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1、第十五章 分枝杆菌属检验吴爱武目 录第一节 结核分枝杆菌复合群第二节 非结核分枝杆菌第三节 麻风分枝杆菌属放线菌目分枝杆菌科的惟一菌属，本属约有105种细菌。模式菌为结核分枝杆菌是一类直或微弯曲的杆菌，有分枝生长趋势，抗酸染色阳性细胞壁脂质含量高，耐酸碱,对氧和营养要求高，生长慢不产生毒素和侵袭酶类，多为菌体成分致病，感染为慢性分枝杆菌属共性 缓慢生长菌缓慢生长菌 迅速生长菌迅速生长菌 不能培养菌不能培养菌麻风分枝杆菌龟脓肿分枝杆菌群偶发分枝杆菌分枝杆菌属结核分枝杆菌牛分枝杆菌非洲分枝杆菌坎纳分枝杆菌田鼠分枝杆菌卡介苗鸟分枝杆菌复合群堪萨斯分枝杆菌戈登分枝杆菌非结核分枝杆菌结核分枝杆菌复合群迅
2、速生长分菌（Runyon IV群）光产色菌 （Runyon I群）暗产色菌 （Runyon II群）不产色菌 （Runyon III群）分枝杆菌属分类第一节 结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC)重点提示分类临床意义生物学特性微生物学检验一、分类一、分类结核分枝杆菌牛分枝杆菌非洲分枝杆菌坎纳分枝杆菌田鼠分枝杆菌卡介苗结核分枝杆菌复合群全球三大传染疾病二、临床意义二、临床意义爱滋病（AIDS）结核病（TB）疟疾（Malaria）结核病近年来发病成上升趋势，已成为危胁人类健康的严重的全球性重大公共卫生问题结核分枝杆菌复合群中结核分枝杆菌
3、感染的发病率最高，约占90%1.致病物质荚膜脂质：索状因子 磷脂 硫酸脑苷酯 蜡质D D蛋白质尚未发现产生内外毒素及侵袭性酶，主要由菌体成分导致的炎症和免疫损伤引起病变主要致病物质二、临床意义二、临床意义2.所致疾病 结核分枝杆菌通过呼吸道、消化道和破损的皮肤粘膜进入机体，侵犯多种组织器官，引起相应器官感染，其中以肺结核最常见二、临床意义二、临床意义3.免疫性TB菌的感染率很高，发病率却较低。抗结核的免疫称为有菌免疫抗体无保护作用，临床辅助诊断有意义。细胞免疫发挥重要抗感染作用可产生迟发性超敏反应 结核菌素试验二、临床意义二、临床意义三、生物学特性1.形态结构 菌体细长略弯曲，有时可见分枝，抗
4、酸染色呈红色；呈单、成堆或成束排列；无鞭毛、无芽胞，有荚膜。可出现多形性，在陈旧的病灶和培养物中，形态常不典型萋尼氏抗酸性染色法染色，菌体染成红色荧光染料金胺O染色，在荧光下菌体呈橘黄色2.培养特性馋:专性需氧,营养要求高（L-J培养基）懒:生长温度35,生长缓慢,18小时繁殖一代丑:液体培养基呈粗糙皱纹状菌膜生长,固体培 养基上形成形似菜花样典型菌落三、生物学特性典型形态多形性R型菌落S型菌落有毒无毒（卡介苗）抗结核药敏感耐药3.变异性三、生物学特性卡介苗卡介苗：是有毒力的牛型结核分枝杆菌在甘油、胆汁和马铃薯的培养基中经13年230次传代而获得的减毒变异株对某些理化因子的抵抗力较强：耐干燥耐
5、酸碱耐一定浓度的孔雀绿湿热紫外线酒精4.抵抗力“三耐三不耐”不耐受三、生物学特性 临床标本涂片检查 分离培养HPLC分子鉴定免疫学鉴定直接涂片集菌涂片处理标本或无污染标本 染色液体培养基 固体培养基动物试验（L-J培养基）抗酸.金胺O.35 涂片镜检仪器培养 7天生长7天生长快速生长菌慢生长菌 初步鉴定抗酸染色菌落特点鉴定试验药敏试验四、微生物学检验（一）检验程序（二）标本采集据感染部位的不同采集不同的标本疑肺结核：收集清晨第一口痰，清洁干燥的容器内送检疑泌尿系结核：清晨第一次中段尿15ml送检，必要时作无菌导尿送检采集脓液应直接从溃疡处取脓汁或分泌物,深部脓肿用无菌注射器抽取送检其他：无菌抽
