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1、中华人民共和国教育部东北林业大学毕 业 论 文 论文题目： 超声波-酶法联合提取榛蘑多糖工艺研究 学 生： 冷帅辰 指导教师： 赵晓丹 讲师 学 院： 林学院 专 业： 食品科学与工程2008级1班 2012年6月东北林业大学毕 业 论 文 任 务 书论文题目 超声波-酶法联合提取榛蘑多糖工艺研究 指导教师 赵晓丹 讲师 专 业 食品科学与工程2008级1班 学 生 冷帅辰 2011年9月25日题目名称：超声波-酶法联合提取榛蘑多糖工艺研究任务内容（包括内容、计划、时间安排、完成工作量与水平具体要求） 榛蘑，生长在针阔叶树的干基部、代根、倒木及埋在土中的枝条上，主要分布在我国东北地区，是一种我
2、国特有的食用菌。榛蘑肉质鲜美，而且富含蛋白质、多糖及多种维生素和矿物质，营养丰富，具有极高的食用价值。榛蘑还有着重要的药用价值，其多糖成分是一种能够控制细胞的分裂分化和调节细胞生长衰老的活性多糖，具有抗氧化、抗辐射、促进造血、抗肿瘤、增强免疫力等药理作用。1.试验内容（1）取野生榛蘑，洗净、干燥、粉碎、过筛后，制得实验所需榛蘑粉。（2）采用苯酚硫酸比色法，绘制葡萄糖标准曲线，从而测定多糖含量。（3）采用传统水提法，原料经浸提、过滤、浓缩、醇沉、抽滤等操作后，测定吸光值，计算多糖得率。（4）采用超声波法，提取榛蘑多糖。分别对料液比、超声温度、超声波功率、超声时间4个因素，进行单因素试验。根据实验
3、结果，进行正交试验，求得超声波法提取榛蘑多糖的最佳工艺条件。（5）采用超声波-酶联合提取法，在提取液中加入纤维素酶，经酶解后，在超声波法最佳工艺条件下超声处理，提取多糖。分别对加酶率、酶解时间、酶解温度、pH为因素，进行单因素试验。根据结果，进行正交试验，得到超声波酶法联合提取榛蘑多糖的最佳工艺条件。（6）采用酶法提取多糖，根据超声波酶联合提取法最佳工艺条件，只进行酶解，不超声处理，计算多糖得率。2.时间安排2012.02.012012.02.26 文献查阅，方案设计2012.02.272011.03.03 准备实验仪器，购买试验材料2012.03.042012.03.07 绘制葡萄糖标准曲线
4、2012.03.082012.03.20 传统水提法提取榛蘑多糖2012.03.212012.04.11 超声波法提取榛蘑多糖条件优化2012.04.122012.05.10 超声波酶法联合提取榛蘑多糖条件优化2012.05.112012.05.12 酶法提取榛蘑多糖2012.05.132012.05.22 数据处理并撰写、修改论文2012.05.232012.06.10 准备答辩其中： 参考文献篇数： 25篇以上（其中，外文文献3篇以上） 论 文 字 数： 1.1万字以上专业负责人意见签名：年 月 日超声波酶法联合提取榛蘑粗多糖工艺优化摘 要 本试验以榛蘑为原料，研究其多糖的提取工艺，通过传
5、统水提法、超声波法、酶法、超声波酶联合提取法四种方法对榛蘑多糖进行提取，根据单因素和正交试验的结果，得到最佳的提取工艺条件。 结果如下：传统水提法提取榛蘑多糖的得率只有5.42%；酶法提取榛蘑多糖的得率为10.21%；超声波法提取榛蘑多糖的最佳工艺条件为料液比1:40，超声时间40min，超声功率300W，超声温度60，多糖得率为9.67%；超声波酶法联合提取的最佳工艺条件为料液比1:40，加酶率2.2%，pH5.0，酶解温度50，酶解时间90min，超声功率300W，超声时间40min，超声温度60，此时的多糖得率为16.53%。 结论为超声波酶法联合提取榛蘑多糖提取率是传统水提法的3.05
