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1、2选做实验2.1 中药的光谱鉴定2.1.1 荧光鉴定内容提要本实验采用荧光法对不同药用部位的19种中药进行品种鉴定。通过实验掌握荧光鉴定中药的基本理论、基本方法和基本技术。掌握常用中药荧光鉴别 的特征。原理荧光鉴定是利用中药中所含的某些化学成分(通常具有共扼双键体系和芳香环分子)在 吸收自然光或紫外光后能发生荧光的性质，对中药及其所含成分进行鉴定。本实验主要是通 过荧光定性分析以鉴定中药的品种或质量。仪器、材料与试剂(1)仪器与材料1)仪器 荧光分光光度计，紫外分析灯(365nm, 254nm),试管，烧杯，吸管，漏斗, 滤纸，广口瓶，索氏提取器，超声波提取器，离心机，粉碎机，天平，电炉子等。
2、2)材料 药材：牛膝，川牛膝，黄连，秦无，麦冬，娱蚣，珍珠。粉末或饮片：板蓝 根，葛根，白芷，川茸，丹参，苏木,厚朴，秦皮，木瓜，桅子，石韦，天麻。(2)试剂1%氨水，乙醛，乙醇，氢氧化钠试液，盐酸，氯仿，三氯化铝试液，石 油酸(6090)。操作步骤(1)荧光检查1)牛膝 取牛膝断面，置紫外光灯下观察，显黄色荧光；滴加1%氨水后，显淡黄绿操作步骤（1）聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本方法1）供试品液的制备 取纯净的供试品约1g,加入稀释4倍的浓缩胶缓冲液（或电极缓 冲液、稀醇液等）0.51mL,研磨成匀浆，3500rpm离心15min,取上清液加等体积的40% 蔗糖溶液，4保存，供点样用。2）电泳槽的
3、安装 垂直板电泳槽的式样很多，目前流行的是用有机玻璃做的由两个半 槽组成的方形或长方形电泳槽。两半槽之间夹着凝胶模子，模子的两侧形成正负2个槽，供 装电极缓冲液用。凝胶模子由两块玻璃装入1个塑料或硅酮橡胶的夹套内构成。玻璃板先用热的去污剂轻轻擦洗或用洗液浸泡,然后用水冲洗干净,最后用蒸储水冲洗, 直立干燥，禁止用手接触洁净的玻璃板面。手持玻璃板两边，将两块玻璃板装入夹套内，然 后垂直地放入两半槽之间，长螺杆固定。上螺丝时，要按顺序逐步拧紧，均匀用力。电泳槽装好后，将琼脂熔化，放冷后注入正极槽的小池内，使在凝胶模子的下部凝结成 约5mm厚的琼脂层。3）分离胶与浓缩胶的制备将分离胶缓冲液、分离胶贮
4、液、过硫酸镂溶液、蒸储水按 1 ：2： 1 ：4的比例（V/V）混合，配成分离胶液16mL；将浓缩胶缓冲液、浓缩胶贮液、过 硫酸镂溶液、40%蔗糖溶液按1 ： 2 ： 1 ： 4的比例（V/V）混合，配成浓缩胶液4mLo将配 好的两种胶液及2050mL新鲜蒸馈水置真空干燥器内抽气20mino分离胶液中加入四甲基乙二胺30|iL,混匀，立即缓缓注入已安装好的凝胶模子中，注 意防止气泡。分离胶液上覆盖约3mm后的蒸储水，静置lh以上，待分离胶与水层间界面 清晰时，用滤纸条小心吸净水层。插上电泳槽模板，使其底部距分离胶上层约1cm。向浓缩 胶液中加入四甲基乙二胺15|iL,混匀后注入凝胶模子中，静置
5、30min,浓缩胶变为乳白色, 垂直向上小心取出电泳槽模板。向正负电极槽内加入电极缓冲液共约800mL,两槽内液面 介于高低玻璃板之间。4）点样 用微量进样器吸取供试品溶液2040|iL,注入电泳槽底部即可。5）电泳将正负极电泳槽分别与电泳仪的正负极相连，在负极槽电极缓冲液中加浪酚 蓝指示剂12滴，打开电源，开始电泳。电泳采用稳流控制，开始时电流15mA,当样品进 入分离胶后，电流25mA。为防止温度过高，可将电泳槽放在冰箱内。当澳酚蓝前沿行至距 琼脂层约1cm时，停止电泳，整个过程约需3h。6）染色与保存 打开电泳槽，取出胶板，标记前沿。将凝胶板浸于考马斯亮蓝R250染 色液内，37c染色l
6、h。染色后用蒸储水冲去凝胶表面附着的染料，再用脱色液脱色。经常 更换脱色液，直到背景清晰为止。凝胶板可放入脱色液中长期保存。（2）常用中药的电泳鉴定1）苦杏仁及桃仁 供试品溶液的制备：分取供试品粉末各约1.0g,分别加入25%浓 缩胶缓冲液1mL,超声提取30min, 3 500rpm离心20min,吸取上清液，加入40%蔗糖溶液 （1 ： 1）,混匀。电泳方法：吸取上述2种溶液各20|iL,分别点样于同一聚丙烯酰胺凝胶胶片上，用澳 酚蓝示踪，电泳（初始电流15mA,稳流25mA）,取出胶片，用考马斯亮蓝R250溶液染色, 脱色至谱带清晰。结果：苦杏仁有3个特征性主谱带，与桃仁有明显的区别。2