6、取脑脊液、胸水、腹水及关节液等盛无菌试管送检。脑脊液标本静置后，表面可有细薄凝块，取凝块作涂片或接种培养常见标本：痰、尿、胸腹水等 直接涂片或浓缩集菌涂片，使涂片面积大约为2cm1cm大小，然后进行金胺O荧光染色和抗酸染色 （三）直接涂片检查结核分枝杆菌痰涂片抗酸染色（1000）荧光染色（450）结果报告 0 70视野 1270视野 21850视野 2 43610视野 3 436每个视野 4 36每个视野抗酸染色（1000）结果报告 0300视野 12条300视野 19条/100视野 2 19条/10视野 3 19条/每个视野 4 9/每个视野（四）分离培养与鉴定1.标本前处理：痰液标本的前处
7、理：标本加等量的4%NaOH強力振荡混匀约 50 秒室温静置 30 分钟加等量无菌磷酸盐缓冲液中和离心 3000g 约 15 分钟倒掉上清液，加无菌磷酸盐缓冲液重悬2.分离培养（1）传统培养方法培养基：处理过的标本接种于-培养基培养条件：含5%10%CO2大气环境，最适生长温度3537，黑暗高湿度环境培养68周。（2）结核分枝杆菌的自动化快速培养系统（四）分离培养与鉴定 3.生物学鉴定（1）初步鉴定 依据抗酸染色性、菌落特征、生长速度、色素产生等作出初步鉴定（2）生化试验鉴定 烟酸累积试验（+）、硝酸盐还原（+）触酶（+）、耐热触酶（-）能被NAP抑制 不被T2H抑制、吡嗪酰胺酶（+）结核分枝
8、杆菌（四）分离培养与鉴定4.免疫学鉴定（1）结核菌素试验：迟发型超敏反应。（2）结核分枝杆菌抗原检测（3）抗PPDIgG检测（四）分离培养与鉴定结核菌素试验纯蛋白衍生物(PPD)，是用三氯醋酸沉淀结核分枝杆菌培养滤液后的纯化物。注入皮内后如受试者已感染结核，则结核菌素与致敏淋巴细胞特异性结合，形成迟发型超敏反应性炎症根据注射部位是否出现红肿判断结果 10mm为阴性 10mm为阳性48小时后5.分子生物学鉴定各种PCR方法检测结核分枝杆菌DNA6.高效液相色谱（HPLC)分析鉴定 由于不同种的分枝杆菌细胞壁中的分枝菌酸不同，利用HPLC检测分枝菌酸可鉴定菌种（四）分离培养与鉴定（四）分离培养与鉴
9、定根据CLSI 文件M24-2A推荐：结核分枝杆菌药敏试验选择的药物主要是抗结核一线药物如异烟肼、利福平、乙胺丁醇和比嗪酰胺等 五、药敏试验的药物选择第二节 非结核分枝杆菌（nontuberculosis mycobacteria,NTM）重点提示NTM的概述临床上重要的NTMNTM的微生物学检验NTM指结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌，具有抗酸性，不是分类学上的名称广泛分布于水和土壤中条件致病，引起类似于结核分枝杆菌感染的慢性肺部疾病以及皮肤感染感染不会通过人与人之间进行传播概 述1.不产色菌 本群细菌在光照和暗处均不产生色素 慢生长群（1）鸟分枝杆菌复合群：环境腐生菌，主要引
10、起AIDS患者肺部感染。最适生长温度35，生长缓慢，在鸡蛋培养基上常形成光滑型菌落；热触酶（+）、不被T2H抑制。（2）隐藏分枝杆菌临床上重要的NTM快生长群（1）龟分枝杆菌-脓肿分枝杆菌群 前者多引起免疫缺陷患者的播散性皮肤感染；后者感染多见，自来水是其重要储存处，可引起慢性肺部疾病、耳炎和播散性皮肤感染。菌落可表现为光滑型或粗糙型，可在麦康凯平板上生长（2）偶发分枝杆菌群 多见于环境，如水、土壤和灰尘中，与皮肤和软组织感染（包括局部感染和针刺脓肿）有关临床上重要的NTM偶发分枝杆菌引起的注射后感染2.光产色菌 均属慢生长菌，其特点是菌落在暗处为奶油色，曝光1h后变为黄色或橘黄色（1）堪萨斯
11、分枝杆菌：是NTM中引起肺部疾病的第二常见病原（第一是MAC），多分布于水中。菌落为粗糙型或光滑型、边缘呈特征性波浪状、中心为黑色。触酶多强阳性、吐温80水解试验（3天）阳性、硝酸盐还原阳性 （2）海分枝杆菌临床上重要的NTM3.暗产色菌 这类细菌无论在有光或无光条件下均可产生色素，色素为黄色或橘黄色。与人类疾病有关的均是慢生长菌（1）戈登分枝杆菌（2）瘰疬分枝杆菌（3）苏加分枝杆菌临床上重要的NTM1.标本采集 与结核分枝杆菌类似2.涂片抗酸染色 NTM为抗酸杆菌，但较结核分枝杆菌短而粗，大小约18m0.30.5m，抗酸染色着色均匀，呈束状或团状排列NTM的微生物学检验NTM纯培养抗酸染色（
