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1、12六月2023第八章第八章微生物遗传微生物遗传遗传型（genotype）：基因型，指生）：基因型，指生物个体所包含的全部遗传因子，即基物个体所包含的全部遗传因子，即基因组所携带的遗传信息。因组所携带的遗传信息。表型（phenotype）：表现型，指某）：表现型，指某一生物所具有的一切外表特征和内在一生物所具有的一切外表特征和内在特性的总和，是遗传型在适合环境条特性的总和，是遗传型在适合环境条件下通过代谢和发育得到的具体体现。件下通过代谢和发育得到的具体体现。遗传型遗传型+环境条件环境条件表型表型（可能性）（可能性）（现实性）（现实性）变异：指生物体在某种外因或（和）内因作指生物体在某种外因或
2、（和）内因作用下，所引起的遗传物质结构或数量的改变，用下，所引起的遗传物质结构或数量的改变，即遗传型的改变。即遗传型的改变。特点：几率低（：几率低（10-510-10），性状变化大，新性），性状变化大，新性状稳定、可遗传。状稳定、可遗传。饰变（modification）：）：指外表的修饰性指外表的修饰性改变，是一种不涉及遗传物质结构改变而仅发改变，是一种不涉及遗传物质结构改变而仅发生在转录、转译水平上的表型变化。生在转录、转译水平上的表型变化。特点：群体几乎所有个体发生同样变化，性状变化：群体几乎所有个体发生同样变化，性状变化幅度小，且不稳定、不可遗传。幅度小，且不稳定、不可遗传。野生型(wi
3、ldtype)：从自然界中分离到的微从自然界中分离到的微生物菌株，称野生型菌株，简称野生型。生物菌株，称野生型菌株，简称野生型。突变型：野生型菌株经突变后形成的带有新性野生型菌株经突变后形成的带有新性状的菌株，称突变株，或突变体、突变型。状的菌株，称突变株，或突变体、突变型。一、三大经典实验1.经典转化实验经典转化实验1928F.Griffith以以Streptococcus pneumoniae（肺炎链球菌）为研究对象。它使（肺炎链球菌）为研究对象。它使人患肺炎，鼠患败血症人患肺炎，鼠患败血症。S.pneumoniae有两种菌株：S型：有荚膜，菌落表面光滑（型：有荚膜，菌落表面光滑（Smoo
4、th）,有致病性有致病性R型：无荚膜，菌落表面粗糙（型：无荚膜，菌落表面粗糙（Rough）,无致病性无致病性什 么 是 遗 传 的 物 质 基 础？第一节 微生物遗传的物质基础1）动物试验）动物试验2）细菌培养试验）细菌培养试验3）S型菌的无细胞抽提液试验型菌的无细胞抽提液试验活活R菌菌+S型菌的无细胞抽提液型菌的无细胞抽提液大量大量R菌和少量菌和少量S菌菌说明在死的S型细菌体内可能存在某种具有遗传转化能力的物质，可以进入R型菌细胞，使R性菌株获得表达S型荚膜性状的遗传物质。培养皿培养1944年，年，O.T.Avery等从热死等从热死S型菌株提型菌株提纯了几种可能的转化因子进行体外转化。纯了几
5、种可能的转化因子进行体外转化。第一证据确定DNA是遗传的物质基础噬菌体感染实验噬菌体感染实验1952年，年，A.D.Hershey&M.Chase利用噬菌体感染实验利用噬菌体感染实验证明证明DNA是噬菌体的是噬菌体的遗传物质基础。遗传物质基础。3.植物病毒重建实验植物病毒重建实验1956年，年，H.Fraenkel-Conrat用含用含RNA的烟草花叶的烟草花叶病毒（病毒（TMV）与霍氏车前花叶病毒）与霍氏车前花叶病毒(HMV)进行著名的进行著名的植物病毒重建实验，证明植物病毒重建实验，证明RNA是病毒的遗传物质。是病毒的遗传物质。三大经典实验证明核酸是遗传的物质基础三大经典实验证明核酸是遗传
6、的物质基础二、微生物中遗传物质的存二、微生物中遗传物质的存在在部位和方式部位和方式（一）7个水平1.细胞水平原核生物大部分的原核生物大部分的DNA存在于核区（核质体），真核生存在于核区（核质体），真核生物的存在细胞核内。物的存在细胞核内。不同种微生物的细胞核或核区的数目有所不同。如：不同种微生物的细胞核或核区的数目有所不同。如：Aspergillus niger(黑曲霉）黑曲霉）单核单核杆菌细胞杆菌细胞两核区两核区A.oryzae(米曲霉）米曲霉）双核双核球菌细胞球菌细胞一个核区一个核区同种微生物不同细胞中细胞核或核区的数目也有所不同。同种微生物不同细胞中细胞核或核区的数目也有所不同。如：藻状