7、）薪蛇、乌梢蛇及金钱白花蛇 供试品溶液的制备：分取供试品粉末各约1.0g,加 入生理盐水4mL,研磨成匀浆，离心15min （4 00Ch7min）,取上清液，加入1倍量丙酮，离 心15min （4 000r/min）,加入1/2体积的40%蔗糖液，备用。电泳方法：吸取上述溶液各20|iL,分别点样于同一聚丙烯酰胺凝胶胶片上，用溟酚 蓝示踪。电泳（分离胶浓度为7.5%,浓缩胶浓度为2.5%；初始电流10mA,稳流15mA） 取出胶片，放入7%醋酸溶液中固定lOmin,用0.2%考马斯亮蓝R250染色30min,取出，用 蒸储水洗，再放入含20%甲醇和7%醋酸的脱色液中，脱色30min。结果：薪
8、蛇有7条谱带，一级带2条、二级带3条、三级带2条。乌梢蛇有一级带3 条，二级带和三级带各2条，扩散带1条。金钱白花蛇有一级带2条，二级带4条，三级带 2条。3）小茴香 供试品溶液的制备：取小茴香粉末约1.0g,加入25%浓缩胶缓冲液1mL, 超声提取30min,离心20min （3 500r/min）,吸取上清液，加入40%蔗糖溶液（1 ： 1）,混 匀备用。易混药材供试溶液的制备：取蔚萝子同上法制备。电泳方法：吸取上述2种溶液各20piL,分别点样于同一聚丙烯酰胺凝胶胶片上，用 澳酚蓝示踪，电泳（初始电流15mA,稳流25mA）,取出胶片，用考马斯亮蓝R250溶液染 色，脱色至谱带清晰。结果
9、：供试品与易混品比较，具有4个特征性谱带。要点及难点解答（1）经高温或炮制处理的药材，很可能会因蛋白质的失活而难以得到理想的电泳图谱。（2）新配制的过硫酸镀溶液在4c下可保存1周。（3）加蔗糖溶液增加提取液的密度，以便于样品液沉于样品槽底部。（4）琼脂层既可导电，又具有密封作用。（5） 一定要将水层彻底除去，且注意不能破坏分离胶的水平表面。习题与作业（1）习题1）用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定中药的实验步骤与方法。2）常用中药电泳鉴定的主要特征。（2）作业记录实验结果并进行分析，绘制各供试品的电泳图谱。2.3鹿茸的特异PCR鉴定内容提要本实验采用中药基因鉴定法中的特异PCR分析原理与技术，对鹿茸的品
10、种或质量进行 鉴定。通过实验了解生物鉴定法的基本理论、基本方法和基本技术。掌握鹿茸不同品种的特异 PCR鉴定特征和基本方法。原理1985美国科学家K. Mullis及同事发明的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, 简称PCR)技术使人们可以在体外轻易地大规模扩增DNA的片段。该技术因此而获得了 1993年的诺贝尔奖。其原理是在试管中以极少量样品DNA作模板，在一对引物的引导下, 通过DNA聚合酶的作用和高温变性、适温复性和延伸的循环往复，在12h之内将DNA片 段合成上百万倍。将不同待测药材的DNA片段扩增出来比较其异同，就可以地明确无误地 鉴定药材的分类归属。
11、基因是物种进化的基础，每种基因在生物一生中都承担其相应的功能，因而，基因的 序列是比较保守的，往往某个基因会在种上表现出变异或进化的特征，特异PCR鉴定就是 根据这一特点，先对某物种种上群体的特定基因进行序列比对研究，找出序列差异。然后设 计出能特异性的鉴别某个物种的特异引物对，并以此引物对来鉴定供试品。本实验以不同品种鹿茸为材料分别提取的DNA,并以此作为PCR扩增待检模板，用 已制备的马鹿茸特异引物对供试品模板进行PCR扩增，扩增结果具有特异性。仪器、材料与试剂(1)仪器与材料1)仪器PCR基因扩增仪，潜水式凝胶电泳仪，紫外光灯，乳钵，微量进样器，离心机, 分析天平，扭力天平，烧杯，量筒，
12、三角瓶，刻度吸管(1mL, 2mL, 10mL),试管，离心 管，培养皿，滤纸等。2)材料 马鹿茸，花鹿茸。任选其他鹿茸DNA。（2）试剂 Taq 酶（0.9U）, 10mM/LdNTP （dATP, dCTP, dGTP, dTTP）, 50mM/L 马鹿特异 PCR 引物对（primeri ： 5rGTTATGTAAACAAGACTGTTCGCCAGAGTACTACCGGC3； primer2： 5TGACTGCAGAGGGTGACGGGCGGTGTGT39, 1. 4%琼脂糖， 漠化乙锭（EB）, 25mM/L MgCb，10XBuffer （缓冲溶液），ddH2O,液氮,1XTAE 电