6、倍，超声波法的1.71倍，酶法的1.62倍，具有明显的优势。关键词:榛蘑多糖；超声波；酶法；提取；工艺优化Study on Combined Ultrasonic and Enzyme Hydrolysis Extraction of polysaccharide from Armillaria melleaAbstract The optimum conditions for extraction of polysaccharides from Armillaria mellea were studied. The extraction was assisted with water bat
7、h, ultrasonic wave,enzyme technology and ultrasonic wave combined with enzymete chnology. The process parameters were optimized by single factor test and orthogonal experiment to obtain the optimum extraction conditions.The extraction percent of soluble polysaccharides from Arimillaria mellea with t
8、raditional water bath method is 5.42%.The optimum extraction conditions of ultrasonic wave method areas follows solid-liquid ratio is 1:40,ultrasonic power is 300W, the temperature is 60and the extraction time is 40 min.Under these conditions, the extraction percent of polysaccharides from Arimillar
9、ia mellea is 9.67%.The optimum extraction conditions of ultrasonic wave combined with enzyme method are as follows: solid-liquid ratio is 1:40, ultrasonic power is 300W, temperature is 60, the extraction time is 40 min, the rateof enzyme is 2.2%, the value of pH is 5.0,the temperature of enzyme hydr
10、olysisis 50,the time of enzyme hydrolysis is 90min. Under these conditions, the extraction percent of polysaccharides from Arimillaria melleais16.53%;The extraction percent of soluble polysaccharides from Arimillaria mellea with enzyme method is 10.21%. According to validation experiment, compared w
11、ith traditional methods, ultrasonic wave combined with enzyme method produced higher extraction percent of soluble polysaccharides(the 3.05 times of the traditional water bath extraction, 1.71 times of the ultrasonic wave method extraction, 1.62 times of the enzyme method extraction ,respectively).
