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1、第2节微生物的培养技术及应用一、微生物的基本培养技术一、微生物的基本培养技术二、微生物的选择培养和计数二、微生物的选择培养和计数录目Contents1234培养基的配置Medium configuration无菌技术Aseptic technique微生物的纯培养Pure culture习题巩固Exercises to consolidate 向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶，由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶，自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事件屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有有杂杂菌菌混混入入。那么，怎样才能保证无处不在的
2、杂菌不混入发酵物中呢？应该先对制作用具和原料进行灭菌处理，再应该先对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种接种纯的菌种纯的菌种，并控制发酵条件，并控制发酵条件，避免杂菌进入避免杂菌进入。防止杂菌污染防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物获得纯净的微生物培养物是研究和是研究和应用微生物的前提，也是发酵工程的重要基础应用微生物的前提，也是发酵工程的重要基础微生物的类群The taxa of microorganisms微生物 难以用肉眼观察的微小生物。难以用肉眼观察的微小生物。无细胞结构原核细胞真核细胞真菌：酵母菌、毛霉等；原生生物：草履虫、变形虫等微生物的类群病毒：SARS病毒、新冠病毒等RAN病毒；
3、噬菌体等DNA病毒细菌:蓝细菌、大肠杆菌、乳酸菌等；放线菌链霉菌等培养微生物的条件Conditions for culture of microorganisms要为人们需要的微生物提供合适的_条件。要确保 ，并将需要的微生物分离出来。营养和环境营养和环境其他微生物无法混入其他微生物无法混入 微生物结构简单、形体微小，眼睛看不到，若想得到纯净的微生物，就必须对其进行培养和分离。实验室培养微生物的要求培养基培养基无菌技术、微生物的纯培养无菌技术、微生物的纯培养Part1培养基的配置Medium configuration一、培养基的配制【自主探究】请结合教材P9-10，思考这些问题。1.什么是培
4、养基？2.培养基的种类有哪些？3.培养基的用途有哪些？4.培养基的必备营养成分有哪些？5.配制培养基时，如何满足不同微生物的特殊需求？举例说明。人们按照微生物对 的不同需求，配制出供其_的营养基质。营养物质营养物质生长繁殖生长繁殖2.2.培养基种类培养基种类：按按物理状态物理状态来分来分：可分为：可分为液体液体培养基、培养基、固体固体培养基等。培养基等。固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基无无 有有 凝固剂凝固剂琼脂琼脂是一种从红藻中提取的多糖。在98以上熔化，在44以下凝固，在常规培养条件下呈固态。形成形成菌落菌落一、培养基的配制菌落分散的微生物在分散的微生物在固体培养基表面或内部固体培
5、养基表面或内部繁殖形成繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。群体。1.1.定义：定义：2.2.特征：特征：形状、形状、大小、大小、颜色、颜色、光泽度、透明度光泽度、透明度等。等。3.3.功能：功能：菌落是菌落是鉴定菌种鉴定菌种的重要的重要依据。依据。知识补充4.4.培养基的必备营养培养基的必备营养成分成分:水水、碳源碳源、氮源氮源、无机盐无机盐等。等。碳源碳源无机碳源：无机碳源：有机碳源：有机碳源：COCO2 2、NaHCONaHCO3 3糖类、脂肪酸、牛肉膏、蛋白胨等糖类、脂肪酸、牛肉膏、蛋白胨等氮源氮源无机氮源：无机氮源：有机氮源：有机氮源：主要