13、 泳缓冲液等。操作步骤（1）模板的制备 取马鹿茸约0.3g,用刀片刮去表面层，无菌水清洗若干次，晾干， 置洁净的乳钵内，加液氮研磨至细粉末，移入10mL的离心管中，用SDS（十二烷基硫酸钠） 法提取DNA,作为供试品模板。同法制备梅花鹿茸的DNA,作为对比品模板。（2）引物的选择 马鹿茸的特异PCR引物对。（3） PCR扩增反应体系 50uL反应体系（表）,实验设1个DNA空白对照。表PCR扩增反应体系1个反应n个反应10 x Buffer5uLXnMgCh3uLX ndNTPluLX nprimer l/primer2各 0.2uLX/iDNA2uL（约 30ng）XnTaq酶0.3uLXn
14、ddH2O38.3uLX n（4） PCR扩增 设DNA空白对照（ck）,用同样的引物和PCR条件进行扩增反应。 扩增程序：预变性 94 6min, 7 2 4 min；35 个循环，其中 94 40s, 65 Imin, 72 Imin；后延伸 72 6min。4 c保存。（5）电泳 取扩增产物10pL,用DNA相对分子量标准（200-2 OOObp）参照，走琼脂 糖凝胶电泳（1.4%的琼脂糖凝胶，1XTAE电泳缓冲液），EB染色，置紫外光灯（365nm） 下观察、拍照。（6）结果分析要点及难点解答（1） PCR是一种体外扩增特定基因或DNA序列的方法，其特异性是由人工合成的引 物序列所决定
15、。双链DNA分子在临近水沸点的温度下便会分离成两条单链DNA分子（变 性）；又在适当的温度条件下，两引物分别与DNA的两条单链特异复性；在链式聚合酶与 4种脱氧核甘三磷酸（dNTP）存在及合适温度条件下，引物便按5，一3,方向复制互补DNA （延伸）。这种变性一复性一延伸的过程为一个PCR循环，一个循环使目的摸板增加1倍， 下一个循环又以上一次的扩增产物作摸板，因而，PCR扩增是以2方式扩增。理论上讲，经 过3 0个循环反应,DNA扩增量IO,i（）9倍。（2）本方法可用于含有鹿茸中成药中原料药的品种鉴定和质量控制。（3） PCR基因扩增的最大优点是操作简单、结果可靠。（4）本实验结果与不同来
16、源的鹿茸比较，马鹿茸在约350bp处应有1条特征性扩增谱带。（5） PCR扩增十分灵敏，摸板和试剂污染、实验条件的改变都会影响PCR扩增的特异性, 因而造成无扩增或扩增产物不能成带等现象。影响实验结果的主要因素有不同生产公司或同 一公司不同批号的Taq酶、引物的浓度、退火温度等。习题与作业（1） 习题1）特异PCR鉴定中药的原理、基本步骤和方法。2）影响PCR扩增特异性的主要因素及其解决办法。3）生物鉴定法在中药鉴定中的应用范围及实用价值。（2）作业简述实验步骤，记录并分析实验结果。2.4中药的常规检测2. 4. 1水分测定内容提要本实验采用2000年版中华人民共和国药典（一部）规定的基本方法
17、，测定中药水分, 以控制其质量。通过实验熟悉中药水分测定的常用方法和适应对象。原理中药中含有过量的水分，不仅易霉烂变质或使有效成分分解，还会使应用称量上相对地 减少了实际用量而不能达到治疗目的。中药的水分测定法主要有下列4种方法。（1）烘干法 烘干法又称“干燥失重法”，是指供试品在规定的条件下通过干燥，根据 供试品减失的重量，计算供试品中含水量。减失的重量主要指水分，也包括其他挥发性物质。（2）甲苯法 是将供试品与水不相溶的有效溶剂（如二甲苯、甲苯等）相混合，利用 蒸播的方法使供试品的水分随甲苯蒸气蒸储出来，经冷却后甲苯和水互相分离，直接读取供 试品的水分含量。（3）减压干燥法 是将供试品置于
18、减压干燥器内，用新鲜五氧化二磷作为干燥剂吸收 供试品的水分，减压干燥（减压至2.67kPa以下持续30min,室温放置24h）后，迅速精密 称定重量，计算供试品中的含水量。减压干燥可降低干燥温度和缩短干燥时间。（4）气相色谱法 用直径为0.250.18mm的二乙烯苯-乙基乙烯苯型高分子多孔小球 作为载体，柱温为140150C,热导检测器检测。用无水乙醇作溶剂，使供试品中的水分 气化后进入色谱柱得到分离。但色谱条件必须符合下列要求：即用水峰计算的理论板数应大 于3 000,用乙醇峰计算的理论板数应大于200；水和乙醇两峰的分离度应大于2；将无水乙 醇注样5次，水峰面积的相对标准偏差不得大于2.0
