发酵法提取多糖-葛根多糖.docx

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1、酵母菌对葛根多糖提取影响的探究摘要 目的：对葛根进展发酵，在发酵液中提取葛根多糖，并优化发酵方法，使葛根多糖的提取率到达最优。 结果：使用酵母菌发酵后，葛根多糖的提取率为 0.79%，是一般水提醇沉提取葛根多糖提取率的 7 倍，证明此方法是适用的。由于方法简便、快速，可以用于大规模生产中。关键词： 酵母菌葛根 葛根多糖 发酵 提取率 生产Abstract:： Objective: To carry out the fermentation of puerarin in Pueraria extract broth polysaccharides, and optimize the fermen

2、tation method, so that the extraction rate of polysaccharides Puerarin optimum. Results: The use of yeast fermentation, the extraction of polysaccharides Puerarin rate of 0.79 percent is ordinary water extraction alcohol extraction rate of polysaccharides Puerarin 7 times to prove that this method i

3、s applicable. Since the methodis simple, rapid, and can be used for large-scale productionKey words: YeastPuerarinPuerarin polysaccharideFermentation Extraction rateYield概述：葛根Pueraria lobate(willd) Ohwi. 为豆科植物,取植物的块茎为用，为药用葛根。葛根味甘辛、性平，能解肌，退热去毒，生津止渴成效。葛根长于山区低凹地和灌木丛中， 是生命力坚韧的植物。我国利用葛根的历史已有二千多年，一方面作为中药材

4、用于治疗疾病， 另葛根中含巨量淀粉，也可以作为淀粉类食物。所以葛根有广泛的市场和种植地。据本草 纲目记载，葛根是一种应用面广的中药材。葛根中含葛根多糖对PC12 癌细胞的增值有损伤作用，具有抗肿瘤【10】和免疫活性【9】！前景宽阔。本试验承受药用粉葛，是经过炮制【12】的。值得说明，葛根多糖不等同于葛根淀粉，它们的理化性质也不尽一样。现有的葛根多糖提取方法多种多样，主要有煎煮会留提取，响应法提取，超微粉碎提取【1】，微波关心提【2】取 ，方法不多，但也不少，而且都是从物理变化上来转变提取率，不但提取率不高，而【3】且还用用到简单的仪器，不行取。本文供给的发酵法提取时用化学的方法提高提取率，也不

5、会用到简单的仪器，操作也相对简便。由于没有人用过类似的方法，所以本文只是一种探究。酵母菌有 2 种发酵方式， 一种是有氧 的 C HO +6O 6CO +6H O；一种 是无氧的6126222C HO 2C H OH+2CO +2ATP。,发酵温度在 20至 40。在无氧条件下接种即发酵母6126252菌后，在 6 个小时内酵母菌数量会增值到最大，之后发酵速度到达最大 。酵母菌能利用【5】多种糖类物质，但多糖类物质不是酵母菌优先利用的，只要我们能很好的掌握发酵时间，哪么定能提取到最多。并且酵母菌优先分解小分子糖类，使提取的葛根多糖含小分子糖类【12】更少，纯度更高。1. 材料与方法1.1 试验

6、药品：粉葛市售，范教师鉴定 即发酵母菌法国乐斯福公司生产 98%的乙醇分析纯 苯酚分析纯 发烟硫酸分析纯 三氯乙酸分析纯试验器材： SHZ-D3循环水式真空泵巩义市英峪予华仪器厂 752-UV 分光光度计尤尼可仪器 HZS-H 水浴震荡器哈尔滨市东明仪器厂 中药粉碎机(国产)1.2 预试试验：取 5g 葛根，在 30水浴震荡的条件下，实行 1%酵母菌发酵和不发酵处理。在24 小时后，取浸提液和发酵液进展醇沉【11】、过滤、沉淀蛋白质的处理，处理液在 490nm 处测定吸光度，由于A=C*E，所以吸光度与浓度成正相关，所以能以吸光度确定发酵的成果。1.3 最正确发酵时间确实定:1.将用途为发酵罐

