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1、第1章 发酵工程第2节 微生物的培养技术及应用第一章第一章 发酵工程发酵工程第第2 2节节 微生物的培养技术及应用微生物的培养技术及应用第1课时 微生物的基本培养技术从社会中来从社会中来向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的体有益的细菌细菌，再经过，再经过发酵发酵就可以制成就可以制成酸奶，由于制作工艺并不复杂，一些人酸奶，由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶，自制酸奶虽然方便，会在家里自制酸奶，自制酸奶虽然方便，但是但是食用自制酸奶导致肠胃不适食用自制酸奶导致肠胃不适的事件的事件屡见不鲜，主要原因是在制作过程中屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有有杂
2、菌混入杂菌混入。那么，怎样才能保证无处不。那么，怎样才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？在的杂菌不混入发酵物中呢？应该先对制作用具和原料进行应该先对制作用具和原料进行灭菌处理灭菌处理，再接种再接种纯的菌种纯的菌种，并控制发酵条件，避，并控制发酵条件，避免杂菌进入。免杂菌进入。这需要应用无菌技术和微生物的培养技术。这需要应用无菌技术和微生物的培养技术。失败一、微生物1.1.微生物的概念：微生物是难以用肉眼观察的微小生物微生物的概念：微生物是难以用肉眼观察的微小生物的统称，包括的统称，包括细菌、真菌、病毒细菌、真菌、病毒及一些及一些原生生物原生生物等。等。（1 1）无细胞结构（病毒）无细胞结构
3、（病毒）：SARSSARS病毒、新冠病毒等病毒、新冠病毒等RNARNA病病毒；噬菌体等毒；噬菌体等DNADNA病毒。病毒。新冠病毒噬菌体人类免疫缺陷病毒1.1.微生物的概念：微生物是难以用肉眼观察的微小生物微生物的概念：微生物是难以用肉眼观察的微小生物的统称，包括的统称，包括细菌、真菌、病毒细菌、真菌、病毒及一些及一些原生生物原生生物等。等。（2 2）原核细胞：）原核细胞：蓝细菌、大肠杆菌、乳酸菌、醋酸菌蓝细菌、大肠杆菌、乳酸菌、醋酸菌等等细菌细菌；链霉菌等；链霉菌等放线菌放线菌。蓝细菌乳酸菌醋酸菌链霉菌1.1.微生物的概念：微生物是难以用肉眼观察的微小生物微生物的概念：微生物是难以用肉眼观察
4、的微小生物的统称，包括的统称，包括细菌、真菌、病毒细菌、真菌、病毒及一些及一些原生生物原生生物等。等。衣藻本章中提及的微生本章中提及的微生物主要指用于物主要指用于发酵发酵的细菌和真菌的细菌和真菌。原生生物：原生生物：草履虫、变形虫、草履虫、变形虫、衣藻等。衣藻等。真菌：真菌：酵母菌、霉菌、毛霉等；酵母菌、霉菌、毛霉等；酵母菌毛霉草履虫（3 3）真核细胞）真核细胞变形虫（1 1）防止）防止杂菌杂菌污染；污染；（2 2）获得）获得纯净纯净的微生物培养物。的微生物培养物。2.2.研究和应用微生物的前提（发酵工程的研究和应用微生物的前提（发酵工程的重要基础）重要基础）3.3.实验室培养微生物的要求实验
5、室培养微生物的要求（1 1）为人们需要的微生物提供合适）为人们需要的微生物提供合适的营养和环境条件的营养和环境条件培养基培养基（2 2）确保其它微生物无法混入，并将）确保其它微生物无法混入，并将需要的微生物分离出来需要的微生物分离出来无菌技术无菌技术高压蒸汽灭菌培养基二、培养基的配制1.1.培养基的概念：人们按照微生物对培养基的概念：人们按照微生物对营养物质营养物质的不同需的不同需求，配制出供其求，配制出供其生长繁殖生长繁殖的营养基质，用以培养、分离、的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。鉴定、保存微生物或积累其代谢物。2.2.培养基的分类按培养基的分类按(物理性质分类物
6、理性质分类)（1 1）液体培养基液体培养基：不含凝固剂（如琼脂）、呈：不含凝固剂（如琼脂）、呈液体液体状状态的培养基。态的培养基。（2 2）固体培养基固体培养基：呈：呈固体固体状态的培养基。状态的培养基。液体培养基中加入琼脂后制成的液体培养基中加入琼脂后制成的琼脂固体培养基琼脂固体培养基是实验室是实验室最常用最常用的培养基之一。的培养基之一。注意：注意：凝固剂（如琼脂），不能被凝固剂（如琼脂），不能被微生物利用，只起到微生物利用，只起到凝固作用凝固作用。2.2.培养基的分类培养基的分类液体培养基加入琼脂琼脂固体培养基微生物在琼脂固体培养基表面或内部生长，可以形成肉微生物在琼脂固体培养基表面或内