7、菌类（真菌）和放线菌的菌丝细胞为多核，孢如：藻状菌类（真菌）和放线菌的菌丝细胞为多核，孢子为单核子为单核.2.细胞核水平除核基因组外，还有核外染色体除核基因组外，还有核外染色体真核细胞核外染色体有：真核细胞核外染色体有：细胞质基因：线粒体、叶绿体：线粒体、叶绿体共生生物：草履虫的卡巴颗粒，属于：草履虫的卡巴颗粒，属于Caedibacter属属的共生细菌的共生细菌2um质粒：存在：存在Saccharomyce cerevisiae(酿酒酵酿酒酵母母)细胞核，不与核基因组整合。细胞核，不与核基因组整合。原核细胞核外染色体统称原核细胞核外染色体统称质粒。如：如：F因子（因子（F质粒）质粒）R因子（因
8、子（R质粒）质粒）Ti质粒等质粒等3.染色体水平染色体水平1）染色体数目：）染色体数目：不同微生物染色体数目差别比较大，不同微生物染色体数目差别比较大，真核微生物有较多染色体，原核生物每个核区仅一个染真核微生物有较多染色体，原核生物每个核区仅一个染色体。色体。2）染色体倍数：）染色体倍数：单倍体：细胞中只有一套染色体。：细胞中只有一套染色体。双倍体：细胞中含有两套功能相同的染色体。：细胞中含有两套功能相同的染色体。自然界的微生物多数是单倍体，少数微生物如自然界的微生物多数是单倍体，少数微生物如S.cerevisiae (酿酒酵母酿酒酵母)的营养细胞，两个单倍体性细胞的营养细胞，两个单倍体性细胞
9、接合成的合子为双倍体。接合成的合子为双倍体。4.核酸水平核酸水平核酸种类：大部分微生物的遗传物质是大部分微生物的遗传物质是DNA，部分，部分病毒少数噬菌体的遗传物质是病毒少数噬菌体的遗传物质是RNA核酸结构：大部分微生物的大部分微生物的DNA是双链，双链是双链，双链DNA有环状（原有环状（原核生物和部分病毒）、线状（部分病毒）、超螺旋状核生物和部分病毒）、线状（部分病毒）、超螺旋状（质粒（质粒DNA）；）；少数病毒如少数病毒如E.coli的的X174和和fd噬菌体等的噬菌体等的DNA为单为单链。链。DNA长度：即基因组的大小，用即基因组的大小，用bp(碱基对碱基对)、kb、Mb为单位，不同微生
10、物基因组的大小差别很大，表为单位，不同微生物基因组的大小差别很大，表现出多样性。已经了解现出多样性。已经了解30多种微生物基因数据。多种微生物基因数据。5.基因水平基因水平基因是生物体内一切具有自主复制能力的最小基因是生物体内一切具有自主复制能力的最小遗传单位。众多基因构成染色体。遗传单位。众多基因构成染色体。从基因的功能来看，原核生物的基因是通过调从基因的功能来看，原核生物的基因是通过调控系统来发挥功能。控系统来发挥功能。启动基因（启动子）启动基因（启动子）操纵子操纵子操纵基因操纵基因基因调控系统基因调控系统结构基因结构基因调节基因调节基因基因及表达产物的名称表示基因及表达产物的名称表示基因
11、名称基因名称3个小些字母斜体表示，如个小些字母斜体表示，如bio若同一基因不同位点则在基因后用正体大写字母或若同一基因不同位点则在基因后用正体大写字母或数字表示，如数字表示，如lacZ抗型基因在基因符号右上角写大写的抗型基因在基因符号右上角写大写的R。如。如tetR基因表达产物用基因表达产物用3个大写字母（或个大写字母（或1个大写、个大写、2个小些），如个小些），如LacZ：真核微生物的基因与原核微生物的最明显差异：无操真核微生物的基因与原核微生物的最明显差异：无操纵子，有大量不编码序列和重复序列，转录和转译被纵子，有大量不编码序列和重复序列，转录和转译被分隔，基因被内含子阻隔。分隔，基因被内
12、含子阻隔。6、密码子水平、密码子水平7、核苷酸水平、核苷酸水平（二）、原核生物的质粒（二）、原核生物的质粒1、定义、构型和用途质粒：是：是DNA分子，游离原核生物核基因组或染色分子，游离原核生物核基因组或染色体以外，具有独立复制能力的小型的遗传因子。体以外，具有独立复制能力的小型的遗传因子。有三种构型：有三种构型：CCC型：共价闭合环状的超螺旋型：共价闭合环状的超螺旋dsDNA。OC型：开放环型型：开放环型L型：型：线型线型2.质粒的类型1）F质粒：F因子、致育因子、性因子因子、致育因子、性因子与育性有关的质粒与育性有关的质粒是是E.coli等细菌决定性别、具有转移能力的质等细菌决定性别、具有