19、%。含水量的计算采用外标法。但无水 乙醇作为溶剂，含水量约3%,需要扣除。仪器、材料与试剂（1）仪器与材料1）仪器 分析天平，扁形称量瓶，水分测定装置，干燥箱，干燥器，电热套，烧杯, 试管，量筒，粉碎机，培养皿等。2）材料药材：柴胡，肉桂。（2）试剂甲苯，亚甲蓝等。操作步骤1）柴胡的水分测定（烘干法） 取柴胡（或其他供试品）颗粒25g,平铺于干燥至 恒重的扁形称瓶中，厚度不超过5mm （疏松供试品不超过10mm）精密称定，打开瓶盖在 100150干燥5h,将瓶盖盖好，移置干燥器中，冷却30min,精密称定重量，再在上述 温度下干燥lh,冷却，称重，至连续2次称重的差异不超过5mg为止。根据减失
20、的重量， 计算含水量（）。2）肉桂的水分测定（甲苯法）水分测定装置的安装：测定方法：取肉桂颗粒20g,精密称定，置A瓶中，加甲苯200mL和玻璃珠数粒，减压干燥法和气相色谱法的鉴定实例略。要点及难点解答（1）烘干法适用于不含或少含挥发性成分中药的水分测定。甲苯法适用于含挥发性成 分中药的水分测定。减压干燥法适用于含有挥发性成分贵重中药的水分测定。气相色谱法适 用于中药化学单体及其制剂的水分测定。（2）测定用的供试品，一般先破碎成直径不超过3mm的颗粒或碎片。直径和长度在3mm 以下的花类、种子类和果实类中药，可不破碎。减压干燥法所用的供试品必须是过24目筛 的粉末。（3）用化学纯甲苯直接测定，
21、必要时甲苯可先加少量水，充分振摇后放置，将水层分离弃去，经蒸储后使用。(4)柴胡的含水量不得过8.0%。肉桂的含水量不得过15.0%。习题与作业1)习题1)水分测定的主要方法及适应对象。2)柴胡和肉桂水分含量的限定指标。(2)作业简述实验步骤，记录并分析实验结果，根据实验结果确定供试品是否符合药用标准。2. 4. 2灰分测定内容提要本实验采用2000年版中华人民共和国药典(一部)规定的基本方法，测定中药的灰 分，以控制其纯度和质量。通过实验熟悉中药灰分测定的常用的方法和适应对象。原理总灰分是将将中药粉碎加热，高温炽灼至灰化，则细胞组织及其内含物种的无机物成为 灰分而残留。酸不溶性灰分是指总灰分
22、加入稀盐酸后的不溶性灰分，即主要是不溶于稀盐酸 的砂石、泥土等硅酸盐类化合物。各种中药的应在一定范围以内，所测灰分数值高于正常范 围时，说明有其他无机物污染和掺杂。仪器、材料与试剂(1)仪器与材料1)仪器 分析天平，珀埸，马福炉，表面皿，滤纸，漏斗，水浴锅，烧杯等。2)材料生地黄药材。(2)试剂10%硝酸镀溶液，稀盐酸。操作步骤(1)基本方法1)总灰分测定 取生地黄粉末5g,置炽灼至恒重的用堪中，称定重量(准确至0.01g), 缓缓炽灼，注意避免燃烧，至完全炭化时，逐渐升高温度至500600,使完全灰化并至 恒重。计算残渣的百分含量。2)酸不溶性灰分测定 取生地黄的总灰分，在堪烟中加入稀盐酸约
23、10mL,用表面皿 覆盖生土相 置水浴上加热lOmin,表面皿用热水5mL冲洗，洗液并入堪埸中，用无灰滤纸 滤过，珀期内的残渣用水洗于滤纸上，并洗涤至洗液不显氯化物反应为止。滤渣连同滤纸移 置同一片烟中，干燥，炽灼至恒重。计算残渣的百分含量。要点及难点解答(1)在测定灰分前，应将供试品预先粉碎，使能通过24目筛，混合均匀后依法测定。(2)总灰分的测定，如果炭分不易灰化，可将珀烟放冷，加热水或10%硝酸镀溶液2mL, 使残渣湿润，然后置水浴上蒸干，残渣再炽灼，至生烟内容物完全灰化。(3)每个供试品做3个平行样。(4)生地黄的总灰分不得过6.0%,酸不溶性灰分不得过2.0%。习题与作业1)习题1)
24、中药灰分测定的主要方法与基本步骤。2)生地黄灰分含量的限定指标。(2)作业简述实验步骤，记录和分析实验结果，根据实验结果确定供试品是否符合药用标准。2. 4. 3浸出物的含量测定内容提要本实验采用2000年版中华人民共和国药典(一部)规定的基本方法，测定中药浸出 物的含量，以控制其质量。色荧光（川牛膝新鲜断面置紫外光灯下显淡绿色荧光，滴加1%氨水后，显绿黄色荧光）。2）黄连 取黄连药材断面置在紫外光灯下观察，显金黄色荧光，木质部尤为显著。3）板蓝根取板蓝根水煎液，置紫外光灯下观察，显蓝色荧光。4）葛根 取葛根粉末少量在紫外光灯下观察，显亮蓝色荧光。5）白芷 取白芷粉末0.5g,加乙醛适量，冷浸