12、Key words：Armillaria mellea; polysaccharides; ultrasonic wave; enzyme hydrolysis;extraction technology.目 录摘要Abstract1 绪论11.1榛蘑多糖研究现状分析11.1.1榛蘑概述11.1.2榛蘑的化学成分11.1.3榛蘑的功能及作用11.1.4榛蘑多糖的生理功能21.2常用的多糖提取技术31.2.1传统水提法31.2.2超临界流体萃取41.2.3微波萃取41.2.4超声波萃取技术41.2.5酶法提取技术41.3本实验的目的和意义51.4本试验的内容及技术路线52 材料和方法62.1 试
13、验器材62.1.1 试验仪器62.1.2 试验材料62.2 试验方法72.2.1榛蘑粉的制备72.2.2 葡萄糖标准曲线的绘制72.2.3传统水提法提取榛蘑多糖72.2.4超声波法提取榛蘑多糖72.2.5超声波酶法联合提取榛蘑多糖82.2.6酶法提取榛蘑多糖93 结果与分析103.1葡萄糖标准曲线的绘制103.2传统水提法提取榛蘑多糖103.3超声波法提取榛蘑多糖113.3.1单因素试验结果113.3.2超声波法提取榛蘑多糖工艺优化133.3.3超声波法提取榛蘑多糖最佳工艺条件验证143.4超声波-酶法联合提取榛蘑多糖143.4.1单因素试验结果143.4.2超声波-酶法联合提取榛蘑多糖工艺优
14、化163.4.3超声波-酶法联合提取榛蘑多糖最佳工艺条件验证173.4.4酶法提取榛蘑多糖183.4.5四种提取方法所得榛蘑多糖得率比较184 结论19参考文献致谢东北林业大学毕业论文超声波-酶法联合提取榛蘑多糖工艺研究1 绪论1.1榛蘑多糖研究现状分析1.1.1榛蘑概述 榛蘑为真菌植物门真菌蜜环菌的子实体。一般生长在浅山区的榛柴岗上，所以得名“榛蘑”。其外型呈伞状，土黄色，广泛分布在我国东北地区，被称为“东北第四宝” 1。然而榛蘑是一种野生菌类，人工无法培育。在人们追求健康饮食的今天，榛蘑由于其肉质鲜美，营养丰富及出色的药用功能，受到越来越多人的欢迎2。1.1.2榛蘑的化学成分 榛蘑中富含大
15、量多糖，除多糖外，榛蘑中蛋白质含量达44%，含有18种氨基酸及钾、钙、镁、铁、锌等矿物质元素，维生素B1、B2和维生素C含量也较高3。1.1.3榛蘑的功能及作用 榛蘑不仅是食材，还可入药，自古以来一直是一种中医药材，具有清目、利肺、益肠胃及活血化瘀，强筋健骨的功效。常被人用于治疗羊癫风，腰酸腿疼，佝倭病等；经常食用榛蘑，可以保护视力，预防视力失常。经常食用可加强肌体免疫力，益智开心，延年轻身等作用，还可以防止皮肤干燥，预防某些心脑血管疾病和呼吸道及消化道疾病4。 利用榛蘑与天麻的共生关系，还可用榛蘑培育药材天麻，从而提高天麻的产量5。1.1.4榛蘑多糖的生理功能(1)榛蘑多糖的免疫增强作用 大
16、量文献报道榛蘑多糖具有免疫增强作用，能增强小鼠的免疫能力、促进生长，但对其作用机理阐述得并不完全一致。李延平等6研究表明，榛蘑多糖通过刺激骨髓细胞使幼稚细胞增多，分化成成熟细胞，致使分叶核细胞增多，保护骨髓造血系统，拮抗环磷酰胺对骨髓细胞的损伤，其作用结果呈剂量依赖性关系。Li YP7等在使用昆明纯种小鼠研究榛蘑多糖时发现，榛蘑多糖对环磷酰胺引起的小鼠骨髓细胞损伤具有保护作用。王惠国等8研究表明，给小鼠腹腔注射AMP具有增加小鼠吞噬细胞的吞噬功能，促进脾脏T 淋巴细胞的增殖能力，提高小鼠血清溶血素水平的作用。于敏等9研究结果表明，AMP 能抵抗环磷酰胺作用前期白细胞数下降和环磷酰胺作用后期白细
