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1、乳酸菌胞外多糖的结构表征与诱导HT-29细胞凋亡作用 研究 结直肠癌至今已成为仅次于肺癌、肝癌和胃癌的全球第四大最致命的癌症，我 国平均每35分钟就有一人罹患结直肠癌。资料表明，结直肠癌的发病原因与饮食密 不可分，低纤维素、高蛋白和高脂肪为主的饮食习惯导致结直肠癌的发病率 直线上 升。研究表明，乳酸菌作为应用历史悠久的食品级微生物，具有预防结肠癌和抑制其 细胞增殖的作用。胞外多糖作为乳酸菌的重要代谢产物，其抗癌活性和临床应用价值 成为近年来的研究热点。本研究依据课题组前期对乳酸菌生物活性作用的筛选结果，选择分离自中国 少数民族地区传统发酵食品和婴儿粪便中的9株乳酸菌X1K X12x K1K J
2、5、J10、M5M23 IN4125和SB27为研究对象，以鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus GG,ATCC 53103,USA标准菌株为阳性对照，分别制备以上乳酸菌的无菌体发酵代 谢 产物。以HT29人结肠癌细胞为模型，通过MTT法筛选出K1K M5 SB27和X12 菌株的发酵代谢产物对HT-29细胞的增殖抑制率分别为20.11 0.36%、25.75 0.63%、35.98 0.47%和21.10 土 0.98%,显著高于阳性对照组对HT-29细胞的抑 制率 18.821.01%(P<0.05)o 经16S r DNA中属鉴定，以上4株乳酸菌均分属于干酪
3、乳杆菌(Lactobacillus casei)o分别制备提取干酪乳杆菌K1K M5 SB27和X12的粗胞外多糖，通过 DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析对粗胞外多糖样品进行线性洗脱，得到 相应酸性多糖样品。通过苯酚硫酸法测定K1K M5 SB27和X12干酪乳杆菌所产的粗多糖产量 分别为2.16 g/L X 2.35 g/L v 2.81 g/L和2.09 g/L;纯化后酸性多糖的含量分别为 5.40 X 10-2 g/Lx 8.10 X 10-2 g/Lv 13.75 X 10-2 g/L 和 6.6 X 10-2 g/L o 经 DEAESepharose
4、Fast Flow阴离子交换层析纯化后，得到的4株干酪乳酸菌所产酸 性胞外多糖中总糖含量与粗多糖相比显著提升，含量均在75%以上。通过MTT实验法，以不同作用浓度的K1K M5 SB27和X12干酪乳杆菌所产 粗 多糖和纯化后酸性多糖为研究对象，对各多糖组分的抑制HT29细胞增殖能力进行 筛选；发现各菌株所产酸性多糖对HT29细胞的抑制率显著高于粗多糖组分(P<0.05),且抑制率具有浓度依赖性。采用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡染色、细 胞周期分析、HE和Hoechst 33258染色观察细胞形态以及Caspase-3蛋白活 性检 测等凋亡指标，对K1K M5 SB27和X
5、12干酪乳杆菌所产粗胞外多糖和酸性胞外多糖 诱导HT-29细胞的凋亡能力进行筛选。结果表明，4株干酪乳杆菌所产的粗多糖和酸性多糖都可以在一定程度上增力口 HT-29细胞的凋亡率，并将其细胞周期阻滞在G0/G1期。但酸性多糖组分的诱 导凋 亡能力强于粗多糖组分，并对正常细胞Vero毒性作用相对较小，显著低于对HT-29 细胞的抑制率(P<0.05)。其中丄.casei SB27酸性多糖样品能够显著诱导HT29细胞的凋亡(P<0.05),激活Caspase-3蛋白，并引起癌细胞产生凋亡形态变化。通过DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析梯度洗脱和Superdex
6、-200凝胶色谱 对L.casei SB27所产酸性多糖组分进一步纯化，得到两个均一组分的胞外多糖样 品丄W1和 LW2o 通过MTT法检测在不同作用时间和浓度条件下LW1和LW2对HT-29细胞的抑 制率，结果表明，在作用时间为48 h丄W1组分的抑制率较纯化前提升 28.76-38.64%致命的癌症我国平均每分钟就有一人罹患结直肠癌资料表明结直肠癌的发病原因与饮食密不可分低纤维素高蛋白和高脂肪为主的饮食习惯导致结直肠癌的发病率直线上升研究表明乳酸菌作为应用历史悠久的食品级微生物具有预防结热点本研究依课题组前期对乳酸菌生物活性作用的筛选结果选择分离自中国少数民族地区传统发酵食品和婴儿粪便中的
