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1、微生物的选择培养和计数本节聚焦u怎样运用生物与环境相适应的观点来理解选择培养的原理？u如何通过调整培养基的配方来有目的地培养某种微生物？u测定微生物数量的常用方法有哪些？微生物的选择培养微生物的选择培养和计和计数数单元主题1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？提出问题土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何分离它们？每克土壤样品究竟含有多少这样的细菌？分离计数背景资料 【资料【资料1 1】尿素尿素CO(NHCO(NH2 2)2 2含氮量高，化学性含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素尿素施入土壤后，会施入土壤后，会被土壤中被土壤中的的某些细
2、菌分解成某些细菌分解成NHNH3 3，再被转化为，再被转化为NONO3 3-、NHNH4 4+等被植物吸收等被植物吸收。而这些细。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶。脲酶催化尿素分解产生脲酶催化尿素分解产生NHNH3 3，NHNH3 3可作为细菌生长的氮可作为细菌生长的氮源源。CO(NHCO(NH2 2)2 2脲酶脲酶 +H +H2 2O O+CO+CO2 22NH2NH3 3【资料【资料2 2】绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但】绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。思考
3、思考1 1：如果让你配制一种培养基，将土壤中能分解尿如果让你配制一种培养基，将土壤中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？思考思考1 1：如果让你配制一种培养基，将土壤：如果让你配制一种培养基，将土壤中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？该如何设计？培养基添加尿素作为唯一氮源，只有能合成培养基添加尿素作为唯一氮源，只有能合成培养基添加尿素作为唯一氮源，只有能合成培养基添加尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生脲酶的微生
4、物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生长、物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生长、物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生长、物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生长、发育、繁殖，所以用此培养基就能够选择出分发育、繁殖，所以用此培养基就能够选择出分发育、繁殖，所以用此培养基就能够选择出分发育、繁殖，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。解尿素的微生物。解尿素的微生物。解尿素的微生物。思考思考2 2：该培养基与普通培养基有哪些异同？：该培养基与普通培养基有哪些异同？思考思考2 2：该培养基与普通培养基有哪些异同？：该培养基与普通
5、培养基有哪些异同？除尿素作为唯一氮源，其余均相同除尿素作为唯一氮源，其余均相同 概念：在微生物学中，将允许特定种类的微概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为长的培养基称为选择培养基。选择培养基。选择培养基选择培养基（selective mediumselective medium）思考思考3 3：选择培养基运用了什么原理：选择培养基运用了什么原理？生物与环境相适应生物与环境相适应思考思考4 4：逆转录：逆转录-聚合酶链式反应，即聚合酶链式反应，即RT-PCRRT-PCR技技术，是检测新冠病毒（术，是检
6、测新冠病毒（2019-nCoV2019-nCoV）核酸最为主流）核酸最为主流的方法，该过程中需要用到耐高温的的方法，该过程中需要用到耐高温的DNADNA聚合酶，聚合酶，尝试运用上述原理思考，如何寻找耐高温的酶？尝试运用上述原理思考，如何寻找耐高温的酶？耐高温的酶耐高温的酶耐高温生物体耐高温生物体 高温环境高温环境（热泉、火山口）（热泉、火山口）寻找寻找寻找寻找科学实例19731973年，科学家布鲁克在美国黄石国家公园年，科学家布鲁克在美国黄石国家公园的热泉中发现了耐热的水生栖热菌（的热泉中发现了耐热的水生栖热菌（Thermus Thermus aquaticusaquaticus)，并从这种菌
7、种中提取出耐高温的，并从这种菌种中提取出耐高温的DNADNA聚合酶。聚合酶。启示：启示：寻找寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。到相应的环境中去寻找。思考思考5 5：为什么水生栖热菌能从热泉中被筛选：为什么水生栖热菌能从热泉中被筛选出来呢？出来呢？水生栖热菌能在水生栖热菌能在70708080的高温条件下生存，的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。而绝大多数微生物在此条件下不能生存。1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？单元主题选择培养基？选择培养基？对土样进行适当的处理对土样进行适当的处理科学的测定微生物数量的方法科学的