25、，振摇，放置，取上清液2滴，点于滤 纸上，置紫外光灯下观察，显黄绿色荧光。6）川苜取川号横切面置紫外光灯下观察，显亮淡紫色荧光，外皮显暗棕色荧光。7）秦先取秦无药材横切面，置紫外光灯下观察，显黄白色或金黄色荧光。8）丹参取丹参粉末5 g,加水50 mL,煮沸1520min,放冷，滤过，滤液置水浴 上浓缩至黏稠状，放冷后，加乙醇35 mL使溶解，滤过，滤液作如下试验：取滤液数滴, 点于滤纸条上，干后，置紫外光灯下观察，显亮蓝灰色荧光。将此纸条悬挂在氨水瓶中（不 接触液面），20min后取出，置紫外光灯（365nm）下观察，显淡亮蓝绿色荧光。9）麦冬取麦冬切片置紫外光灯下观察，显浅蓝色荧光。10）
26、苏木 取苏木粉末10g,置带塞试管中，加水50 mL,密塞，反复振摇并放置4 h, 滤过，滤液显橘红色，置紫外光灯下观察，显黄绿色荧光。取滤液加氢氧化钠试液2滴，显猩红色，置紫外光灯下观察，显蓝色荧光，再加盐酸使 成酸性后，溶液变为橙色，置紫外光灯下观察，显黄绿色荧光。11）厚朴 取厚朴粗粉3g,加氯仿30mL,回流30min,滤过。取滤液，在紫外光灯下, 顶面观显紫色，侧面观显二层，上层黄绿色，下层黄绿色荧光。12）秦皮 取秦皮少许浸入水或乙醇中，浸出液在日光下可见碧蓝色荧光。13）木瓜 取木瓜粉末1g,加70%乙醇10mL,回流lh,滤过，取滤液备用。取滤液 滴于滤纸上，待干，喷三氯化铝试
27、液，干燥后，置紫外光灯下观察，显蓝色荧光。14）桅子 取桅子粉末0.2g,加水5mL,水浴加热3min,取上清液滴于滤纸上，挥干, 置紫外光灯下观察，显天蓝色荧光。15）石韦 取石韦粉末2g,加95%乙醇溶液20mL回流提取30min,取滤液加蒸储水 6mL,再力口石油酷（6090）20mL抽提，分取乙醇层，在水浴上蒸干，残渣加95%乙醇溶液 8mL溶解，取溶液滴于滤纸上，干后置紫外光灯下观察。庐山石韦显黄色荧光，石韦与有 柄石韦均显蓝色荧光。16）娱蚣 取娱蚣水浸液在紫外光灯（254nm）下观察，呈现亮绿色荧光。17）珍珠取珍珠横剖面置荧光灯下观察，天然珍珠显浅蓝色荧光，养殖珍珠显亮黄绿通过
28、实验熟悉中药浸出物测定的常用的方法和适应对象。原理中药中的某些成分在水、不同浓度的醇中，在一定的条件下其浸出物的含量大致有一定 的范围。本法适用于有效成分尚不清楚或有效成分尚无精确定量方法的中药，测定其浸出物 的含量，可初步衡量其质量优劣。浸出物的含量是考察中药质量的指标之一。仪器、材料与试剂（1）仪器与材料1）仪器 分析天平，锥形瓶，蒸发皿，水浴锅，干燥器，干燥箱，冷凝管，吸管，烧 杯，试管，滤纸，漏斗等。2）材料粉末：生地黄，秦无。（2）试剂乙醇。操作步骤1）生地黄水溶性浸出物的含量测定（冷浸法） 取生地黄粉末约4g,称定重量（准 确至0.01g）,置250300mL的锥形瓶中，精密加入水
29、50100mL,密塞，冷浸，前6h内 时时振摇，再静置18h,用干燥的滤器迅速滤过，精密吸取滤液20mL,置已恒重的蒸发皿 中，置水浴上蒸干后，在105c干燥3h,移置干燥器中，冷却30min,迅速精密称定重量， 计算百分含量。2）秦无醇溶性浸出物的含量测定 取秦充粉末约4g,称定重量（准确至0.01g）,置100250mL的锥形烧瓶中，精密加入乙醇100mL,塞紧，称定重量（准确至0.01g）,静置lh后, 连接回流冷凝管，加热至沸腾，保持微沸lh。放冷后，取下烧瓶，塞紧，称定重量，用乙 醇补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过。精密吸取滤液25mL,置已恒重的蒸发皿中， 在水浴上蒸干后，在1
30、05干燥3h,移置干燥器中，冷却30min,迅速精密称定重量，计算 百分含量。要点及难点解答（1）在进行浸出物含量测定时，凡供浸出物测定用的供试品，均要预先破碎，使能通 过24目筛，取样时要混合均匀。（2）秦犬的醇溶性浸出物不得少于24.0%,生地黄的水溶性浸出物不得少于65.0%。（3）每个供试品应做3个平行样。（4）浸出物干燥后易于吸潮，难以干燥置恒重，故规定为105干燥3h后1次称量。习题与作业1）习题1）中药浸出物含量测定的基本方法。2）生地黄、秦无浸出物含量的限定指标。（2）作业简述实验步骤，记录和分析实验结果，根据实验结果确定供试品是否符合药用标准。2. 4. 4挥发油的含量测定内