13、转移能力的质粒。大小粒。大小100kb，CCC型质粒。型质粒。F+菌株：携带菌株：携带F质粒的菌株称质粒的菌株称F+菌株（雄性）。菌株（雄性）。F-菌株：不携带菌株：不携带F质粒的菌株称质粒的菌株称F-菌株（雌性）。菌株（雌性）。组成：转移起点可转移因子转移区（tra区）2）R质粒质粒：抗性因子、：抗性因子、R因子因子与抗性有关的质粒与抗性有关的质粒由两部分组成：由两部分组成：抗性转移因子（RTF）：主要含调节）：主要含调节DNA复复制和拷贝数的基因、转移基因，具有转移功能。制和拷贝数的基因、转移基因，具有转移功能。抗性决定因子：r-决定因子，主要含各种抗性决定因子，主要含各种抗性基因如基因如
14、Tetr、Ampr等基因，有些等基因，有些R质粒使宿质粒使宿主细胞产生抗金属离子抗性。主细胞产生抗金属离子抗性。由两部分组成：抗性转移因子（抗性转移因子（RTF）抗性决定因子抗性决定因子3）Col质粒：大肠杆菌素质粒质粒：大肠杆菌素质粒与细菌素的产生有关的质粒与细菌素的产生有关的质粒大肠杆菌素由由E.coli某些菌株产生的细菌素，具有某些菌株产生的细菌素，具有通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等方式专一杀通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等方式专一杀死或抑制近缘细菌或同种不同菌株的能力，是由死或抑制近缘细菌或同种不同菌株的能力，是由Col质粒编码的蛋白质。质粒编码的蛋白质。Col质粒有两类：质
15、粒有两类：分子量小（分子量小（9kb，5106），无接合作用，松弛型控制，多），无接合作用，松弛型控制，多拷贝。如拷贝。如ColE1。分子量大（分子量大（94kb，8107），具通过接合而转移的功能，严），具通过接合而转移的功能，严紧型控制，紧型控制，1-2拷贝。如拷贝。如ColIb。TheColE1plasmidcarriesthefollowinggenes:cea：thecolicintoxinimm：immunityproteinkil：lysisproteininc：RNAI-incompatibilitydeterminantRNAII：primerforreplicationro
16、p：proteinthatregulatesprimingandcopynumbermob：proteinsformobilizationduringconjugationcer：maintainsplasmidasmonomersexc：exclusionprotein4)Ti质粒：诱癌质粒、冠瘿质粒质粒：诱癌质粒、冠瘿质粒与致病性有关的质粒与致病性有关的质粒根癌农杆菌（根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）侵染双）侵染双子叶植物的根细胞，释放出子叶植物的根细胞，释放出Ti质粒，通过质粒，通过Ti质粒的质粒的T-DNA与植物核基因组整合，合成正常植物没有的冠瘿与植物
17、核基因组整合，合成正常植物没有的冠瘿碱类，在植物上形成碱类，在植物上形成癌细胞。癌细胞。Ti质粒，环状，质粒，环状，200kb，主要分四部分，主要分四部分：毒性区（毒性区（Vir）接合转移区（接合转移区（con）复制启始区复制启始区T-DNA区区毒性区（Vir）接合转移区（con）复制启始区T-DNA区Ri质粒质粒与再生根形成有关的质粒与再生根形成有关的质粒与与Ti质粒相似，有质粒相似，有Ri质粒转化的根部不形成质粒转化的根部不形成根瘤，仅生出可再生新植株的毛状根。根瘤，仅生出可再生新植株的毛状根。在基因工程中，在基因工程中，Ri质粒作为外源基因的载体。质粒作为外源基因的载体。6）mega质粒
