏水水检检查查是否漏水是否漏水,然后倒挂在铁架上，然后倒挂在铁架上，活塞打开控干。活塞打开控干。仪器：第29页，本讲稿共43页凝胶层析法基本操作凝胶层析法基本操作1、装柱、装柱:2、平衡、
16、平衡:3、上样：、上样：4、收集：、收集：5、检查：、检查：6、合并样品：、合并样品：第30页，本讲稿共43页1 1、装柱、装柱:层析柱垂直固定支架上层析柱垂直固定支架上环壁加蒸馏水少许，打开活塞约环壁加蒸馏水少许，打开活塞约1 1滴滴/秒，关上秒，关上.再环壁加入再环壁加入PBSPBS约约10ml10ml，打开活塞，剩下约，打开活塞，剩下约1cm1cm后，关闭后，关闭 。SephadexG-25SephadexG-25凝胶用凝胶用吸管吹吸吸管吹吸呈混悬液，再呈混悬液，再边混匀边混匀边边用吸管用吸管环壁环壁加入，快速连续，加到加入，快速连续，加到柱顶部柱顶部。打开出口，继续补加，流速约打开出口
17、，继续补加，流速约1 1滴滴/3/3秒钟秒钟,自然沉降。自然沉降。当柱床高约当柱床高约15cm15cm时，时，床面上留一层液体，约床面上留一层液体，约1cm1cm高，关闭高，关闭活塞活塞 ，备用。，备用。第31页，本讲稿共43页2 2、平衡、平衡:完全打开下夹，完全打开下夹，以以1-31-3倍柱体积的倍柱体积的PBSPBS加满柱上层加满柱上层 约约15cm PBS 15cm PBS 流过凝胶柱，然后夹住下口流过凝胶柱，然后夹住下口。凝胶过滤凝胶过滤PBSPBS不与盐析不与盐析PBSPBS混用。混用。每次柱表面始终要保持着一层溶液每次柱表面始终要保持着一层溶液（1-3cm），），止凝胶柱进入空气
18、。止凝胶柱进入空气。注意事项：注意事项：第32页，本讲稿共43页3 3、上样、上样打开下夹，等液面刚好接近凝胶表面，约打开下夹，等液面刚好接近凝胶表面，约12mm12mm时，关上时，关上活塞；活塞；用乳头吸管吸出用乳头吸管吸出-球蛋白溶解液，在凝胶表面上球蛋白溶解液，在凝胶表面上23cm23cm高，高，沿柱内壁小心缓慢，环绕排出样品，并逐渐提高吸管加入，沿柱内壁小心缓慢，环绕排出样品，并逐渐提高吸管加入，尽量不使床面扰动；尽量不使床面扰动；拧开活塞，控制流速约（拧开活塞，控制流速约（1 1滴滴/3/3秒），待蛋白质液流秒），待蛋白质液流入凝胶，但柱表面仍残留入凝胶，但柱表面仍残留12mm12m
19、m液体层时，立即如上液体层时，立即如上法加入法加入PBSPBS约约1ml1ml冲洗样品冲洗样品收集样品的同时继续不断环壁加入收集样品的同时继续不断环壁加入PBSPBS进行洗脱，胶面上进行洗脱，胶面上端始终保留约端始终保留约1-2cm1-2cm高的洗脱液，注意保持胶面平整。高的洗脱液，注意保持胶面平整。第33页，本讲稿共43页4 4、洗脱收集：、洗脱收集：干净小试管干净小试管20支，依次摆在试管架上，并编支，依次摆在试管架上，并编号。号。开始收集后每管开始收集后每管10滴滴，依次收集。，依次收集。第34页，本讲稿共43页5 5、检查及凝胶再生：、检查及凝胶再生：在检测时，用乳头滴管吸取试管中溶液
20、后，应马上及时洗净，洗在检测时，用乳头滴管吸取试管中溶液后，应马上及时洗净，洗至少至少3 3次，再吸取下一管，以免造成相互污染。次，再吸取下一管，以免造成相互污染。依次从每支收集管中取出依次从每支收集管中取出1 1滴溶液置于黑色比色磁盘中，加入滴溶液置于黑色比色磁盘中，加入1 1滴滴20%20%磺基水杨酸，若磺基水杨酸，若呈现白色絮状沉淀呈现白色絮状沉淀即证明已有蛋白质出现，即证明已有蛋白质出现，实验记录实验记录+；继续依次检测，直到检查不出有白色沉淀为止，实验记录继续依次检测，直到检查不出有白色沉淀为止，实验记录-；经上述检查经上述检查含有蛋白质的最后一管开始含有蛋白质的最后一管开始，各取，