6、是铵盐、硝酸盐主要是铵盐、硝酸盐，还有，还有N N2 2和和NHNH3 3牛肉膏、蛋白胨、尿素等牛肉膏、蛋白胨、尿素等自养微生物自养微生物（提供碳元素）（提供碳元素）（提供氮元素）（提供氮元素）来源于动物原料，来源于动物原料，含有糖、维生素含有糖、维生素和有机氮等营养和有机氮等营养物质物质异养微生物异养微生物一、培养基的配制3.3.培养基的用途：培养基的用途：培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。P10P10旁栏思考旁栏思考1 1：为什么培养基需要氮源？：为什么培养基需要氮源？氮是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。氮是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。判断正误：1.含C、H、O、
7、N的有机物是异养微生物的碳源、氮源、能源？2.NH3对于硝化细菌来说，既是氮源，又是能源？一、培养基的配制5.特殊需求：特殊需求：满足微生物对满足微生物对 、的需求。的需求。特殊营养物质特殊营养物质pHO2培养厌氧微生物时，需要提供 的条件。培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加 ；培养霉菌时，需要将培养基调至 ；培养细菌时，需要将培养基调至 ；维生素酸性中性或弱碱性无氧一、培养基的配制举例：举例：1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成的营养构成(细菌培养基细菌培养基)培养基组分提供的主要营养牛肉膏 5g蛋白胨 10gNaCl 5gH2O 定容至1000ml碳源、氮
8、源、磷酸盐和维生素等碳源、氮源、磷酸盐和维生素等碳源、氮源和维生素等碳源、氮源和维生素等无机盐无机盐水水一、培养基的配制Part2无菌技术Aseptic technique二、无菌技术【自主探究】请结合教材P10-11，思考下列问题：1.获得纯净的微生物培养物的关键是什么？2.消毒和灭菌的区别是什么？3.消毒和灭菌常用的方法有哪些？他们适用于哪些对象？4.为了防止杂菌污染，具体措施有哪些？（实验前和操作时）防止杂菌污染消毒：消毒：是指使用较为是指使用较为 的物理、化学或生物等方法的物理、化学或生物等方法 杀死物体表面杀死物体表面或或内部内部一部分一部分微生物微生物。灭菌：灭菌：是指使用是指使用
9、强烈强烈的理化方法杀死的理化方法杀死 的微生物，的微生物，包括包括芽孢和孢子芽孢和孢子。温和温和物体内外所有物体内外所有2.消毒和灭菌的区别是什么？指某些细菌指某些细菌(如芽孢杆菌等如芽孢杆菌等)在一定条件下细胞质高度浓在一定条件下细胞质高度浓缩脱水所形成的一种缩脱水所形成的一种抗逆性很强抗逆性很强的球形或椭圆形的的球形或椭圆形的休眠休眠体体。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。如某些细菌的芽孢煮沸有很强的抵抗力。如某些细菌的芽孢煮沸3 3小时才死亡。小时才死亡。每个细菌仅形成一个芽孢。每个细菌仅形成一个芽孢。指细菌、真菌、
10、原生动物和植物等产生的指细菌、真菌、原生动物和植物等产生的一种有繁殖作用的一种有繁殖作用的生殖细胞生殖细胞。正常情况下。正常情况下不需要两两结合就可以由单个细胞直接发不需要两两结合就可以由单个细胞直接发育成新个体。育成新个体。芽孢芽孢孢子孢子知识拓展类型适用范围操作方法消毒灭菌较为温和理化方法，杀死部分微生物强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法日常生活100煮沸56min巴氏消毒法不耐高温的液体63-65处理30min72-76处理15s80-85处理10-15s化学药物消毒生物活体、水源等用酒精擦拭双手用氯气消毒水源紫外线消毒紫外线照射30min灼烧灭菌接种的工具，如涂
11、布器、接种针、接种环等，接种过程中的试管口或瓶口等直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧干热灭菌耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等物品放入干热灭菌箱,160170加热1-2h湿热灭菌培养基、无菌水等高压蒸汽灭菌锅内,100kPa,121,1530min接种室、接种箱，超净工作台二、无菌技术4.防止杂菌污染的措施：防止杂菌污染的措施：P10P10旁栏思考旁栏思考2 2：无菌技术除了用来：无菌技术除了用来防止实验室的培养物被防止实验室的培养物被其他其他外来外来微生物污染微生物污染外，还有什么目的外，还有什么目的？有效避免操作者被微生物感染有效避免操作者被微生物感染。实验前：实验前：u对操