18、：巨大质粒质粒：巨大质粒存在根瘤菌属（存在根瘤菌属（Rhizobium）中）中,质粒上有一系质粒上有一系列于与共生固氮有关的基因，分子量大（列于与共生固氮有关的基因，分子量大（2.0108）。）。7）降解性质粒：代谢性质粒）降解性质粒：代谢性质粒主要存在假单胞菌属（主要存在假单胞菌属（Pseudomonas）细菌）细菌内。内。质粒质粒DNA上含有能降解某些复杂有机物的酶上含有能降解某些复杂有机物的酶的编码基因，细菌携带该类质粒可将复杂化合的编码基因，细菌携带该类质粒可将复杂化合物降解简单形式或能源。物降解简单形式或能源。8）隐秘质粒（）隐秘质粒（Crypticplasmid）隐秘质粒：不赋予寄
19、主任何表型效应的质粒。隐秘质粒：不赋予寄主任何表型效应的质粒。只有通过物理检测才能发现。只有通过物理检测才能发现。第二节第二节微生物的基因突变微生物的基因突变基因突变基因突变简称简称突变突变广义突变：细胞内或病毒颗粒内遗传物质的分广义突变：细胞内或病毒颗粒内遗传物质的分子结构或数量突然发生可遗传的变化。包括基子结构或数量突然发生可遗传的变化。包括基因突变和染色体畸变。因突变和染色体畸变。狭义突变：基因突变（点突变狭义突变：基因突变（点突变）野生型(wildtype)：从自然界中分离到的微从自然界中分离到的微生物菌株，称野生型菌株，简称野生型。生物菌株，称野生型菌株，简称野生型。突变型：野生型菌
20、株经突变后形成的带有新性野生型菌株经突变后形成的带有新性状的菌株，称突变株，或突变体、突变型。状的菌株，称突变株，或突变体、突变型。一、基因突变选择性突变株与非选择性突变株：凡是能用选择性培养基或其他选择性培养条件快凡是能用选择性培养基或其他选择性培养条件快速选择出来的突变株称速选择出来的突变株称选择性突变株，反之称为反之称为非选择性突变株(一一)、微生物发生选择性突变的类型：、微生物发生选择性突变的类型：营养缺陷型（营养缺陷型（auxotroph）如亮氨酸缺陷型菌株表示为如亮氨酸缺陷型菌株表示为Leu-，对应的野生型表示为，对应的野生型表示为Leu+抗性突变型（抗性突变型（resistant
21、mutant）如抗链霉素菌株表示为如抗链霉素菌株表示为strR，对应的敏感型菌株表示为，对应的敏感型菌株表示为strs。条件致死突变型条件致死突变型(conditionallethalmutant)(二二)、微生物发生非选择性突变的类型：、微生物发生非选择性突变的类型：形态突变型（形态突变型（morphologicalmutant）抗原突变型（抗原突变型（antigenicmutant）由于基因突变引起的抗原结构发生突变的变异类型，由于基因突变引起的抗原结构发生突变的变异类型，如细胞壁缺陷、荚膜或鞭毛变异。如细胞壁缺陷、荚膜或鞭毛变异。产量突变型（产量突变型（metabolitequantit
22、ativemutant）通过基因突变获得在有用代谢产物产量高于原始菌通过基因突变获得在有用代谢产物产量高于原始菌株的突变株的变异类型。产量提高一般逐步积累。株的突变株的变异类型。产量提高一般逐步积累。（三）、突变率（三）、突变率每一细胞在每一世代中发生某一性状的突变几率，每一细胞在每一世代中发生某一性状的突变几率，称突变率。称突变率。突变率也表示每单位群体在在繁殖一代时产生突突变率也表示每单位群体在在繁殖一代时产生突变株的数目。变株的数目。如：突变率为如：突变率为10-8表示细胞在表示细胞在108次分裂中会发次分裂中会发生一次突变，或表示生一次突变，或表示108个细胞的群体分裂为个细胞的群体分
23、裂为2108个细胞时可产生一个突变株。个细胞时可产生一个突变株。（四）、微生物基因突变的特点（四）、微生物基因突变的特点自发性：没有人为诱变因素可自发产生自发性：没有人为诱变因素可自发产生稀有性：突变率比较低，范围稀有性：突变率比较低，范围10-610-9独立性：某基因突变率不受别的基因影响独立性：某基因突变率不受别的基因影响。多基多基因同时突变几率极低。因同时突变几率极低。可诱变性：诱变剂可提高突变率可诱变性：诱变剂可提高突变率稳定性：突变后新性状是稳定的、可遗传的。稳定性：突变后新性状是稳定的、可遗传的。规律性：特定性状具有较稳定的突变率的规律。规律性：特定性状具有较稳定的突变率的规律。可