17、胞数过分升高，一定剂量的AMP 能显著降低肝脏重量，表明其对免疫器官有一定程度的影响。AMP能显著增强T 细胞介导迟发型变态反应，说明可增强小鼠的体液免疫反应及细胞免疫反应能力10。另有报道AMP能在体外显著增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的作用11，并可诱导巨噬细胞产生NO且呈现一定的浓度相关性，在高浓度时，对巨噬细胞分泌IL1有一定的促进分泌作用。AMP能增强机体的特异性和非特异性免疫功能，可作为免疫增强剂。综合上述，榛蘑多糖是通过调节免疫细胞以及免疫分子等多方面发挥其正向免疫调节作用，具有较好的药用价值，蜜环菌多糖是否可作为骨髓细胞的保护剂，抗放射，抗化学药物对骨髓造细胞损伤，是值得深入研
18、究的课题。(2)榛蘑多糖的抗肿瘤作用 经实验研究可知，榛蘑多糖亦具有抗肿瘤的生理活性。实验中，将肝癌细胞SMMC 7721进行体外培养，研究AMP的抗肿瘤作用。在倒置显微镜下观察AMP以0.05mg/mL、0.10mg/mL 及0.20mg/mL 三个浓度给药48h后，肝癌细胞SMMC7721的形态学变化; 采用MTT法检测蜜环菌多糖对肝癌细胞SMMC7221的增殖抑制作用; 采用Brandford 法测定AMP对肝癌细胞SMMC7221重要蛋白合成的影响;采用免疫细胞化学法分析其对凋亡相关蛋白bcl2表达的影响。实验结果表明，与对照组相比，榛蘑多糖可使细胞间隙增大，悬浮细胞增多，能够抑制肿瘤
19、细胞的增殖; 同时在给药浓度为0.10mg/ml和0.20mg /mL时，能够显著抑制肿瘤细胞蛋白质的合成; 榛蘑多糖还能够下调凋亡抑制蛋白bcl2的表达水平，此实验指出，榛蘑多糖是通过抑制肿瘤细胞增殖以及促进肿瘤细胞凋亡，从而达到抗肿瘤作用的。榛蘑多糖的抗肿瘤作用不仅在体外实验中得到验证，也体现在化学结构鉴定和体内实验中，经红外光谱检测，榛蘑多糖具有型糖苷键，这种构效关系的多糖具有抗肿瘤的药理活性，并且在对移植S180小鼠进行在体抗肿瘤实验，也证实其抗肿瘤的作用。(3)榛蘑多糖的降糖作用 研究发现榛蘑多糖(AMP1) 能使正常小鼠的糖耐量增强。能使四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖显著降低。同时发现A
20、MP1对胰岛细胞的分泌也有一定的促进作用12。操玉平等13通过培养大鼠胰岛素瘤细胞(INS1) ，并以四氧嘧啶(AXN) 损伤细胞，培养液中加入不同浓度的AMP1，检测其对INSl细胞葡萄糖刺激的胰岛素和C 肽分泌量的影响，并检测细胞存活率。结果发现，在一定浓度范围内AMPl对AXN损伤的INSl细胞分泌胰岛素和C肽均具有一定的促进作用，尤其是在葡萄糖浓度为16.7mmol/L时，效果明显; 因此可以得出AMPl可减少AXN对INSl细胞的损伤，增加INSl细胞的存活率。陆军等14研究发现AMP1能使INS1细胞NOS活性降低，NO和MDA含量减少，同时使SOD的活性增强，增加了GSH的含量，
21、因此在一定浓度范围的AMP1对葡萄糖刺激下INS1细胞的胰岛素分泌的促进作用，可能与AMPl能够增加细胞清除自由基能力有关。AMP对血糖的作用机制尚不明确。而榛蘑多糖可在较短时间内大量获得，多糖含量高，便于对榛蘑多糖关于血糖影响的研究。(4)榛蘑多糖的抗氧化及抗衰老作用 榛蘑多糖的抗氧化抗衰老作用近些年来取得较大的研究进展。现代研究发现一部分糖类复合物可通过清除自由基、抑制脂质过氧化、调节免疫功能、调节核酸和蛋白质代谢等途径起到抗氧化作用从而延缓机体衰老。榛蘑多糖作为蜜环菌的主要成分之一亦被发现有此项作用，在研究培养药用型真菌蜜环菌抗氧化作用活性时，发现蜜环菌匀浆提取物榛蘑多糖具有强大的清除自
22、由基和抗脂质过氧化作用15。在研究蜜环菌诱导细胞间粘附因子ICAM1的表达能力时，发现榛蘑多糖在诱导ICAM1和THP1细胞中的mRNA的表达存在剂量和时间依赖关系，在人体单核细胞中，榛蘑多糖诱导ICAM1 的表达是通过ROS/JNK信号通路去激活转录因子NFKB、AP1、SP1和STAT1的16。沈明花17等研究结果显示榛蘑多糖对羟基自由基和二苯基苦味酰基苯肼具有较显著的清除能力，甚至可以提高肝组织中的SOD、CAT、GSHPx活性并且抑制MDA 生成，因而具有明显的抗氧化作用。虞磊18等从自由基代谢的角度探讨了蜜环菌菌索多糖的抗衰老机制，通过观察D半乳糖致衰小鼠模型的跳台法和迷宫法学习记忆