31、容提要本实验采用2000年版中华人民共和国药典（一部）规定的基本方法，测定中药挥发 油的含量，以控制其质量。通过实验熟悉中药挥发油含量测定的常用的方法和适应对象。原理利用中药中所含挥发油成分能与水蒸气同时蒸储出来的性质，在特制的挥发油测定器中 测定其含量。仪器、材料与试剂（1）仪器与材料1）仪器 挥发油测定器，分析天平，烧杯，电热套，冷凝管，圆底烧瓶，粉碎机等。2）材料小茴香药材。（2）试剂二甲苯。操作步3聚（1）仪器装置安装（2）取小茴香粉末约50g,称定重量（准确至0.01g）,置烧瓶中，加水300500mL 与玻璃珠数粒，振摇混合后，连接挥发油测定器与回流冷凝管。自冷凝管上端加水使充满挥
32、 发油测定器的刻度部分，并溢流入烧瓶时为止。置电热套中缓缓加热至沸，并保持微沸约 5h,至测定器中油量不再增加，停止加热，放置片刻，开启测定器下端的活塞，将水缓缓放 出，至沿油层上端达。度线上面5mm处为止。放置lh以上，再启开下端活塞使油层下降 至其上端恰与。度线平齐。读取挥发油的量，并计算百分含量。要点及难点解答（1）用于挥发油含量测定的供试品，一般必须粉碎使能通过2450目筛。（2）本实验方法适用于相对密度在1.0以下的挥发油测定。（3）相对密度在L0以上的挥发油测定方法 供试品取样量同上法。取水约30mL与 玻璃珠数粒，置烧瓶中，连接挥发油测定器。自测定器上端添加水使充满刻度部分，并溢
33、流 入烧瓶时为止，再用移液管加入二甲苯1mL,然后连接回流冷凝管。将烧瓶内容物加热至 沸腾，并继续蒸镯，其速度以保持冷凝管的中部呈冷却状态为度。30min后，停止加热，放 置15min以上，读取二甲苯容积。然后按照上法进行测定。自油层量中减去二甲苯量，即 为挥发油量，再改算成供试品中含有挥发油的百分含量。（4）供试品的取样量应相当于挥发油0.51.0mL。（5）小茴香挥发油的含量不得低于L5%（mL/g）。习题与作业（1）习题1）中药中挥发油含量测定的基本步骤和方法。2）小茴香挥发油含量的限定指标。(2)作业简述实验步骤，记录和分析实验结果，根据实验结果确定供试品是否符合药用标准。2.5中药中
34、有害物质的检测2. 5. 1农药残留量的检测内容提要本实验采用2000年版中华人民共和国药典(一部)规定的基本方法，测定中药有机 氯农药残留量，以控制其质量和保证用药的安全性。通过实验熟悉中药有机氯农药残留量测定的基本方法和步骤。原理用气相色谱法将中药残留的有机氯农药六六六(a-BHC, p-BHC, y-BHC, b-BHC)、滴 滴涕(PP,-DDE, PP-DDD, OP-DDT, PPDDT)和五氯硝基苯(PCNB) 9个组分进行分 离，根据各组分的量(重量或在载气中的浓度)与检测的响应值(通常表现为峰面积)成正比的 关系，采用外标法计算含量。仪器、材料与试剂(1)仪器与材料1)仪器
35、气相色谱仪，容量瓶(5mL,l0mL,l000mL),锥形瓶，刻度浓缩瓶，分析天 平，量筒，超声提取器，离心机，旋转蒸发器，微量进样器，试管，烧杯等，粉碎机等。2)材料 甘草药材。对照品：a-BHC, p-BHC, y-BHC, 8-BHC, PP-DDE, PP-DDD, OP,-DDT, PPDDT, PCNBo(2)试剂石油酸(60-90),丙酮，氯仿，二氯甲烷，无水硫酸钠，硫酸等。操作步骤(1)对照品贮备液的制备(5)测定要点及难点解答（1）有机氯农药残留量的测定亦可用高效液相色谱法测定，如DDT可在18min内获 得分离。（2）有机氯农药不溶于水，在有机溶剂中溶解度大，故处理样品时常
36、用苯、丙酮、氯 仿、乙醛等提取。纯化时选用柱色谱或溶液萃取以除去干扰杂质，根据需要选择适当的洗脱 液或萃取液。对于含油脂较多的样品可在酸性或中性条件下采用水蒸气蒸储法，蒸储液用苯 或氯仿萃取，再纯化，得供试品溶液。（3）供试品若为中药，取样量应相当于药材的2g。习题与作业1）习题1）有机氯农药残留量检测的基本步骤和方法。2）甘草中农药残留量的限定指标。（2）作业简述实验步骤，记录和分析实验结果，根据实验结果确定供试品是否符合药用标准。1) 5. 2重金属的检查内容提要本实验采用2000年版中华人民共和国药典（一部）规定的基本方法，对部分中药中 重金属的含量进行检测，以控制其质量和保证用药的安全