7、部生长，可以形成肉眼可见的眼可见的菌落。菌落。1.1.定义：定义：单个单个或或少数少数同种同种菌体在菌体在固体培养基固体培养基上大量繁上大量繁殖，形成肉眼可见的子细胞群体。殖，形成肉眼可见的子细胞群体。2.2.特征：特征：形状、大小、颜色、光泽度、透明度形状、大小、颜色、光泽度、透明度等。等。3.3.功能：菌落是功能：菌落是鉴定菌种鉴定菌种的重要依据。的重要依据。知识补充：知识补充：菌落菌落沙门氏菌毛霉青霉菌酵母菌3.3.培养基的营养构成培养基的营养构成（1 1）各种培养基一般都含有）各种培养基一般都含有水、碳源、氮源水、碳源、氮源和和无机盐无机盐等等营养物质。营养物质。1000mL1000m
8、L牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成注：注：牛肉膏牛肉膏和和蛋白胨蛋白胨来源于动物，含有来源于动物，含有糖、维生素糖、维生素和和有机氮有机氮等营养物质。等营养物质。思考（思考（P10P10）：为什么培养基需要氮源？）：为什么培养基需要氮源？氮是微生物合成蛋白质、核酸等物质必须的元素。氮是微生物合成蛋白质、核酸等物质必须的元素。微生物的化学组成大体相同，主要由微生物的化学组成大体相同，主要由C C、H H、O O、N N、P P、S S等等大量元素大量元素和和FeFe、MnMn、CuCu、ZnZn、B B、MoMo等微量元素等微量元素组成，这组成，这些元素最终些元素最终来自
9、外界环境中来自外界环境中的各种有机物和无机物。的各种有机物和无机物。思考：为什么各种培养基的具体配方不同，但一般都有水、思考：为什么各种培养基的具体配方不同，但一般都有水、无机盐、碳源和氮源？无机盐、碳源和氮源？3.3.培养基的营养构成培养基的营养构成提供提供碳碳元素元素的物质的物质提供提供氮氮元素元素的物质的物质3.3.培养基的营养构成培养基的营养构成为微生物提供除碳、氮为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素，以外的各种重要元素，包括大量元素和微量元包括大量元素和微量元素素由于缺乏合成这些由于缺乏合成这些物质所需的酶或合物质所需的酶或合成能力有限成能力有限（2 2）培养基还需要满足微生物生长
10、对）培养基还需要满足微生物生长对pHpH、特殊营养物质、特殊营养物质以以及及氧气氧气的需求。的需求。培养培养厌氧微生物厌氧微生物时，需要提供时，需要提供 的条件。的条件。培养培养乳酸杆菌乳酸杆菌时，需要在培养基中添加时，需要在培养基中添加 ；培养培养霉菌霉菌时，需要将培养基调至时，需要将培养基调至 ；培养培养细菌细菌时，需要将培养基调至时，需要将培养基调至 ；维生素维生素酸性酸性中性或弱碱性中性或弱碱性无氧无氧3.3.培养基的营养构成培养基的营养构成三、无菌技术消毒消毒灭菌灭菌1.1.获得纯净的微生物培养物的关键是获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染防止杂菌污染。无无菌技术菌技术应围绕着
11、如何避免杂菌污染展开。应围绕着如何避免杂菌污染展开。二、无菌技术二、无菌技术二、无菌技术2.2.无菌技术的类型无菌技术的类型（1 1）消毒）消毒概念：使用较为概念：使用较为温和的温和的物理、化学或生物等方法杀死物物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部体表面或内部一部分一部分微生物。微生物。适用对象：对适用对象：对操作空间操作空间、操作者的衣着操作者的衣着和和手手进行清洁进行清洁和消毒。和消毒。（2 2）灭菌）灭菌概念：使用概念：使用强烈的强烈的理化方法杀死物体内外理化方法杀死物体内外所有微生物所有微生物，包括芽孢和孢子。包括芽孢和孢子。适用对象：用于微生物培养的适用对象：用于微生物培养的器皿
12、、接种用具器皿、接种用具和和培养培养基基等进行灭菌。等进行灭菌。芽孢芽孢指某些细菌（如芽孢杆菌等）在一定指某些细菌（如芽孢杆菌等）在一定条件下细胞质高度浓缩脱水所形成的一种条件下细胞质高度浓缩脱水所形成的一种抗逆性很强抗逆性很强的球形或椭圆形的的球形或椭圆形的休眠体休眠体。芽。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有的环境有很强的抵抗力很强的抵抗力。如某些细菌的芽。如某些细菌的芽孢煮沸孢煮沸3 3小时才死亡。每个细菌仅形成一小时才死亡。每个细菌仅形成一个芽孢。个芽孢。孢子孢子指细菌、真菌、原生动物和植物等产指细菌、真菌、原生动物和植物等产生的一种生的一