12、作空间、操作者的衣着和手进行对操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒清洁和消毒u对所用器皿、接种用具和培养基等进行对所用器皿、接种用具和培养基等进行灭菌灭菌操作操作时：时：u避免避免已灭菌处理的材料用具与周围物品接触造成已灭菌处理的材料用具与周围物品接触造成污染污染u在在超净工作台超净工作台上并在上并在酒精灯火焰附近酒精灯火焰附近进行进行二、无菌技术2.以以下物品所采用的灭菌或消毒方法依次是下物品所采用的灭菌或消毒方法依次是培养基培养基培养皿培养皿接种环接种环实验操作者的双手实验操作者的双手实验室实验室牛奶牛奶有活性有活性生物材料生物材料 高压蒸汽灭菌干热灭菌灼烧灭菌化学药物消毒（酒精）紫外
13、线消毒巴氏消毒法【对点训练】化学药物消毒（次氯酸钠）3.在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题：(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具_(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是_可以在达到消毒目的的同时，基本不会破坏营养成分。【对点训练】(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能_。在照射前，适量喷洒_，可加强消毒效果。(4)水厂供应的自来水通常是经过_(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。损伤DNA结构消毒液氯气课前阅读1.研究
14、和应用微生物的前提是什么？2.哪种培养基表面或内部会长菌落？3.牛肉膏和蛋白胨都能为微生物提供哪些营养物质？4.培养乳酸菌，需要在培养基中添加哪种特殊营养物质？5.培养霉菌和细菌时，pH有何不同？6.获得纯净的微生物培养物的关键是？7.接种微生物的过程种，试管口、瓶口用什么方法灭菌？8.接种微生物的操作应该在什么附近？Part2微生物的纯培养Pure culture2.2.纯培养物：纯培养物：3.3.纯培养：纯培养：过程过程：配制配制培养基培养基灭菌灭菌接种接种分离分离培养培养由由单一单一个体繁殖所获得的微生物群体个体繁殖所获得的微生物群体。获得纯培养物的过程获得纯培养物的过程。1.1.培养物
15、：培养物：接种于接种于培养基培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体接种方法：接种方法：平板划线法、稀释涂布平板法平板划线法、稀释涂布平板法三、酵母菌的纯培养分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的菌落。采用平板划线法、稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上，培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。原理原理（一）制备培养基1.1.配制培养基：配制培养基：2.2.灭菌：灭菌：3.3.倒平板：倒平板：对培养对培养基基和培养和培养皿皿进行灭菌进行灭菌5050，酒精灯火焰附近，酒精灯火焰附近三、酵母菌的纯
16、培养马铃薯琼脂培养基（固体培养基）马铃薯琼脂培养基（固体培养基）如果要调节培养基的pH，应该在灭菌前还是灭菌后？灭菌前1.拨出锥形瓶棉塞。拨出锥形瓶棉塞。三、微生物的纯培养 培养基培养基 约约503.3.倒平板：酒精灯火焰附近倒平板：酒精灯火焰附近2.将瓶口迅速将瓶口迅速通过火焰通过火焰。通过灼烧灭菌，防止瓶口的通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。微生物污染培养基。三、微生物的纯培养3.3.倒平板：酒精灯火焰附近倒平板：酒精灯火焰附近3.用拇指和食指将培养皿用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于打开一条稍大于瓶口的缝隙瓶口的缝隙，将培养基，将培养基(约约1020mL)倒入倒入培养皿，立即盖上