24、逆性：野生型可逆性：野生型突变型突变型正向突变回复突变不对应性：突变的性状与引起突变的原因（环不对应性：突变的性状与引起突变的原因（环境）之间无直接的关系。境）之间无直接的关系。两种观点：两种观点：抗生素、紫外线或高温诱变产生相对应的突变性状抗生素、紫外线或高温诱变产生相对应的突变性状（非自发性）。认为突变是通过生物对某特定环境（非自发性）。认为突变是通过生物对某特定环境(例如化学药物、抗生素和高温等例如化学药物、抗生素和高温等)的适应而产生的，的适应而产生的，这种环境正是突变的诱因，所产生的抗性性状是与这种环境正是突变的诱因，所产生的抗性性状是与该环境因素相对应的，并认为这就是环境因素对生该
25、环境因素相对应的，并认为这就是环境因素对生物体的物体的“驯化驯化”、“驯养驯养”、“蒙导蒙导”或或“定向变异定向变异”。抗生素、紫外线或高温淘汰原有非突变个体（自发抗生素、紫外线或高温淘汰原有非突变个体（自发性）性）。抗性突变是可以自发产生的，即使诱发产生，。抗性突变是可以自发产生的，即使诱发产生，其产生的性状与诱变因素间也是不对应的，即最终其产生的性状与诱变因素间也是不对应的，即最终适应了的化学药物等不良因素并非诱变因素，而仅适应了的化学药物等不良因素并非诱变因素，而仅仅是一种用于筛选的环境而已。仅是一种用于筛选的环境而已。有三个经典实验证明自发突变产生突变株。微生物突变的自发性和不对应性证
26、明微生物突变的自发性和不对应性证明取敏感于噬菌体的E.coli指数期的肉汤培养物，用新鲜培养稀释成浓度为103/mL的细菌悬液，然后在甲、乙两试管各装10mL。接着把甲管中的菌液先分装在50支小试管中(每管0.2 mL)，保温24-36h。微生物突变的自发性和不对应性证明微生物突变的自发性和不对应性证明把各小管的菌液分别倒在50个预先涂满噬菌体T1的平板上，经培养后分别计算各皿上所产生的抗噬菌体的菌落数。微生物突变的自发性和不对应性证明微生物突变的自发性和不对应性证明乙管中的10mL菌不经分装先整管保温2436 h，然后分成50份分别倒在同样涂满T1的平板上，经同样培养后，也分别计算各皿上所产
27、生的抗噬菌体菌落数。微生物突变的自发性和不对应性证明微生物突变的自发性和不对应性证明结果：在来自甲管的50皿中，各皿出现的抗性菌落数相差极大，而来自乙管的则各皿上抗性菌落数基本相同。微生物突变的自发性和不对应性证明微生物突变的自发性和不对应性证明结论：Ecoli抗噬菌体性状的产生，并非由所抗的环境因素(即噬菌体T1)诱导出来的，而是在它接触T1前，在某次细胞分裂过程中自发产生的。微生物突变的自发性和不对应性证明微生物突变的自发性和不对应性证明（五）、基因突变的分子基础（五）、基因突变的分子基础1.诱发突变（诱发突变（inducedmutation）通过人为的方法利用物理、化学、生物因通过人为的
28、方法利用物理、化学、生物因素显著提高基因自发突变频率的手段。素显著提高基因自发突变频率的手段。诱变剂：凡具有诱变效应的任何因素。诱变剂：凡具有诱变效应的任何因素。碱基的置换碱基的置换仅涉及一对碱基被另一对碱基所置换，属仅涉及一对碱基被另一对碱基所置换，属点突变转换(transition)：嘌呤之间置换或嘧啶之间的置嘌呤之间置换或嘧啶之间的置换。换。置换置换颠换(transversion)：嘌呤和嘧啶之间的置换。：嘌呤和嘧啶之间的置换。诱发突变包括：引起置换的诱变剂：引起置换的诱变剂：直接：直接与核酸的碱基发生化学反应的化学直接：直接与核酸的碱基发生化学反应的化学诱变。诱变。如亚硝酸、羟胺、环氧
29、乙酸等如亚硝酸、羟胺、环氧乙酸等间接：通过活细胞的代谢活动掺入到间接：通过活细胞的代谢活动掺入到DNA分分子引起突变。子引起突变。如碱基类似物如碱基类似物8-氮鸟嘌呤、氮鸟嘌呤、5-氨基尿嘧啶等氨基尿嘧啶等移码突变移码突变诱变剂使诱变剂使DNA序列中的一个或少数几个碱基发生增添（插序列中的一个或少数几个碱基发生增添（插入）或缺失，从而使后面的全部遗传密码的阅读框架发生改入）或缺失，从而使后面的全部遗传密码的阅读框架发生改变，引起转录和转译错误的突变。变，引起转录和转译错误的突变。正常：正常：GCGATCCGTAACCTGATGGTTAAC插入：插入：GCTCGATCCGTAACCTGATGGT