13、种有繁殖作用有繁殖作用的的生殖细胞生殖细胞。正常情。正常情况下不需要两两结合就可以由单个细胞直况下不需要两两结合就可以由单个细胞直接发育成新个体。接发育成新个体。知识拓展知识拓展3.3.常用的消毒和灭菌方法常用的消毒和灭菌方法（1 1）常用的消毒方法）常用的消毒方法*：照射前适当喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加：照射前适当喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果。强消毒效果。3.3.常用的消毒和灭菌方法常用的消毒和灭菌方法（1 1）常用的消毒方法）常用的消毒方法煮沸消毒法煮沸消毒法巴氏消毒法巴氏消毒法化学药物消毒法化学药物消毒法紫外线消毒法紫外线消毒法消毒方法消毒方法超净工作台相
14、关信息（相关信息（p10p10）：）：生物消毒法生物消毒法是指利用生物或其代谢物除是指利用生物或其代谢物除去环境中的部分微生物的方法。例如有的微生物能够寄生于去环境中的部分微生物的方法。例如有的微生物能够寄生于多种细菌体内，使细菌裂解，因此可以用它们来净化污水、多种细菌体内，使细菌裂解，因此可以用它们来净化污水、污泥。污泥。湿热灭菌：利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌的方湿热灭菌：利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌的方式。式。高压蒸汽灭菌锅易错提醒易错提醒高压蒸汽灭菌的高压蒸汽灭菌的2 2个注意点个注意点（1 1）高压蒸汽灭菌开始之前要将锅内的冷空气排尽。）高压蒸汽灭菌开始之前要将锅内的冷
15、空气排尽。因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。于饱和蒸汽的温度。（2 2）灭菌完毕后，要待压力降到）灭菌完毕后，要待压力降到0 0时才能打开排气阀。时才能打开排气阀。否则会导致锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于否则会导致锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。培养基而发生污染。干热灭菌箱干热灭菌箱干热灭菌：干
16、热灭菌：干热灭菌箱内干热灭菌箱内160-170 160-170 下加热下加热2-3h2-3h。充分燃烧层充分燃烧层（外焰）（外焰）灼烧灭菌：直接在酒精灯火焰的灼烧灭菌：直接在酒精灯火焰的充分燃烧层充分燃烧层灼烧。灼烧。接种针接种针接种环接种环涂布器涂布器4.4.防止杂菌污染的措施防止杂菌污染的措施（1 1）实验前：）实验前：对操作空间、操作人员对操作空间、操作人员消毒消毒；对所用器皿、接种用具和培养基对所用器皿、接种用具和培养基灭菌灭菌。避免避免已灭菌处理材料用具与周围物品接触已灭菌处理材料用具与周围物品接触造成造成污染污染；为避免周围微生物污染，实验操作都应在为避免周围微生物污染，实验操作都
17、应在超净工作台超净工作台并在并在酒精灯火焰旁酒精灯火焰旁进行。进行。（2 2）操作时：）操作时：P10P10旁栏思考：旁栏思考：无菌技术除了用来无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染微生物污染外，还有什么目的？外，还有什么目的？还能有效避免操作者自身被微生物感染。还能有效避免操作者自身被微生物感染。4.4.防止杂菌污染的措施防止杂菌污染的措施（3 3）实验后：）实验后：使用后的培养基在使用后的培养基在丢弃前丢弃前一定要进行一定要进行灭菌灭菌处理，以免污染环境。处理，以免污染环境。湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）干热灭菌干热灭菌灼烧灭菌
18、灼烧灭菌化学药物消毒（酒精）化学药物消毒（酒精）紫外线消毒紫外线消毒巴氏消毒法巴氏消毒法【巩固练习】以下所采用的灭菌或消毒方法依次是【巩固练习】以下所采用的灭菌或消毒方法依次是化学药物消毒（次氯酸钠）化学药物消毒（次氯酸钠）培养基培养基培养皿培养皿接种环接种环实验操作者的双手实验操作者的双手实验室实验室牛奶牛奶有活性生物材料有活性生物材料四、微生物的纯培养123451.1.培养物：培养物：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含条件下形成的含特定种类微生物特定种类微生物的群体成为培养物。的群体成为培养物。（一）相关概念（一）相关概念3.3.纯培