17、皿盖。培养皿，立即盖上皿盖。3.3.倒平板：酒精灯火焰附近倒平板：酒精灯火焰附近三、酵母菌的纯培养4.培养基冷却培养基冷却凝固后凝固后，将培养皿将培养皿倒倒过来放过来放置置。防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染。防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染。3.3.倒平板：酒精灯火焰附近倒平板：酒精灯火焰附近三、酵母菌的纯培养温度温度：50左右左右操作操作：在酒精灯火焰附近：在酒精灯火焰附近冷凝后平板冷凝后平板倒置倒置3.3.倒平板：酒精灯火焰附近倒平板：酒精灯火焰附近三、酵母菌的纯培养 分离原理：通过分离原理：通过接种环接种环在固体培养基表面在固体培养基表面连续划线连续划线的操作，将的操作，将聚集聚集的
18、菌种逐步稀释的菌种逐步稀释分散分散到培养基表面。经到培养基表面。经数次数次划线后培养，可以分离得到划线后培养，可以分离得到单菌落单菌落。平板划线法单个细胞单个细胞微生物群微生物群单菌落单菌落连续划线连续划线稀释稀释分散分散生长繁殖生长繁殖（二）接种和分离酵母菌三、酵母菌的纯培养稀释涂布平板法平板划线法平板划线法（二）接种和分离酵母菌三、酵母菌的纯培养阅读阅读P13P13，熟悉平板划线法的具体操作流程，熟悉平板划线法的具体操作流程 4min 4min完成优佳学案P12 -接种环总共灼烧了几次？接种环总共灼烧了几次？五个区域，最可能形成单菌落的是？五个区域，最可能形成单菌落的是？棉塞拔下后能直接放
19、在实验台上吗？棉塞拔下后能直接放在实验台上吗？实验中，防止杂菌污染的操作有哪些？实验中，防止杂菌污染的操作有哪些？灼烧灼烧接种环接种环，直至接种环金属直至接种环金属丝烧红丝烧红在在火焰旁火焰旁冷却冷却接接种环种环，拔出酵母菌，拔出酵母菌培养液试管的棉塞培养液试管的棉塞 在火焰附近用接种在火焰附近用接种环蘸取一环菌液环蘸取一环菌液 将皿盖打开一条缝隙，将皿盖打开一条缝隙，将接种环在培养基表面将接种环在培养基表面迅速迅速划划3-53-5条平行线条平行线，盖上皿盖。盖上皿盖。试管口通过火焰，试管口通过火焰，并塞上棉塞并塞上棉塞 试管口试管口通过火焰通过火焰 灼烧灼烧接种环接种环，待其，待其冷却冷却后
20、，后，从第一次划线的从第一次划线的末端末端开始作第开始作第二次划线。二次划线。重复重复以上操作，作以上操作，作第三、四、五次划线。第三、四、五次划线。最后一最后一次划线不与第一次划线相连次划线不与第一次划线相连杀死接种环上原有微生物。杀死接种环上原有微生物。以免接种环温度太高，以免接种环温度太高，杀死菌种。杀死菌种。杀死上次划线后残留菌种，杀死上次划线后残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端次划线的末端杀死接种环上残留的菌种，杀死接种环上残留的菌种，避免污染环境和感染操作者。避免污染环境和感染操作者。思考：接种结束后还要灼烧接思考：接种结束后还要灼烧接种
21、环吗？种环吗？线条末端的菌体数量少，每次从末端划线，线条末端的菌体数量少，每次从末端划线，使使菌体的数目随着划线次数的增加而减少，最终分菌体的数目随着划线次数的增加而减少，最终分散成单个细胞，繁殖得到单菌落。散成单个细胞，繁殖得到单菌落。因为最后一次划线已经将菌种稀释成单个细胞，如果与因为最后一次划线已经将菌种稀释成单个细胞，如果与第一次划线相连，就增加了菌体的数量，难得到单菌落。第一次划线相连，就增加了菌体的数量，难得到单菌落。完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平接种后的平板板和和一个一个未接种未接种的平板的平板倒置倒置，放入，放入28左右的
22、左右的恒温培养箱恒温培养箱中中培养培养24-28h。检验培养基灭菌是否彻底（三）培养酵母菌三、酵母菌的纯培养成果分析与评价成果分析与评价2.2.正常情况下，培养基上能观察到几种形态的菌落？正常情况下，培养基上能观察到几种形态的菌落？如果有不同形态的菌落，分析原因？如果有不同形态的菌落，分析原因？一种；一种；无菌操作不规范或菌种不纯。无菌操作不规范或菌种不纯。分区划线法分区划线法12345接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次划线首尾不能相接每次划线前后对接种环进行灼烧灭菌不要划破培养基，划破后，一方面会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；另一方面存留在划破处的单个细胞无法形