23、能力，测定衰老小鼠部分组织中的SOD、MDA、NO、GSHPx，发现榛蘑菌索多糖可通过调节生物的机体免疫功能或者清除自由基来延缓机体组织衰老，观察果蝇的寿命发现蜜环菌菌索多糖亦可显著延长果蝇的平均寿命和提高果蝇的最长寿命。丁诚实19等通过观察榛蘑壳聚糖对D半乳糖致衰老小鼠的影响和对果蝇寿命的影响，测定受试小鼠血清中的SOD活性、MDA的含量以及分析小鼠记忆学习行为等可以得出榛蘑壳聚糖有显著抗衰老作用。(5)榛蘑多糖的抗突变作用 张颖等人在研究榛蘑多糖对低能离子束诱变作用的恢复效应时，发现从蜜环菌Am991菌株人工发酵菌体内分离出来的榛蘑多糖Aml，诱变源为低能N+离子束，受试动物为黑腹果蝇，并
24、检测Aml对离子束诱变果蝇的恢复功能。此实验结果表明，1.0%和l.5%浓度的榛蘑多糖Aml 可以使受试果蝇蛹的孵出率提高，当代及F2代果蝇突变率降低，同时染色体水平上的检测也证实了此结论。因此得出榛蘑多糖对于低能离子束诱变具有一定的防护作用20。(6)其他作用 榛蘑多糖具有镇静作用，能明显减少小鼠自发活动，并能使环己烯巴比妥钠或戊巴比妥钠引起的小鼠睡眠时间显著延长。研究发现榛蘑多糖可以并通过抑制NO、INOS、COX2和THP1细胞中的活性因子的表达，而达到抗炎作用21。在临床上榛蘑多糖还用于治疗肢麻、佝偻病、颈椎病、风湿病、腰腿酸痛，可以强壮筋骨。此外，榛蘑多糖对癫痫、耳鸣、眩晕症也有一定
25、疗效22。1.2常用的多糖提取技术1.2.1传统水提法 水作为溶剂提取多糖是最常使用的一种方法，可以用热水提取，也可以用冷水浸泡。水提取多糖的多数是中性多糖23。一般多糖提取大多数采用热水提取，得到了多糖可以直接或离心去除不溶物，或利用多糖不溶于高含量乙醇的性质，用高浓度酒精沉淀净化多糖。1.2.2超临界流体萃取 超临界流体萃取(SFE)是以某一介质(CO2、H2O、N2)作为萃取剂，在其临界温度和临界压力之上的条件下，从液体或固体物料中萃取出待分离组分的一种提取分离技术。其特点是产物纯度高，质量好，特别适用于热敏性原料，但提取率较溶剂萃取法低23。广泛应用于玫瑰精油、不饱和脂肪酸等植物中液态
26、物质和芳香物质的提取。1.2.3微波萃取 微波辅助萃取，是使用微波加热接触样溶剂，化合物从要求的样品分离，进入一种溶剂的过程。广泛应用于植物活性成分，如多糖提取23。1.2.4超声波萃取技术 超声波是指频率为15KHz60MHz之间的一种高频弹性机械波，通常需要介质如空气、水等进行传播。超声提取法的机理是分成热机理、力学机制，超生汽蚀机理。分散在样本和溶剂的之间产生的空化效应，小气泡的形成，增长和爆破压缩，产生5000的高温和50MPa的局部高压，从而使固体样品分散与溶液产生高速碰撞，增大样品与溶剂之间的接触面积，从而加速植物细胞内目标物转移到溶剂中，提高传质速率23。是提取植物（中药）中活性
27、成分最常用的方法之一。1.2.4.1超声波萃取的特点：（1）常温萃取。超声波可在常温条件下进行萃取，适合一些热不稳定的植物活性成分的萃取。（2）常压萃取。无需高压，对实验仪器及玻璃器皿的要求较低，操作简单易行。（3）萃取效率高。由于超声波产生的强烈的空化作用，大大增加了萃取剂与物料的接触面积，使用超生比技术两小时左右即可达到最佳提取率，大大缩短了萃取时间。（4）适用性广。几乎适合所有的植物性和动物性材料。（5）节能环保。超声波可在常温、常压条件下萃取，且萃取时间短，萃取剂消耗量也较低，因此降低能耗。（6）其他优点，如药材原料处理量大，杂质少，有效成分易于分离、净化。萃取工艺成本低，综合经济效益