37、性。通过实验熟悉中药常见重金属检查的方法和限量要求。原理重金属系指在实验条件下能与硫代乙酰胺（或硫化钠）作用显色的金属杂质。常见的重 金属离子 Ag+、Pb2 Bi3 Cu2 Sb3 As3 Sn2 Ni2 Cb2 Zn2 Hg?+等，在微酸性 溶液中均能生成不溶性硫化物；而Hg2+、Pb2 Bi3 Cu2 Co2 Fe2 Mn2 Ni2 Cb2Z/+等离子，在碱性溶液中均能生成不溶性硫化物。在一定量已知浓度的铅盐Pb （N03） 2或Pb （Ac） 2溶液中，加入硫代乙酰胺（或硫化 钠）试液，将所得含PbS的有色胶体溶液和定量供试样品溶液同法处理后所得的胶体溶液 相比较，由二者色泽的深浅即可
38、判断供试样品中重金属的含量是否符合规定的标准。仪器、材料与试剂（1）仪器与材料1）仪器 容量瓶（100mL, 1000mL）,纳氏比色管，吸管，烧杯，分析天平，锥形瓶, 里同寺。2）材料 冰片（合成龙脑）药材，微孔滤膜（孔径3pn）。（2）试剂 硝酸铅，硝酸，醋酸盐缓冲液（pH3.5）,稀焦糖溶液，硫代乙酰胺试液， 盐酸，抗坏血酸等。操作步臊（1）标准铅溶液的制备（2）供试品溶液的制备 取冰片2g,加乙醇23mL溶解后，加稀醋酸2mL,备用。（3）测定方法要点及难点解答（1）中药中重金属的检查可按现版药典中的规定执行。（2）冰片中重金属的含量不得过百万分之五。（3）供试品也可以选用阿胶、石膏、
39、芒硝。（4）在测定中，习题与作业1）习题1）中药中常见的重金属及其检测原理。2）冰片（合成龙脑）重金属含量的限定指标。（2）作业简述实验步骤，记录和分析实验结果，根据实验结果确定供试品是否符合药用标准。2. 5. 3碑盐的检查内容提要本实验采用2000年版中华人民共和国药典（一部）规定的基本方法，对中药中的碑 盐进行检测，以控制其质量和保证用药的安全性。通过实验熟悉中药碎盐检测的方法和限量要求。原理仪器、材料与试剂（1）仪器与材料1）仪器 碑盐测定装置（古蔡氏法使用得装置），容量瓶（100mL, 1000mL）,水浴 锅，吸管，烧杯，分析天平，锥形瓶，量筒等。2）材料石膏药材，醋酸铅棉花。（2
40、）试剂和试纸 盐酸，三氧化二碎，稀硫酸，20%氢氧化钠，澳化汞试纸，碘化钾 试液，酸性氯化亚锡试液，锌粒等。操作步骤（1）标准碑溶液的制备(2)供试品溶液的制备 取石膏粉末1g,加盐酸5mL,加水至23mL,加热使溶解，放 冷，备用。(3)测定仪器安装要点及难点解答(1)供试品也可以选用芒硝、阿胶、注射用双黄连。(2)醋酸铅脱脂棉花(3)所用仪器和试液(4)习题与作业1)习题1)神盐的检测原理和基本方法。2)石膏中碎盐含量的限定指标。(2)作业简述实验步骤，记录和分析实验结果，根据实验结果确定供试品是否符合药用标准。2.6大黄中葱醍成分的含量测定一高效液相色谱法内容提要本实验采用高效液相色谱法
41、测定大黄中大黄素和大黄酚的含量，以控制其质量。通过实验掌握高效液相色谱法用于中药中葱醍类成分含量测定的色谱条件和基本 方法。原理高效液相色谱法将中药中的被测组分进行分离，根据组分的量与检测的响应值(通常表 现为峰面积)成正比的关系，采用外标法计算含量。其定量分析的过程一般分为4个步骤： 色谱分离过程、峰面积测量、计算、实验数据的统计分析。仪器、材料与试剂(1)仪器与材料1)仪器 高效液相色谱仪，微量进样器，圆底烧瓶，冷凝管，超声提取器，分液漏斗, 分析天平，容量瓶(25mL, 50mL, 1000mL),水浴锅，滤纸，漏斗，吸管，烧杯，分析 天平，锥形瓶，粉碎机，样品筛，量筒，试管等。2)材料
42、 大黄药材。对照品：大黄素，大黄酚。(2)试剂 甲醇，2.5mol/L硫酸溶液，氯仿，无水硫酸钠，0.1%磷酸溶液等。操作步骤(1)对照品溶液的制备 精密称取大黄素、大黄酚对照品各5mg,分别置50mL量瓶 中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密量取大黄素溶液1 mL、大黄酚溶液2mL, 分别置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀(大黄素每1 mL中含4|ig、大黄酚每1 mL中 含 8(ng)o(2)供试品溶液的制备 取大黄粉末(过65目筛)约0.1g,精密称定，置50mL锥形瓶 中，精密加甲醇25mL,称定重量，加热回流30min,放冷，再称定重量，用甲醇补足减失 的重量，摇匀，滤过，