30、TAAC缺失：缺失：GCATCCGTAACCTGATGGTTAAC引起移码突变的诱变剂：吖啶类染料如吖啶橙等引起移码突变的诱变剂：吖啶类染料如吖啶橙等染色体畸变（染色体畸变（chromosomalaberration）诱变剂引起诱变剂引起DNA分子的大损伤，导致染色体结分子的大损伤，导致染色体结构上的缺失、重复、插入、易位和倒位等变化构上的缺失、重复、插入、易位和倒位等变化和染色体数目的改变。和染色体数目的改变。诱变剂：诱变剂：理化因子：理化因子：X-ray、烷化基、亚硝酸、秋水仙、烷化基、亚硝酸、秋水仙素。素。生物因子如转座子生物因子如转座子自发突变自发突变 指生物体在无人工干预下自然发生的
31、低频率突变指生物体在无人工干预下自然发生的低频率突变自发突变的原因：自发突变的原因：由背景辐射和环境因素引起，如天然的宇宙射线等。由背景辐射和环境因素引起，如天然的宇宙射线等。由微生物自身有害代谢产物引起，例如过氧化氢等。由微生物自身有害代谢产物引起，例如过氧化氢等。由由DNADNA复复制制过过程程中中碱碱基基配配对对错错误误引引起起。碱碱基基错错配配频频率率为为1010-71010-10-10。（六）、（六）、DNA损伤的修复损伤的修复紫外线对DNA的损伤主要引起相邻嘧啶发生光化学反应形成嘧啶二聚体（主要引起相邻嘧啶发生光化学反应形成嘧啶二聚体（TT、TC、CC）和水合物，造成局部）和水合物
32、，造成局部DNA分子无法配对，从分子无法配对，从而引起微生物的死亡或突变。而引起微生物的死亡或突变。DNA损伤类型很多，微生物对其修复的方法也损伤类型很多，微生物对其修复的方法也各不相同各不相同。光复活作用（光复活作用（photoreactivation）最早是最早是AKelner(1949年年)在在Streptomyces griseus(灰色链霉菌灰色链霉菌)中发现。中发现。光复活作用：把经把经UV照射后的微生物立即暴露于可见光下时，就照射后的微生物立即暴露于可见光下时，就可出现明显降低其死亡率的现象。可出现明显降低其死亡率的现象。修复机理 在黑暗下，在黑暗下，嘧啶二聚体和嘧啶二聚体和光解
33、酶光解酶(光裂合酶光裂合酶)结合，形结合，形成成DNADNA酶复合物，在酶复合物，在300500nm可见光下，酶获得可见光下，酶获得光能激活，使二聚体重新分解成单体，同时，光解酶光能激活，使二聚体重新分解成单体，同时，光解酶与复合物分解，重新执行功能。与复合物分解，重新执行功能。切除修复切除修复(excisionrepair)又称又称暗修复（暗修复（darkrepair）不不依依赖赖可可见见光光，通通过过酶酶切切作作用用去去除除嘧嘧啶啶二二聚聚体体，重重新新合成一段正常合成一段正常DNA链的修复链的修复方式。方式。勇于开始，才能找到成功的路暗修复的机理内切核酸酶在胸腺嘧啶二聚体的5-侧切开一个
34、3-OH和5-P的单链缺口；外切核酸酶从5-P至3-OH方向切除二聚体，并扩大缺口；DNA聚合酶以DNA的另一条链为模板，从原有链上的3-OH端起逐个延长，重新合成一条缺失的DNA链；通过连接酶的作用，把新合成的寡核苷酸的3-OH末端与原链的5-P末端相连接，从而完成了修复作用。优良菌种选育的意义：优良菌种选育的意义：为生产提供了各种类型的突变株突变株，大大提高了菌种产生有利用价值代谢产物的水平，还可以改进产品质量，去除不需要的代谢产物或产生新的代谢产物另外，通过菌种选育可以研究菌种的分子生物学和分子遗传学二、突变与育种二、突变与育种经典育种方法：自然选育、诱变育种较定向的育种方法：杂交育种、
35、原生质体 融合、基因工程优良菌种选育的技术手段：优良菌种选育的技术手段：（一）、自发突变育种（一）、自发突变育种选育选育微生物在自然以微生物在自然以10-6的突变率发生自发突的突变率发生自发突变。变。定向培育定向培育定向培育利利用用微微生生物物的的自自发发突突变变，并并采采用用特特定定的的选选择择条条件件，通通过对微生物群体过对微生物群体不断移植以选育出较优良菌株方法。不断移植以选育出较优良菌株方法。如：卡介苗的培育如：卡介苗的培育（二）（二）、诱变育种诱变育种诱诱变变育育种种是是指指利利用用诱诱变变剂剂处处理理微微生生物物细细胞胞群群，提提高高微微生生物物的的突突变变率率，以以便便采采用用简