19、养：纯培养：获得纯培养物的过程就是获得纯培养物的过程就是纯培养纯培养，包括，包括制备制备培养基培养基（包括（包括配制培养基、灭菌、倒平板配制培养基、灭菌、倒平板）、）、接种、分接种、分离离和和培养培养等步骤。等步骤。2.2.纯培养物：纯培养物：由由单一个体单一个体繁殖所获得的微生物群体称繁殖所获得的微生物群体称为为纯培养物。纯培养物。（二）酵母菌的纯培养（二）酵母菌的纯培养不同菌落的大小、形状、光不同菌落的大小、形状、光泽度、颜色等不同。泽度、颜色等不同。1.1.纯培养的原理纯培养的原理（1 1）分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁）分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形
20、成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落（菌落属于是菌落（菌落属于种群种群）。）。（2 2）采用）采用平板划线法平板划线法和和稀释涂布平板法稀释涂布平板法能将能将单个微生物单个微生物分分散到固体培养基上，之后经培养得到的散到固体培养基上，之后经培养得到的单菌落单菌落一般是由单一般是由单个微生物繁殖形成的个微生物繁殖形成的纯培养物纯培养物。微生物群微生物群分散分散单个细胞单个细胞单个菌落单个菌落繁殖繁殖2.2.目的要求目的要求（1 1）学会配制培养酵母菌的培养基并）学会配制培养酵母菌的培养基并倒平板。倒平板。（2 2）学会进行无菌操作
21、。）学会进行无菌操作。（3 3）尝试通过平板划线操作来获得纯）尝试通过平板划线操作来获得纯化的酵母菌菌落。化的酵母菌菌落。（二）酵母菌的纯培养（二）酵母菌的纯培养酵母菌菌落：酵母菌菌落：湿润，粘稠，易湿润，粘稠，易挑起，表面光华，挑起，表面光华，比细菌的菌落大比细菌的菌落大而厚。而厚。配制培养基：配制培养基：称取去皮称取去皮马铃薯马铃薯200g200g，切成小块，加水，切成小块，加水1000ml1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤纱布过滤。向滤液。向滤液中加入中加入20g20g葡萄糖葡萄糖、15-20g15-20g琼脂琼脂，用，用蒸馏水蒸馏水定容至定容至10
22、00ml1000ml（定容）（定容）。（1 1）制备培养基）制备培养基（二）酵母菌的纯培养（二）酵母菌的纯培养3.3.方法步骤方法步骤灭菌：灭菌：将配制好的将配制好的培养基培养基（湿热灭菌）（湿热灭菌）转移到锥形瓶中，转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽高压蒸汽灭菌锅灭菌锅中，在压力为中，在压力为100kPa100kPa、温度为、温度为121121的条件下，灭的条件下，灭菌菌15-30min15-30min。将将5-85-8套套培养皿培养皿（干热灭菌）（干热灭菌）包成一包，用几层牛皮包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入纸包紧，放入
23、干热灭菌箱干热灭菌箱内，在内，在160-170160-170灭菌灭菌2h2h。（1 1）制备培养基）制备培养基（二）酵母菌的纯培养（二）酵母菌的纯培养3.3.方法步骤方法步骤.拔出锥形瓶的棉塞。拔出锥形瓶的棉塞。.将瓶口迅速通过该将瓶口迅速通过该火焰火焰。.用拇指和食指将培养皿打用拇指和食指将培养皿打开一条开一条稍大于瓶口的缝隙稍大于瓶口的缝隙，将，将培养基（培养基（10-20ml10-20ml）倒入培养皿，）倒入培养皿，立即盖上皿盖。立即盖上皿盖。.等待培养基冷却凝固后，等待培养基冷却凝固后，将培养皿将培养皿倒过来放置倒过来放置。（1 1）制备培养基）制备培养基倒平板：倒平板：待培养基冷却到
24、待培养基冷却到5050左右左右时，在时，在酒精灯火焰附酒精灯火焰附近近倒平板。倒平板。2.2.倒平板要在酒精灯火焰附近进行？倒平板要在酒精灯火焰附近进行？思考思考 讨论讨论防止空气中微生物污染。防止空气中微生物污染。3.3.将瓶口迅速通过火焰？将瓶口迅速通过火焰？通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。培养基。1.1.如何估计培养基的温度（如何估计培养基的温度（5050左右）？左右）？可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。感觉温度下降到刚刚不烫手即可。6.6.怎么确定所倒平板未被杂怎么确定所倒平板未被杂