7、作用的锥形瓶编号 112，16 试验组分别参加 5g 的粉碎葛根。78 为空白组，不做处理2.在锥形瓶中分别参加 1.2g 的酵母菌，参加 120ml 的水，保证酵母菌的浓度为1%。3.用塑料薄膜封口，用针在薄膜上插个小洞，保证二氧化碳的排出。4.将全部的锥形瓶放入震荡水浴锅中，温度掌握在 30，震荡。5.分别在 6h/8h/10h/12h/14h/16h 时，取试验组和比照组进展醇沉、溶解、沉淀蛋白质处理，并在 490nm 出测定各组的吸光度。1.4 正交试验证明酵母菌浓度、发酵时间、葛根的参加量对葛根多糖提取有显著影响。1.4.1.表头设计，如表 1表 1列号123因素ABCA：酵母菌浓度

8、 A : 发酵液中 2%的酵母菌浓度 A :1%A ：0%123B:发酵时间B :发酵 12 小时B ：24hB :36h123C:葛根的参加量C :参加 2g 粉碎葛根C :3gC :4g1231.4.2.取 9 只锥形瓶，按表 2 的试验方案参加药品、试剂。表 2试验号因素ABC1113212231314213522262317313832293311.4.3 在做好 1.4.2 步骤后，在每只锥形瓶中参加 120ml 的水，薄膜封口，用小针开 1 个孔，放入 30的水浴锅中震荡培育。1.4.4 分别在 12h/24h/36h 的时候取出相应的锥形瓶，将发酵液加热至沸腾一分钟，过滤取滤液1

9、20ml，缺乏的用蒸馏水补足。1.4.5 承受苯酚-硫酸法测定滤液中的葛根多糖的含量。在 120ml 滤液中用移液管移取【6】5ml，参加 2.5ml 的 4g/100ml 的苯酚摇匀，在缓慢滴加 12.5ml 的发烟硫酸，总共 20ml的反响液，过滤得滤液。1.4.6 由于反响液的颜色过深，所以稀释 100 倍。用分光光度计在 490nm 处测定反响液的吸光度，此吸光度就为葛根多糖的吸光度。1.5. 正交试验：求出在最正确发酵方案下葛根多糖的提取率。1.5.1 如 1.4.1 步骤，将因素变为A：发酵时间A :12hA:24hA :36h123B：酵母菌浓度 B :2%B :1%B :0%1

10、23C：葛根加量C :7gC :4gC :1g1.5.2 取 9 只锥形瓶，如 1.4.2 步骤。1.5.3 重复 1.4.3 步骤1.5.4 重复 1.4.4 步骤1231.5.5 取滤液 5ml，参加 4.5 倍计 22.5ml 乙醇，沉淀蛋白质和多糖，排出小分子的糖类， 然后过滤，取沉淀在常温下枯燥，得粗多糖，称重。1.5.6 三氯乙酸法精提葛根多糖 ，把沉淀溶于50 毫升 15%的三氯乙酸，过滤，出去蛋【7】白质沉淀，滤液为精巧的葛根多糖溶液，490nm 处分光光度计测滤液的吸光度。1.5.7 对精巧葛根多糖溶液浓缩，然后乙醇沉淀，沉淀物就是精巧葛根多糖精品。2. 结果与分析2.1 预

11、试试验证明在酵母菌发酵条件下葛根多糖的提取率大于一般煎煮提取。一方面由于酵母菌有破坏细胞壁的作用，有利于细胞内的葛根多糖溶出，另一方面酵母菌优先分解小分子糖类和淀粉，使溶液的浓度降低，有利于葛根多糖的溶出。2.2 最正确发酵时间的结果如表 3 ，可以看动身酵时间也是影响葛根多糖提取率的重要因素。时间试验组吸光度6h 0.0458h 0.03910h 0.051表 312h 0.06314h 0.06916h 0.061空白组吸光度0.0200.0130.0060.0010.0020.001实际吸光度0.0250.0260.0450.0620.0670.0602.2.1 依据表 3 数据可以做出

12、葛根多糖吸光度与发酵时间图，图 1 。葛根多糖吸光度与发酵时间图0.080.07度 0.06光吸 0.05糖 0.04多根 0.03葛 0.02精0.0100510发酵时间1520表 4从表 4 可以看出精葛根多糖与发酵时间的关系为波形分布。精葛根多糖的吸光度直接代表着精多糖的提取量。所以精多糖的提取率也和发酵时间存在一样的波形分布。而最正确发酵时间在 13 和 14 小时之间，在这个时间葛根多糖的提取率是最大的。虽然酵母菌的一般发酵时间在 40 小时左右。2.3 正交试验结果此法只为证明酵母菌浓度、发酵时间、葛根的参加量对葛根多糖提取率有影响，不能提取得到精巧葛根多糖。结果如表 4.表 4试