28、显著。1.2.5酶法提取技术 植物细胞壁是由纤维素、半纤维素、木质素、果胶、物质构成，通常提取剂添加适量的纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和分解的细胞壁,半纤维素、果胶、破坏细胞壁的结构,加速细胞的有效成分溶出率，提高提取效率，缩短提取时间23。适用于所提取的多糖。1.3本试验的目的和意义 我国榛蘑资源丰富，广泛生长于我国东北地区。榛蘑肉质鲜美，营养价值丰富，富含蛋白质、多糖及多种维生素和矿物质，具有极高的食用价值。榛蘑还有着重要的药用价值，其多糖成分具有抗氧化、抗衰老、抗辐射、抗肿瘤、增强免疫力、降血糖等药理作用，在食品行业中有着广泛的应用前景，所以榛蘑多糖引起了许多人的关注，不少科研工作者开始
29、研究榛蘑多糖的提取纯化及各种理化性质。目前榛蘑多糖的提取多采用传统水提法，提取率偏低，所以本实验通过进行传统水提法、超声波法、酶法和超声波酶联合提取法提取榛蘑多糖，从而得到最佳工艺条件，提高榛蘑多糖的提取率，为创建高效、经济的多糖提取工艺提供参考，为今后榛蘑多糖精深产品加工提供一定的理论和技术支持。 1.4本试验的内容及技术路线 榛蘑粉传统水提 超声波法 超声波-酶联合法 酶法 加酶率酶解温度酶解时间 PH 料液比超声功率超声温度超声时间 回流浸提 超声处理 浓缩除蛋白离心醇沉榛蘑多糖计算提取率2 材料和方法2.1 试验器材2.1.1 试验仪器超声波细胞清洗器KQ500DE 昆山超声波仪器有限
30、公司电热恒温水浴锅DK-S12上海森信实验仪器有限公司台式低速离心机TDL-5W湖南星科科学仪器有限公司恒温水浴摇床HZS-HA哈尔滨东联电子技术开发有限公司循环水多用真空泵SHB-3郑州杜甫仪器厂旋转蒸发器RE- 52A上海亚荣生化仪器厂中草药粉碎机FW135天津市泰斯特仪器有限公司可见光分光光度计722S上海精密科学仪器有限公司台秤YP2001N上海精密科学仪器有限公司分析天平JA-2003上海良品仪器仪表有限公司pH计PB-10Sartorius有限公司电冰箱BCD-215KSHaier有限公司2.1.2 试验材料榛蘑购于家乐福超市纤维素酶购于美国Sigma公司苯酚分析纯天津市瑞金特化学
31、试剂有限公司浓硫酸分析纯北京化工厂正丁醇分析纯天津市天力化学试剂有限公司盐酸分析纯北京化工厂氢氧化钠分析纯天津市天力化学试剂有限公司无水乙醇分析纯天津市天力化学试剂有限公司三氯甲烷分析纯天津市津东天正精细化学试剂厂2.2 试验方法2.2.1榛蘑粉的制备 将榛蘑洗净、晾晒后，置于烘箱中，80下恒温烘干后用粉碎机粉碎，过80目筛，得到榛蘑粉。2.2.2 葡萄糖标准曲线的绘制 采用苯酚硫酸比色法测定多糖含量24。精密称取干燥恒质量的分析纯葡萄糖0.05 g，加水定容至100mL，得到质量浓度为500 g/mL 的葡萄糖标准溶液，精确吸取0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分
32、别置于10 mL容量瓶中，补加蒸馏水至2 mL，加入5%苯酚1 mL，混合均匀后快速加入98%浓硫酸7 mL，摇匀后室温放置30 min，在波长490nm下测定吸光值A。以吸光值A为纵坐标，以葡萄糖的质量浓度为横坐标制作标准曲线。2.2.3传统水提法提取榛蘑多糖 根据邵信儒、孙海涛等人用热水浸提法提取山榛蘑多糖得到的最佳工艺条件，取1.00g榛蘑粉， 装瓶备用。加入25ml蒸馏水，在95下回流浸提5h，回流结束后收集滤液； 相同条件下，再将滤渣洗入圆底烧瓶二次浸提， 浸提3次后，合并滤液并用旋转蒸发器浓缩（原料重：浓缩液=1:2） ，向浓缩液内加入Sevag试剂除蛋白，按照滤液体积的1/4量加
33、入Sevag试剂（氯仿:丁醇=4:1），直到没有乳白色变性蛋白质析出后，在150r/min下振荡20min，4000r/min下离心10min，取上清液，加入3倍体积的95%乙醇沉淀多糖，再离心10min，将得到的沉淀用无水乙醇洗涤，干燥，得到榛蘑多糖。2.2.3.1榛蘑多糖质量浓度的测定及得率的计算 从得到的榛蘑多糖中取0.01g，定容至100 mL 后准确吸取200 L 于10 mL 容量瓶中，补加蒸馏水至2 mL，加入5%苯酚1 mL，混合均匀后快速加入98%浓硫酸7 mL，摇匀后室温放置30 min，以不含样品的溶液作为空白，于490 nm测定吸光度，根据葡萄糖标准曲线的回归方程可计算