36、简便便、快快速速和和高高效效的的筛筛选选方方法法，从从中中挑挑选选出出少少数数符符合合目目的的的的突变株进行育种的方法。突变株进行育种的方法。1 1、诱变育种的基本环节诱变育种的基本环节诱变育种的一般步骤诱变育种的一般步骤出发菌株培养液细胞或孢子悬液诱变处理诱变处理平板分离 初筛 复筛保藏及扩大试验纯化、同步培养离心收集细胞，洗涤，制菌悬液，玻璃珠打散，过滤活菌计数，诱变预备试验存活细胞计数，致死率计算变异率计算2、诱变育种中的原则诱变育种中的原则（1）选择简便有效的诱变剂选择简便有效的诱变剂化学诱变剂化学诱变剂:N-:N-甲基甲基-N-N-硝基硝基-N-N-亚硝基胍亚硝基胍(NTG)(NTG
37、)物理诱变剂物理诱变剂:紫外线为最简便紫外线为最简便生物诱变剂生物诱变剂:溶原性噬菌体溶原性噬菌体 （2）、）、挑选优良的出发菌株挑选优良的出发菌株生产中的自发突变菌株生产中的自发突变菌株具优良性状的菌株，如生长快、营养要求低等具优良性状的菌株，如生长快、营养要求低等已发生过突变的菌株已发生过突变的菌株对诱变剂敏感性高的增变变异株对诱变剂敏感性高的增变变异株（3 3）、处理单细胞或单孢子悬液）、处理单细胞或单孢子悬液容易分散，每个细胞可均匀接触诱变剂容易分散，每个细胞可均匀接触诱变剂防止长出不纯菌落防止长出不纯菌落产生菌落不纯的原因：产生菌落不纯的原因：某些微生物细胞是多核的某些微生物细胞是多
38、核的突变的性状在当代不表达产生表型突变的性状在当代不表达产生表型（4）、）、选用最适的诱变剂量选用最适的诱变剂量突变率随剂量的增加先提高再下降。突变率随剂量的增加先提高再下降。低剂量易发生正变，高剂量易出现负变低剂量易发生正变，高剂量易出现负变多次诱变提高了产量的菌株更容易出现负变。多次诱变提高了产量的菌株更容易出现负变。（5）、充充分分利利用用诱诱变变剂剂复复合合处处理理的的协协同同效效应应复合处理方法复合处理方法同一诱变剂的重复使用同一诱变剂的重复使用两种或多种诱变剂的先后或同时使用两种或多种诱变剂的先后或同时使用（6）、）、利用和创造与产量相关的指利用和创造与产量相关的指标标（7）、）、
39、设计高效筛选方案设计高效筛选方案（8）、）、创造新型筛选方法创造新型筛选方法3、突变株的筛选、突变株的筛选（1）、）、产量突变株的筛选产量突变株的筛选 根据突变株的产物特性来确定具体的筛选方法。根据突变株的产物特性来确定具体的筛选方法。（2）、）、抗药性突变株的筛选抗药性突变株的筛选抗药性基因是一种选择性遗传标记，同时，有些抗抗药性基因是一种选择性遗传标记，同时，有些抗药菌株还是重要的生产菌种。药菌株还是重要的生产菌种。梯度平板法是定向筛选抗药性突变株的有效方法。梯度平板法是定向筛选抗药性突变株的有效方法。（3 3）、营养缺陷型突变株的筛选）、营养缺陷型突变株的筛选几个概念几个概念基本培养基(
40、MM)：仅能满足某微生物的野生型菌株仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需要的最低成分的组合培养基，称基本培养基。生长所需要的最低成分的组合培养基，称基本培养基。不同微生物的基本培养基是很不相同的。不同微生物的基本培养基是很不相同的。完全培养基(CM)(CM)：凡凡可可满满足足一一切切营营养养缺缺陷陷型型菌菌株株营营养养需要的天然或半组合培养基，称完全培养基。需要的天然或半组合培养基，称完全培养基。补充培养基(SM)(SM)：凡凡只只能能满满足足相相应应的的营营养养缺缺陷陷型型突突变变株生长需要的组合或半组合培养基称补充培养基。株生长需要的组合或半组合培养基称补充培养基。野生型(wildtype