13、验号因素葛根多糖的吸光ABC度11130.06221220.03631310.01242130.04752220.03262310.02373130.02783220.02193310.017T10.1100.1360.0650.277(T)T20.1020.0890.102T30.0650.0520.110X10.036670.045330.02167X20.034000.029670.03400X30.021670.017330.03667结果分析：求得矫正数C=0.008525，总平方和SS =0.00198，A 因素的平方和TSS =0.0003847，B 因素的平方和SS =0.00

14、1182，C 因素的平方和SS =0.0003847,误差平ABC方和 SSe=0.0000286。可以求出F。变异来源DfMSFF0.05(2,2)列出方差分析表，进展F 检验， 表 5浓度 A20.000192413.4519.00时间 B20.000591041.34用量 C20.000192413.45误差20.0000143总变异8分析：依据F 检验，时间对多糖提取的影响是显著的，由于时间同样影响到因素A酵母菌浓度，而且在试验室条件下，因素 A酵母菌浓度对葛根多糖的提取影响也是显著的。因素A 与因素B 有交互作用，浓度的影响受到时间影响，时间又影响到提取率。而参加葛根的量的差距太小，

15、所以对提取率的影响不显著，设计2.4 试验的时候应当把葛根参加量的差距扩大。发酵温度选择在 30，也是通过观看得来的，在 25的时候发酵很缓慢，在 35发酵又太猛烈，简洁将封口薄膜冲破。得出结论：在酵母菌发酵条件下，酵母菌浓度和发酵时间都对葛根多糖的提取率有显著影响。2.4 葛根多糖提取率的结果如表 6：试验号因素表 6粗多糖质量精多糖的吸光ABCg度11110.42450.15821220.25880.10431330.08110.01742130.15980.04552210.33140.13462320.09480.02873120.20860.03383230.12370.017933

16、10.11170.0482.4.1 绘制葡萄糖吸光度的标准曲线：取葡萄糖于105 枯燥至恒重准确称取20mg 加15%的三氯乙酸溶解定容至500ml 即可得到浓度为0.04mg/ml的葡萄糖标准溶液。分别吸取0.0 /0.2/ 0.4/ 0.6/ 0.8 /1.0/1.2/1.4 ml 的0.04mg/ml 的葡萄糖标准液置于10ml 试管中各加15%的三氯乙酸补足至标准液体积(ml)0.00.20.40.60.81.0标准液浓度(u g/ml)0.08.016.024.032.040.0吸光度0.0000.0540.1230.1690.2190.28710 m l。然后于4 9 0 n m

17、处测吸光度【8】。结果如表7 表7绘制图表如以下图2 图2葡萄糖标准曲线4030200.250.20.15 度光1000.10.050吸123葡萄糖浓度45R*R=0.998512.4.2 求得m =23.1*50*24=27.70mg提取率P=0.40%1m =15.2*50*24=18.24mgP=0.47%2m =1.18mgP=0.11%3m =7.89mgP=0.79%4m =23.50mgP=0.34%56m =4.91mgP=0.12%m =5.79mgP=0.14%7m =2.98mgP=0.29%8m =7.91mgP=0.13%9可以得出4号试验的提取率最高A2B1C3,就

18、是发酵24小时，酵母菌浓度为2%，参加葛根的量为1g，是空白提取的7倍。依据以上数据，可以分析出，酵母菌的提取率还可以提高的，试验室条件有限，就不再进展了。3. 争论3.1. 试验原理：1.酵母菌发酵能大量的利用葛根淀粉，使溶液的浓度变低，有利于葛根多糖的溶解。2.酵母菌或许可以破坏葛根细胞的细胞壁，使细胞内物质能更好的溶解出来。3.2. 前景：此方法大大的缩短了煎煮时间，节约了能量的消耗，而且发酵操作也相当的简洁、便利。此方法比一般提取多糖的方法更快捷、节约。4. 参考文献【1】张永军 ，刘晓宇， 黄惠华.响应面法优化葛根多糖提取工艺的争论.现代食品科技.20237.【2】张加梅， 陈光芝

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