25、菌污染？菌污染？5.5.平板冷凝后，要将平板倒置？平板冷凝后，要将平板倒置？思考思考 讨论讨论防止皿盖上的冷凝水落入防止皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染。培养基造成污染。将所倒平板放入将所倒平板放入3737的恒温箱中培养的恒温箱中培养12h12h24h24h，观察，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。4.4.倒平板时不能将培养皿完倒平板时不能将培养皿完全打开？全打开？防止空气中杂菌污染。防止空气中杂菌污染。（1 1）培养基灭菌后，需冷却至）培养基灭菌后，需冷却至50 50 左右时左右时才能倒平板，才能倒平板，温度过高会烫手，温度过低培
26、养基又会凝固。温度过高会烫手，温度过低培养基又会凝固。（2 2）整个操作在）整个操作在酒精灯火焰旁附近酒精灯火焰旁附近进行，避免周围环境中进行，避免周围环境中微生物的污染。微生物的污染。（3 3）平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置，既可）平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置，既可以使以使培养基表面的水分更好地挥发培养基表面的水分更好地挥发，又可，又可防止皿盖上的水防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染珠落入培养基，造成污染。倒平板的注意事项倒平板的注意事项（4 4）倒平板时不要将）倒平板时不要将培养基溅在皿盖与皿底之间培养基溅在皿盖与皿底之间，否则此，否则此培养基不能用培养基不能用来培
27、养微生物，因为空气中的微生物可能在来培养微生物，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。皿盖与皿底之间的培养基上滋生。（5 5）将）将所倒平板所倒平板放入放入3737的恒温箱中的恒温箱中培养培养12h12h24h24h，观察，观察是否有菌落存在以确定是否有菌落存在以确定是否被污染是否被污染或或灭菌是否彻底灭菌是否彻底。倒平板的注意事项倒平板的注意事项2.2.接种和分离酵母菌接种和分离酵母菌（1 1）平板划线法：）平板划线法：通过通过接种环接种环在固体培养基表面在固体培养基表面连续连续划线划线的操作，将聚集的菌种逐步的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散稀释分散到培养基表到培养基表面。经
28、过数次划线后培养可以分离得到面。经过数次划线后培养可以分离得到单菌落单菌落。单个细胞单个细胞微生物群微生物群单个菌落单个菌落连续划线连续划线分散分散或或稀释稀释生长繁殖生长繁殖单菌落（2 2）平板划线法的具体操作）平板划线法的具体操作2.2.接种和分离酵母菌接种和分离酵母菌将将接种环接种环放在火焰放在火焰上灼烧，直到接种环上灼烧，直到接种环的金属丝烧红。的金属丝烧红。在火焰旁在火焰旁冷却冷却接种接种环。同时，拔出装有酵母菌培养液的试管的棉塞。环。同时，拔出装有酵母菌培养液的试管的棉塞。将将试管口通过火焰试管口通过火焰（灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染（灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基）培养基
29、）。在在火焰火焰附近用接种环蘸取一环菌液。附近用接种环蘸取一环菌液。将将试管口通过火焰试管口通过火焰，并塞上棉塞。，并塞上棉塞。在火焰附近将皿盖打开一条在火焰附近将皿盖打开一条缝隙缝隙，用接种环在培养基，用接种环在培养基表面迅速表面迅速划三至五条平行线划三至五条平行线，盖上皿盖。，盖上皿盖。灼烧接种环灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的，待其冷却后，从第一次划线的末端末端开始开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。注意不要将最后一次的划线与第一次的划线相连。注意不要将最后一次的划线与第一次的划线相连。（2 2）平板划线法的具体操