12、1000）3.分离培养与鉴定NTM的鉴定可跟据细菌生长速度、色素等表型特征进行初步鉴定，再进行分子诊断，后者应用越来越广泛（1）不产色菌 细菌在光照和暗处均不产生色素慢生长群 营养要求高，生长缓慢，最适生长温度3537，菌落多为光滑型，少数为粗糙型快生长群 在普通培养基上即可生长 最适生长温度为2545 生长速度快，36d即可形成菌落NTM快速生长菌培养72小时菌落（2）光产色菌菌落特点是在暗处一般不产生色素，光照1h后能在48h内转为黄色或橘黄色需在营养复杂的培养基上才能生长，生长缓慢，菌落光滑有时可形成索状生长（3）暗产色分枝杆菌菌落无论有光或无光均能产生色素，色素呈黄色或橘黄色与人类疾病
13、有关的多生长缓慢，菌落为光滑型4.其他鉴定方法NTM非培养方法的鉴定与结核分枝杆菌类似，可参考结核杆菌部分第三节 麻风分枝杆菌（Mycobacterium Leprae）重点提示临床意义生物学特性微生物学检验一、临床意义麻风分枝杆菌是麻风病的病原菌，麻风是一种慢性传染病，主要表现为皮肤、粘膜和神经末梢的损害。晚期可侵犯深部组织和器官，形成肉芽肿传染源：麻风患者传播途径：直接接触、飞沫传播易感人群：多为免疫缺陷个体根据临床表现、免疫病理变化和细菌检查结果等将麻风分为瘤型、结核样型两种病型结核样型麻风患者手部病变体征抗酸杆菌，呈束状或团状排列，革兰阳性无鞭毛、荚膜和芽胞。用药后细菌可断裂为颗粒状、
14、链杆状等，着色不均匀细胞内寄生菌，可形成麻风细胞（即有麻风杆菌存在、呈泡沫状的细胞）目前不能人工培养二、生物学特性标本涂片抗酸染色是诊断麻风的主要依据PCR检测麻风菌基因、运用新发现抗原血清学与T细胞试验可以对麻风病进行早期诊断动物实验：将患者活检组织材料接种到小鼠足垫中，然后观察小鼠发病情况三、微生物学检验本章小结 分枝杆菌属的细菌因其细胞壁富含脂质，经加温或延迟染色时间后能抵抗一定浓度盐酸乙醇的脱色作用，故称抗酸杆菌。该属细菌培养时专性需氧，营养要求特殊，大多数生长缓慢，其中的麻风分枝杆菌目前尚不能人工培养。该属细菌中临床最常见的是结核分枝杆菌，该菌经萋尼抗酸染色后呈红色，用荧光染料金胺O
15、染色后，在荧光显微镜下菌体发出黄绿色荧光。结核分枝杆菌常用罗琴培养基进行培养，该菌在罗琴培养基上生长缓慢，一般24周才能形成肉眼可见菌落，菌落外观类似“菜花样”；在液体培养基中生长较为迅速，一般12周即可生长，常形成表面菌膜，有毒力菌株可呈束状生长 结核分枝杆菌典型生化特征表现为烟酸累积试验阳性、还原硝酸盐为亚硝酸盐、触酶阳性。该菌不被T2H抑制、吡嗪酰胺酶阳性，而牛结核分枝杆菌正好相反。结核分枝杆菌易发生变异，卡介苗是其减毒活疫苗。该菌对理化因素有较强抵抗力，耐干燥、耐一定浓度酸碱和孔雀绿或结晶紫等染料，但对乙醇、紫外线、湿热等敏感。该菌是结核病的病原体，可侵犯全身各个器官，但以肺结核最为多
16、见。其致病物质主要与其菌体成分如荚膜、脂质和蛋白质等有关，结核的免疫属于有菌免疫，结核菌素试验通过检测机体对结核菌素有无迟发型超敏反应，从而了解机体是否有过结核分枝杆菌感染，或对结核分枝杆菌是否具有免疫力本章小结 结核分枝杆菌的实验室检查主要包括临床标本涂片抗酸染色后直接显微镜检查和分离培养鉴定两大类，免疫学方法如结核菌素试验、抗原、抗体检测等也可辅助该菌的临床诊断，PCR技术可用于结核分枝杆菌DNA的快速检测 非结核分枝杆菌主要包括不产色菌、暗产色菌和光产色菌三大类，前两者均包含快生长菌群和慢生长菌群，而后者均为慢生长菌群。这类抗酸菌作为条件致病菌常引起有潜在肺部疾病、免疫抑制或缺陷（如艾滋病）等患者的感染。麻风分枝杆菌形态和染色性与结核分枝杆菌类似，但不能进行人工培养，是典型细胞内寄生菌，主要引起慢性传染病麻风本章小结