23、成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。平板划线法平板划线法注意事项注意事项:ABCDEFGB、G、E、A、C、D、F请排序：评估论点的可信程度 所谓“酵素”，就是“酶”的另一种说法。“酵素”制作就是利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。这样制作的“酵素”中可能有糖类(包括-些简单的糖和膳食纤维等)、蛋白质(包括多种酶)、有机酸等成分，不存在它独有的、特殊的营养物质，其中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质，食用后可能会危害人体健康。因此，“吃水果酵素可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力”的论点值得怀疑。P14P14【思维训练】评估论点的可信程度【思维训练】
24、评估论点的可信程度 Part4习题巩固Exercises to consolidate习题巩固Exercises to consolidate1.微生物的纯培养既需要适宜的培养基，又要防止杂菌污染。判断下列相关表述是否正确。（1）培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利。（）（2）消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。（）（3）微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物。（）概念检测P14习题巩固Exercises to consolidate2.日常生活中保存食品的方法有哪些？这些方法是如何阻止或抑制微生物生长的？日常生活中保存食品的方法有干制、腌制、低温储存等。干制可以降低食品的水分
25、含量；腌制可以通过食盐、糖等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖；低温则是通过降低微生物的代谢速率来抑制微生物的生长和繁殖。概念检测P141.某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的培养基上轻轻按一下。然后用肥皂将该手洗干净，再将5个指尖在贴有“洗手后”标签的同种培养基上轻轻按一下。将这两个培养皿放入37恒温培养箱中培养24h后，发现贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少。请分析回答下列问题。（1）这个实验中需要进行灭菌处理的材料用具有?（2）“将指尖在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养中的哪一步操作？（1）培养皿和培养基。（2）接种。拓展应用P14（3）从实验结果来看,洗手后我们就能进行
26、无菌操作了吗？操作时，我们可以采用什么方法来避免手上微生物的污染？通过实验结果可以看到，洗手后手上还有一些微生物，不能直接进行无菌操作。可以通过用酒精棉球擦拭双手，或戴消过毒的手套等方法来避免手上微生物的污染。4.某生物兴趣小组将从葡萄皮上成功分离来的野生酵母菌分别接种于3个盛有等量同种液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床上培养，摇床转速分别为 210 r/min，230 r/min和250 r/min。培养时间与酵母菌种群密度的关系如下图所示。请分析回答下列问题。（1）摇床转速不同,意味着培养条件有什么不同？意味着培养液中02含量不同。（2）从图中数据你可以得出什么结论?其原因是什么?培养液中02含量越高,酵母菌种群密度越大。（3）为什么培养8h后，其中2个锥形瓶中酵母菌的种群密度基本达到稳定?这时候已经达到了环境容纳量。这时候已经达到了环境容纳量。1.什么是纯培养物？2.接种微生物常用的方法3.培养酵母菌的培养基叫？4.制备培养基时，先灭菌还是先倒平板？5.培养基和培养皿的灭菌方法？如何检验培养基灭菌是否彻底？6.培养基冷却到多少倒平板？平板冷凝后倒过来放置的原因？7.为什么从第一次划线的末端开始作第二次划线？课后作业课后作业