34、出相应的多糖质量浓度。同时, 可根据多糖得率公式计算出榛蘑多糖的得率： 多糖得率(%)=(50 V C f W2 /W3 W1 )100%式中: W1：称取榛蘑粉的质量( g ) W2：由W1 提取的榛蘑多糖的质量( g ) W3：从W2 中称取的用于分析测定的榛蘑多糖质量( g ) V：溶解W3 定容后的体积( L ) f ：多糖的校正系数, f= 0.9 C：由回归方程计算所得多糖的质量浓度( g/L )。 实验重复3次，得到传统水提法的多糖得率。2.2.4超声波法提取榛蘑多糖 准确称取榛蘑粉1.00g，按一定料液比加入蒸馏水，置于超声波清洗机中于一定温度下作用一定时间，得到的提取液抽滤，
35、向滤液内加入Sevag试剂除蛋白，在 150r/min下振荡20min, 离心10min，取上清液，加入3倍体积的95%乙醇沉淀多糖，再离心10min，将得到的沉淀用无水乙醇洗涤，干燥，得到榛蘑多糖。按2.2.3.1的方法测定榛蘑多糖质量浓度并计算得率，每个处理重复3 次。2.2.4.1超声波法提取榛蘑多糖单因素实验分别对料液比、超声温度、超声波功率、超声时间4个因素进行单因素试验26.（1）料液比对榛蘑多糖得率的影响 在超声温度60，超声波功率250W，超声30min的条件下，分别配制料液比为1:30、1:35、1:40、1:45、1:50，提取多糖，计算得率。（2）超声时间对榛蘑多糖提取率
36、的影响 在超声波功率250W，料液比1:40，超声温度60的条件下，分别超声10、20、30、40、50min，提取多糖，计算得率。（3）超声波功率对榛蘑多糖提取率的影响 在料液比1:40，超声温度60，超声30min的条件下，分别设定超声波功率为200、250、300、350、400W，提取多糖，计算得率。（4）超声温度对榛蘑多糖提取率的影响 在超声波功率250W，料液比1:40，超声30min的条件下，分别设超声温度为40、50、60、70、80，提取多糖，计算得率。以上每个处理均重复3 次。2.2.4.2根据单因素试验结果，选用正交表L9(34)研究超声波提取榛蘑多糖的最佳条件 超声波法
37、提取榛蘑多糖正交因素水平表L9(34)水平因素A料液比B时间/minC功率/WD温度/1 2 3 2.2.4.3超声波法提取榛蘑多糖最佳工艺条件验证试验 取1.00g榛蘑粉，根据正交试验得出的最佳工艺条件，提取多糖，重复3次，得到最佳条件下的多糖得率。与正交试验中各条件下得到的得率比较，观察该值是否最高。2.2.5 超声波酶法联合提取榛蘑多糖 取1.00g榛蘑粉，按超声波法提取榛蘑多糖正交试验得到的最佳料液比加入一定量的水，再向溶液中加入一定量的纤维素酶，调节溶液的pH为某一固定的值，并在一定温度下水浴一定时间后，进行超声处理，其中超声的功率、时间、温度参照超声波法提取榛蘑多糖得到的最佳工艺条
38、件，对得到的提取液抽滤，向滤液内加入Sevag试剂除蛋白，在150r/min下振荡20min, 离心10min，取上清液，加入3倍体积的95%乙醇沉淀多糖，再离心10min，将得到的沉淀用无水乙醇洗涤，干燥，得到榛蘑多糖。按2.2.3.1的方法测定榛蘑多糖质量浓度并根据公式计算得到多糖得率27。(1)加酶率对榛蘑多糖得率的影响 在温度为50、pH 4.0，酶解时间为90 min 条件下，按照加酶率为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，再经超声处理提取多糖，计算得率。（2）酶解时间对榛蘑多糖得率的影响 加酶率为2.0%，温度为50，pH 4.0条件下，分别酶解30、60、90、12