43、精密量取续滤液5 mL,置50 mL圆底烧瓶中，挥去甲醇，加2.5mol/L 硫酸溶液10mL,超声处理5min,再加氯仿10mL,加热回流lh,冷却，移置分液漏斗中， 色荧光，通常环周部分较明亮。(2)荧光光谱 取天麻粉末38mg,置具塞试管中，加乙醇10mL,密塞，超声波提 取60min,离心，取上清液作为供试品溶液。选择激发波长，x(max)254nm,用荧光分光光度 计测定。供试品在302nm和592nm波长处有特征峰。要点及难点解答(1)必须指出，并不是所有的中药或其成分都有发生荧光的性质。有些中药本身不发 生荧光，但若用酸、碱或荧光染色处理后，就可能使某些成分在紫外光线下变为可见色
44、彩。 有的中药附有地衣或有多量霉菌生长，也可能有荧光出现，因此荧光鉴定还可用于检查某些 中药的变质情况。此外，在色谱分析应用上，也可能使吸附在吸附柱上、纸条上及薄层板上 的各种成分产生荧光色谱。(2)中药荧光检查所用的紫外分析灯，在没有特殊注明的情况下，波长均为365nm。(3)荧光鉴定法灵敏度高，能够测定出IOi()-9moi/L浓度的荧光物质。(4)荧光鉴定中药有直接荧光法和间接荧光法两种类型，直接荧光法是根据中药本身所 含物质产生荧光的特性直接观察或测定；间接荧光发是利用具有高灵敏度的荧光试剂使无荧 光或荧光很弱的中药产生荧光载测定，或通过化学反应使中药中的化学成分产生荧光基团再 进行测
45、定。习题与作业(1)习题1)用荧光法鉴定中药的原理与基本方法。2)总结常用中药荧光定性鉴定的主要特征。(2)作业简述实验步骤，记录和分析实验结果。可见.紫外光谱鉴定内容提要用少量氯仿洗涤容器，并入分液漏斗中，分取氯仿层，酸液用氯仿萃取2次，每次约8mL, 合并氯仿液，以无水硫酸钠脱水，氯仿液移置100 mL锥形瓶中，挥去氯仿，残渣精密加甲 醇10mL,称定重量，置水浴中微热溶解残渣，放冷后，再称定重量，用甲醇补足减失的重 量，摇匀，滤过，取续滤液备用。（3）测定方法1）色谱条件与系统适用性试验 填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶。流动相：甲醇-0.1% 磷酸溶液（85： 15）。检测波长：254 n
46、mo理论板数：按大黄素峰计算应不低于1 500。2）分别精密吸取上述2种对照品溶液与供试品溶液各5rL,注入液相色谱仪测定。（4）计算 测定供试品的水分后计算。要点及难点解答（1）大黄按干燥品计算，含大黄素（C15H10O5）和大黄酚（C15HI0O4）的总量不得少于 0.50% o（2）大黄的水分测定用烘干法。测定方法参见实验水分测定。（3）所用的仪器为高效液相色谱仪，鉴定药典收载的品种，色谱柱的填充剂和流动相 的组分应按各该品种项下的规定。常用的色谱柱填充剂有硅胶，用于正相色谱；化学键合固 定相，根据键合的基因不同可用于反相或正相色谱,其中最常用的是十八烷基硅烷键合硅胶, 可用于反相色谱或
47、离子对色谱；离子交换填充剂，用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填 充剂，用于分子排阻色谱等。注样量一般为数微升，除另有规定外，柱温为室温，检测器为 紫光吸收检测器。习题与作业1）习题1）用高效液相色谱法测定中药中葱醍类成分的基本步骤和方法。2）大黄中主要化学成分及其含量限定指标。（2）作业简述实验步骤，记录和分析实验结果，根据实验结果确定供试品是否符合药用标准。2.7紫草中羟基蔡醍总色素的含量测定一可见分光光度法内容提要本实验采用可见分光光度法测定紫草中羟基蔡醍总色素的含量，以控制其质量。 通过实验掌握可见分光光度法用于中药色素类成分含量测定的基本方法。原理可见分光光度法是通过比较中药溶液颜色对光的吸收度，以鉴定其某种成分或组分 含量的方法。仪器、材料与试剂(1)仪器与材料1)仪器 可见紫外分光光度计，分析天平，容量瓶(25mL, 100mL),吸管(5mL