8、测定微生物数量的方法稀释涂布平板法稀释涂布平板法稀释稀释概念：将将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。行培养。主要过程主要过程:A.A.梯度稀释菌液梯度稀释菌液 B.B.涂布平板涂布平板当样品稀释度足够高时，能在培养基表面形成当样品稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌单个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌原理原理:学习任务一学习任务一 根据选择培养基、稀释涂布平板法的根据选择培养基、稀释涂布平板法的相关内容，以实验小组为单位，围绕单元主
9、题相关内容，以实验小组为单位，围绕单元主题“1g“1g土壤中有多少能分解尿素的细菌土壤中有多少能分解尿素的细菌”，进行实，进行实验设计。验设计。学习任务二学习任务二 观看观看“土壤中分解尿素的细菌土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的分离与计数”虚拟仿真实验视频，小组虚拟仿真实验视频，小组合作思考讨论完成下列问题：合作思考讨论完成下列问题：（1 1）如何确保本实验的准确性（有哪些注意事）如何确保本实验的准确性（有哪些注意事项）？（项）？（2 2）经稀释涂布平板法统计的菌落数是）经稀释涂布平板法统计的菌落数是否为实际数目？（否为实际数目？（3 3）还有其他测量微生物数量）还有其他测量微生物数量的方法
10、吗？（的方法吗？（4 4）实验结果中的单菌落周围为何实验结果中的单菌落周围为何有红色区域？有红色区域？土壤中分解尿素的细菌的分离与计数土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验名称实验名称实验目的实验目的实验原理实验原理实验材料实验材料利用选择培养基从土壤中分离能分解尿素的细菌并计数利用选择培养基从土壤中分离能分解尿素的细菌并计数绝绝大大多多数数微微生生物物都都能能利利用用葡葡萄萄糖糖，但但是是只只有有能能合合成成脲脲酶酶的的微微生生物物才才能能分分解解尿尿素素，利利用用以以尿尿素素作作为为唯唯一一氮氮源源的的选选择择培培养养基基，可可以以从从土土壤壤中中分分离离出出分分解解尿尿素素的细菌的细菌。实
11、验用具实验试剂微生物微生物的的数量测定数量测定计算公式计算公式:每每g g样品中的菌落数样品中的菌落数 (CV)M(CV)MM M代表稀释倍数代表稀释倍数C C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V V代表涂布平板时所用的稀释液的体积代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)(mL)稀释涂布平板法稀释涂布平板法此实验在稀释倍数此实验在稀释倍数10105 5获得获得3 3个平个平板，菌落数分别是板，菌落数分别是290290、282282、270270，涂布平板时均使用，涂布平板时均使用0.1ml0.1ml菌菌液，如何计算每克土壤中可以分液，如何计算每克土壤中
12、可以分离尿素的细菌数目？离尿素的细菌数目？（290+282+270290+282+270）/3/30.10.1 10 105 5 2.8 10 2.8 108 8个个1.1.如何确保如何确保“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验的准确？实验的准确？选择选择30-30030-300个菌落的平板进行计数；个菌落的平板进行计数；每个稀释度至少取每个稀释度至少取3 3个平板取其平均值；个平板取其平均值；分析实验结果时，要考虑平行组结果是否接近，分析实验结果时，要考虑平行组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验；如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验；
13、本次实验平板和试管较多，使用前需做好标记，本次实验平板和试管较多，使用前需做好标记，如组别、培养日期和样品稀释度等信息；如组别、培养日期和样品稀释度等信息；问题探究 设置牛肉膏蛋白胨培养基以判断选择培养基是设置牛肉膏蛋白胨培养基以判断选择培养基是否有选择作用；否有选择作用；2 2个空白对照组（未接种的选择培个空白对照组（未接种的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基）检测培养基是否含养基和牛肉膏蛋白胨培养基）检测培养基是否含有杂菌。有杂菌。恰当的稀释度、涂布是否均匀恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。是成功统计菌落数目的关键。统计统计的菌落往往比活菌的实际数目低；的菌落往往比活菌的实际
14、数目低；统计的结果一般用菌落数而不是活菌数来表示；统计的结果一般用菌落数而不是活菌数来表示；2.2.经稀释涂布平板法统计的菌落数是否为实际数目？经稀释涂布平板法统计的菌落数是否为实际数目？问题探究 当两个或多个细胞连在一起时，当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。平板上观察到的只是一个菌落。血细胞计数板血细胞计数板（图片来源：作者拍摄）3.3.除稀释涂布平板法外，还有其他测定微生物数量的方法吗？除稀释涂布平板法外，还有其他测定微生物数量的方法吗？稀释涂布平板法稀释涂布平板法 显微镜直接计数法显微镜直接计数法 细菌计数板细菌计数板 血细胞计数板血细胞计数板间接计数法间接计数法直接计数法直接计数法问题探究统计结果一般偏大：统计结果一般偏大：是活菌和死菌数的总和是活菌和死菌数的总和4.4.实验中，为何观察的单菌落周围有红色区域？实验中，为何观察的单菌落周围有红色区域？本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌,对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。问题探究方法方法：在培养基中加入酚红指示剂在培养基中加入酚红指示剂CO(NHCO(NH2 2)2 2+H+H2 2O O脲酶脲酶2 2NHNH3 3+CO+CO2 2呈碱性，呈碱性，遇酚红指示剂呈遇酚红指示剂呈 红红 色色鉴别培养基THANK YOU!