21、各取1 1滴溶液，放置在白色滴溶液，放置在白色比色盘孔中，加入比色盘孔中，加入1 1滴奈氏试剂，若呈现滴奈氏试剂，若呈现棕黄色沉淀棕黄色沉淀说明含有说明含有NH4+NH4+，实验记录，实验记录+再洗柱依次检测直至无再洗柱依次检测直至无NH4+NH4+即用奈氏试剂检测无棕黄色沉淀即用奈氏试剂检测无棕黄色沉淀为止，实验记录为止，实验记录-，柱再生完毕。，柱再生完毕。第35页，本讲稿共43页样品收集样品收集磺基水杨酸磺基水杨酸-白色絮状沉淀白色絮状沉淀-有蛋白质出现有蛋白质出现奈氏试剂奈氏试剂-棕黄色沉淀棕黄色沉淀-含有含有NH4+第36页，本讲稿共43页凝胶回收凝胶回收检测直至无检测直至无NH4+
22、NH4+为止，为止，柱再生完毕，凝胶柱再生完毕，凝胶倒回到原来的锥形瓶回收，留待再用。倒回到原来的锥形瓶回收，留待再用。立刻洗净层析柱。立刻洗净层析柱。第37页，本讲稿共43页6 6、合并样品、合并样品：将含蛋白最高且无将含蛋白最高且无NHNH4 4+的几管蛋白，用滴管合并在一的几管蛋白，用滴管合并在一个个EPEP管中管中,此即为已脱盐后的此即为已脱盐后的球蛋白溶液。球蛋白溶液。将此将此EPEP管，冷冻保存在管，冷冻保存在-20或或-70冰箱。冰箱。作好标记：班级，姓名，样品名，日期。作好标记：班级，姓名，样品名，日期。第38页，本讲稿共43页Q Q:954570564 TEL:1360451
23、2801第39页，本讲稿共43页蛋白质的沉淀由于蛋白质溶液是亲水溶胶，存在着两个稳定因素：电荷和水化膜。蛋白质胶粒上的同性电荷互相排斥，不易凝聚成团下沉；蛋白质表面的许多亲水基团的水合作用形成一层水化膜，在胶粒之间起了隔离作用。因此，蛋白质在水溶液中，虽分子量很大，但仍能维持稳定的溶解状态。第40页，本讲稿共43页蛋白质的沉淀一方面盐离子同水结合，降低溶液中自由一方面盐离子同水结合，降低溶液中自由水的浓度，使得蛋白质没有足够的水维持水的浓度，使得蛋白质没有足够的水维持溶解状态，破坏了维持蛋白质亲水胶的水溶解状态，破坏了维持蛋白质亲水胶的水化膜化膜，蛋白质溶解度降低。，蛋白质溶解度降低。另一方面
24、加入的盐离子部分中和了蛋白质分子另一方面加入的盐离子部分中和了蛋白质分子相互排斥的电荷，破坏蛋白质亲水胶体的稳定相互排斥的电荷，破坏蛋白质亲水胶体的稳定因素因素，蛋白质相互聚集沉淀蛋白质相互聚集沉淀当盐浓度增加到一定浓度时：当盐浓度增加到一定浓度时：第41页，本讲稿共43页硫酸铵的优点硫酸铵的优点在水中化学性质稳定；在水中化学性质稳定；在水中溶解度大；在水中溶解度大；溶解度的温度系数（在溶解度的温度系数（在0 030）变化较小；）变化较小；分段分段盐盐析析效果好；效果好；性质温和，即使高浓度时也不会影响蛋白质的性质温和，即使高浓度时也不会影响蛋白质的 生物学活性。生物学活性。价廉易得价廉易得第42页，本讲稿共43页盐析11 1 逐滴：边摇边缓慢滴入逐滴：边摇边缓慢滴入2 2 混匀：盖子拧上在手心或桌上磕动混匀：盖子拧上在手心或桌上磕动3 3 弃上清：直接倾倒干净（管口在滤纸上沾干净）弃上清：直接倾倒干净（管口在滤纸上沾干净）4 4 环壁：环绕离心管壁滴下环壁：环绕离心管壁滴下5 5 洗涤：轻轻沿管壁滴入，倾斜并旋转离心管洗涤：轻轻沿管壁滴入，倾斜并旋转离心管6 6 溶解沉淀：振摇溶解沉淀：振摇第43页，本讲稿共43页