30、作）平板划线法的具体操作2.2.接种和分离酵母菌接种和分离酵母菌1.1.在灼烧接种环之后，为什么要等其在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后冷却后再进行划线？再进行划线？2.2.为什么每次划线之前都要灼烧接种环？为什么每次划线之前都要灼烧接种环？以免接种环温度太高，杀死菌种。以免接种环温度太高，杀死菌种。思考 讨论第一次划线前：第一次划线前：杀死接种环上的微生物，避免污染培养物。杀死接种环上的微生物，避免污染培养物。第二次及以后划线前：第二次及以后划线前：杀死上次划线时残留菌种杀死上次划线时残留菌种，保证每次，保证每次划线菌种划线菌种来自上次划线末端来自上次划线末端。3.3.划线操作结束时，仍然
31、需要灼烧接种环吗？划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？杀死残留菌种，避免污染环境和感染操作者。杀死残留菌种，避免污染环境和感染操作者。思考思考 讨论讨论4.4.划五次线，接种环需要灼烧划五次线，接种环需要灼烧几次几次？第第1 1次划线次划线接种环灭菌接种环灭菌第第2 2次划线次划线接种环灭菌接种环灭菌第第3 3次划线次划线接种前接种环灭菌接种前接种环灭菌接种环灭菌接种环灭菌第第4 4次划线次划线接种环灭菌接种环灭菌第第5 5次划线次划线接种环灭菌接种环灭菌需要灼烧需要灼烧6 6次。次。5.5.第二次及以后的划线时，为什么总是从上一次划线的第二次及以后的划线时，为什么总是从上一次划线的末端开始
32、划线？末端开始划线？6.6.为什么不能将最后一次的划线与第一次的划线相连？为什么不能将最后一次的划线与第一次的划线相连？将聚集的菌种将聚集的菌种逐步稀释逐步稀释，以便获得，以便获得单菌落单菌落。线条线条末端末端酵母菌的酵母菌的数目数目比比起始处要少起始处要少，每次从上一次划，每次从上一次划线的线的末端开始末端开始，能使酵母菌的数目，能使酵母菌的数目随着划线次数的增加随着划线次数的增加而逐步减少而逐步减少，最终能得到，最终能得到单菌落单菌落。思考思考 讨论讨论菌种经数次划线后培养，分离得到菌种经数次划线后培养，分离得到单菌落单菌落。第一次划线酵母菌数量多，最后一次划线酵母菌数量第一次划线酵母菌数
33、量多，最后一次划线酵母菌数量少，首尾相连，不容易得到单个菌落。少，首尾相连，不容易得到单个菌落。第一次划线前第一次划线前：杀死接种环上的微生物杀死接种环上的微生物，避免污染培，避免污染培养物。养物。第二次及以后划线前第二次及以后划线前：杀死上次划线时残留菌种杀死上次划线时残留菌种，保，保证每次划线菌种来自上次划线末端。证每次划线菌种来自上次划线末端。划线结束后划线结束后：杀死接种环残留菌种杀死接种环残留菌种，避免污染环境和，避免污染环境和感染操作者。感染操作者。（1 1）接种环只）接种环只蘸一次蘸一次菌液，但要在培养基不同位置菌液，但要在培养基不同位置连续划连续划线多次线多次。平板划线法的注意
34、事项平板划线法的注意事项（2 2）灼烧接种环之后，要）灼烧接种环之后，要冷却后冷却后再进行操作，以免温度再进行操作，以免温度太高杀死菌种。太高杀死菌种。（3 3）接种环的灼烧：）接种环的灼烧：（6 6）划线时，）划线时，最后一次最后一次的划线的划线不要与第一次不要与第一次的划线的划线相连相连。平板划线法的注意事项平板划线法的注意事项（4 4）划线五次，接种环需要灼烧）划线五次，接种环需要灼烧6 6次。次。（5 5）第二次及以后的划线时，要从上）第二次及以后的划线时，要从上一次划线的一次划线的末端末端开始划线，为了开始划线，为了将聚集将聚集的菌种的菌种逐步稀释逐步稀释，以便获得，以便获得单菌落单
35、菌落。思考思考1 1：为什么要将平板倒置？：为什么要将平板倒置？思考思考2 2：为什么要同时放入一个：为什么要同时放入一个未接种未接种的平板？的平板？可以防止皿盖上的水珠落入培养基，可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。造成污染。作对照，检验培养基作对照，检验培养基灭菌是否彻底灭菌是否彻底或或是否是否被杂菌污染被杂菌污染。完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板接种后的平板和和一个未接种一个未接种的平板的平板倒置倒置，放入，放入2828左右左右（培养温度因酵（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱恒温培养箱中培养中培养24-48 h24-48 h。3.3.培养酵母菌培养酵母菌