39、0、150 min，再经超声处理提取多糖，计算得率。（3）酶解温度对榛蘑多糖得率的影响 在pH4.0时，加酶率为2.0%，酶解时间为90 min 条件下，分别设酶解温度为40、45、50、55、60，再经超声处理提取多糖，计算得率。（4）pH对榛蘑多糖得率的影响 在50，加酶率为2.0%，酶解时间为90 min 的条件下，分别调节pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ，再经超声处理进行多糖提取，计算得率。以上每个处理均重复3 次。2.2.5.2根据单因素实验结果，选用正交表L9(34)研究超声波酶法联合提取榛蘑多糖的最佳条件28超声波-酶法联合法提取榛蘑多糖正交因素水平表L9(34)水平
40、因素A加酶率/%B时间/minC温度/DpH1 2 3 2.2.5.3超声波酶法联合提取榛蘑多糖最佳工艺条件验证试验 取1.00g榛蘑粉，根据正交试验得出的最佳工艺条件进行酶解，再经超声波处理后得到提取液，重复3次，得到最佳条件下的多糖得率。与正交试验中各条件下得到的得率比较，观察该值是否最高。2.2.6酶法提取榛蘑多糖 根据超声波酶法最佳工艺条件中的酶解条件，只进行酶解，提取液不再用超声波处理，进行抽滤、除蛋白、离心、醇沉等操作后，得到榛蘑多糖，按2.2.3.1的方法测定榛蘑多糖质量浓度并根据公式算出多糖得率。试验重复三次，得到酶法提取榛蘑多糖的得率。3 结果与分析3.1葡萄糖标准曲线的绘制
41、 将葡萄糖配制成不同浓度的溶液，采用苯酚-硫酸法测定其在490nm处的吸光值，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制曲线，得到图3-1 图3-1葡萄糖标准曲线实验结果显示，葡萄糖浓度在0g/mL-30g/mL区间，呈线性关系，其相关系数为 0.998。回归方程为：y = 0.057x-0.008，R2=0.998 x为葡萄糖质量浓度，g/mL y为吸光值3.2传统水提法提取榛蘑多糖 传统水提法提取榛蘑多糖，加入25mL蒸馏水， 在95下回流浸提5h，回流结束后收集滤液;；相同条件下， 再将滤渣洗入圆底烧瓶二次浸提， 浸提3次后，合并滤液并用旋转蒸发器浓缩(原料重:浓缩液= 1:2) ，向浓缩
42、液内加入Sevag试剂除蛋白，按照滤液体积的1/4量加入Sevag试剂(氯仿:丁醇= 4:1)，直到没有乳白色变性蛋白质析出后，在 150r/min下振荡20min，离心10min，取上清液，加入3倍体积的95%乙醇沉淀多糖，再离心10min，将得到的沉淀用无水乙醇洗涤，干燥，得到榛蘑多糖。按2.2.3.1的方法测定榛蘑多糖质量浓度并根据多糖得率公式计算得到榛蘑多糖的得率为5.42%。3.3超声波法提取榛蘑多糖3.3.1单因素试验结果3.3.1.1料液比对榛蘑多糖得率的影响固定超声波功率250W，温度60，超声时间30min，改变料液比。图3-2不同料液比下的榛蘑多糖得率 实验结果如图3-2所
43、示：随着料液比的增大，多糖得率先大幅增加，料液比为1:40时多糖得率达到最大，之后多糖得率缓慢下降，添加溶剂的量过多时，超声波被溶剂吸收较多，作用于料液的相对减少，从而影响榛蘑多糖的析出。料液比太大不利于对多糖的提取。因此，本试验选用料液比1:40比较适宜。3.3.1.2提取时间对榛蘑多糖得率的影响 固定料液比1：40，温度60，超声功率为250W，改变超声时间。图3-3不同提取时间下榛蘑多糖得率 实验结果如图3-3所示：随着超声时间的增加，多糖得率不断升高，在时间达到30min时，得率达到最大，之后略有下降趋势。可能是超声波的机械剪切作用会使一部分多糖降解，导致得率降低。所以多糖提取时超声时间不宜过长，本试验选用超声30min，得率最高。3.3.1.3超声波功率对榛蘑多糖得率的影响 固定料液比1:40，温度60，提取时间30min，改变超声功率。图3-4不同超声功率下榛蘑多糖得率 试验结果如图3-4所示：随着超声波功率的不断提高，多糖得率不断升高，在功率达到300W时，得率达到最大，之后随着功率的提高得率呈下降趋势。因为强超声波作用可能导致多