7、株乳酸菌和为研究对象以鼠李糖乳杆菌标准菌株为阳性对照分别制备以上乳酸菌的无菌体发酵代谢产物以人结肠抑制率经中属鉴定以上株乳酸菌均分属于干酪乳杆菌分别制备提取干酪乳杆菌和的粗胞外多糖通过阴离子交换层析对粗胞外多糖样品进行线性洗脱得到相应酸性多糖样品通过苯酚硫酸法测定和干酪乳杆菌所产的粗多糖产量分别为和丄W2组分的抑制率提升30.5535.62%。q RT-PCR结果表明丄W1和 LW2可以通过激活Caspase-3和Caspase-8基因，上调促凋亡基因Bad和Bax的表 达量引起HT-29细胞的凋亡。Western Blot结果显示丄W1干预组的HT29细胞中Back Bax和Caspase-
8、3蛋 白的表达水平显著上升(P<0.05),LW2处理组中Bad和Caspase-3蛋白的表 达水平 与空白组相比具有显著性差异(P<0.05)叮EM观察结果显示丄W1和 LW2 多糖组分可以引起HT29细胞凋亡形态学的改变。采用HPGP测定LW1和LW2的分子量分别为25.10和12.34 k Da。通过苯 酚 硫酸法测定LW1和LW2的总糖含量,BCA法测定蛋白含量，间轻基联苯法测定糖醛 酸含量以及氯化顿明胶法测定硫酸根含量等指标，确定LW1和LW2的总糖含 量均高于90%;LW1组分糖醛酸含量为18.16 4.54%,硫酸根含量为1.04 0.65%;LW2组分的糖醛酸含量为
9、30.13 6.98%,硫酸根含量为0.71 0.18%;两个 组分的蛋白检测结果均呈阴性。通过GC-M鲂析单糖组成，结果表明LW1和LW2主要由半乳糖(524%和 57.4%,mol%)和葡萄糖(29.1%和222%,mol%)组成。FT-IR光谱分析用于定性测定 LW1和LW2多糖组分的有机官能团和化学键。采用甲基化分析测定LW1和LW2水解产物的糖昔键类型和比例，最终确定 LW1多糖组分的主要连接方式是以(1-4)毗喃型半乳糖和(1-4)毗喃型葡萄糖为主 链,(1-4,6)-卩比喃型半乳糖为侧链,并通过06键连接在主链上。LW2的连接方式可 能以(1-4)毗喃型半乳糖和(1-4)毗喃型葡
10、萄糖为主链,(1-3)毗喃型半乳糖通过(1-3,6)-毗致命的癌症我国平均每分钟就有一人罹患结直肠癌资料表明结直肠癌的发病原因与饮食密不可分低纤维素高蛋白和高脂肪为主的饮食习惯导致结直肠癌的发病率直线上升研究表明乳酸菌作为应用历史悠久的食品级微生物具有预防结热点本研究依课题组前期对乳酸菌生物活性作用的筛选结果选择分离自中国少数民族地区传统发酵食品和婴儿粪便中的株乳酸菌和为研究对象以鼠李糖乳杆菌标准菌株为阳性对照分别制备以上乳酸菌的无菌体发酵代谢产物以人结肠抑制率经中属鉴定以上株乳酸菌均分属于干酪乳杆菌分别制备提取干酪乳杆菌和的粗胞外多糖通过阴离子交换层析对粗胞外多糖样品进行线性洗脱得到相应酸性
11、多糖样品通过苯酚硫酸法测定和干酪乳杆菌所产的粗多糖产量分别为和喃型半乳糖的06键连接在主链上。采用FE-SEM观察LW1和LW2的表面微观形态，两者均呈薄片状具有褶皱而紧 密的表面。综上所述，酸性胞外多糖组分LW1和LW2都具有明显的体外抗肿瘤作 用，但LW1比LW2的活性更强可能与它们的分子量、单糖组成、功能基团以及糖 昔键 连接类型的不同有关。致命的癌症我国平均每分钟就有一人罹患结直肠癌资料表明结直肠癌的发病原因与饮食密不可分低纤维素高蛋白和高脂肪为主的饮食习惯导致结直肠癌的发病率直线上升研究表明乳酸菌作为应用历史悠久的食品级微生物具有预防结热点本研究依课题组前期对乳酸菌生物活性作用的筛选结果选择分离自中国少数民族地区传统发酵食品和婴儿粪便中的株乳酸菌和为研究对象以鼠李糖乳杆菌标准菌株为阳性对照分别制备以上乳酸菌的无菌体发酵代谢产物以人结肠抑制率经中属鉴定以上株乳酸菌均分属于干酪乳杆菌分别制备提取干酪乳杆菌和的粗胞外多糖通过阴离子交换层析对粗胞外多糖样品进行线性洗脱得到相应酸性多糖样品通过苯酚硫酸法测定和干酪乳杆菌所产的粗多糖产量分别为和