41、)：从自然界中分离到的任从自然界中分离到的任何微生物在其发生人为突变前的原始菌株，称野何微生物在其发生人为突变前的原始菌株，称野生型菌株，简称野生型。如生型菌株，简称野生型。如leu+营养缺陷型（auxotroph）：野生型菌株经诱野生型菌株经诱变剂处理后，由于发生了丧失某酶合成能力的突变剂处理后，由于发生了丧失某酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变菌株。如能生长的突变菌株。如leu-原养型（prototroph）：营养缺陷型突变菌株营养缺陷型突变菌株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在经回复突变或重组后产生的菌株
42、，其营养要求在表型上与野生型相同。如表型上与野生型相同。如leu+营养缺陷型的筛选的程序与方法营养缺陷型的筛选的程序与方法诱变剂处理诱变剂处理 淘汰野生型：抗生素法或菌丝过滤法淘汰野生型：抗生素法或菌丝过滤法 抗抗生生素素法法：抗抗生生素素(青青霉霉素素)能能抑抑制制细细菌菌细细胞胞壁壁的的生生物物合合成成，可可杀杀死死能能正正常常生生长长繁繁殖殖的的野野生生型型细细菌菌但但无无法杀死法杀死处于休止状态的营养缺陷型细菌。处于休止状态的营养缺陷型细菌。菌菌丝丝过过滤滤法法：适适用用丝丝状状真真菌菌和和放放线线菌菌。其其原原理理是是在在基基本本培培养养基基中中，野野生生型型菌菌株株的的孢孢子子能能
43、萌萌发发成成菌菌丝丝，而而营营养养缺缺陷陷型型的的孢孢子子则则不不能能。将将诱诱变变剂剂处处理理后后的的孢孢子子放放在在基基本本培培养养基基上上培培养养后后，过过滤滤，重重复复数数遍遍，可可去除野生型菌株。去除野生型菌株。检出缺陷型检出缺陷型通常采用影印平板法通常采用影印平板法用生长谱法鉴定营养缺陷型用生长谱法鉴定营养缺陷型生长谱法：生长谱法：是指在混有供试菌的平板表面点加是指在混有供试菌的平板表面点加微量营养物，观察营养物的周围有否长菌来确定微量营养物，观察营养物的周围有否长菌来确定该供试菌的营养要求的方法。如某一营养物的周该供试菌的营养要求的方法。如某一营养物的周围有生长圈，供试菌就是该营
44、养物的缺陷型突变围有生长圈，供试菌就是该营养物的缺陷型突变株。株。生长谱法鉴定缺陷型生长谱法鉴定缺陷型 诱变育种的整个过程主要是诱变和筛选的不断重复，直到获得比较理想的高产菌株。诱发突变是使用诱变剂促使菌种发生突变，所以诱发所形成的突变与菌种本身的遗传背景、诱变剂种类及其剂量的选择和合理使用方法均有密切关系，这三者是诱变部分的关键所在。第三节第三节基因重组和杂交育种基因重组和杂交育种一、原核生物的基因转移与重组一、原核生物的基因转移与重组原核生物的基因重组的特点为：原核生物的基因重组的特点为：片段性，仅一小段片段性，仅一小段DNA序列参与重组；序列参与重组；单向性，即从供体菌向受体菌单向性，即
45、从供体菌向受体菌(或从供体基因或从供体基因组向受体基因组组向受体基因组)作单方向转移；作单方向转移；转移机制独特而多样，如接合、转化和转导等。转移机制独特而多样，如接合、转化和转导等。、转化、转化(transformation)1.定义定义转化：受体菌直接吸收供体菌的：受体菌直接吸收供体菌的DNA片段而片段而获得后者部分遗传性状的现象，称为转化或转获得后者部分遗传性状的现象，称为转化或转化作用。化作用。转化子：通过转化方式而形成的杂种后代，称：通过转化方式而形成的杂种后代，称转化子转化子。2转化微生物的种类转化微生物的种类原核微生物原核微生物肺炎链球菌肺炎链球菌Streptococcus pn
46、eumoniae嗜血杆菌属嗜血杆菌属Haemophilus芽孢杆菌属芽孢杆菌属Bacillus根瘤菌属根瘤菌属Rhizobium假单胞菌属假单胞菌属Pseudomonas黄单胞菌属黄单胞菌属Xanthomonas真核微生物真核微生物v酿酒酵母酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae()、v粗糙脉孢菌粗糙脉孢菌Neurosporacrassav黑曲霉黑曲霉Aspergillus niger3.感受态感受态(competence)感受态是指受体细胞最易接受外源是指受体细胞最易接受外源DNA片段并片段并能实现转化的一种生理状态。能实现转化的一种生理状态。o两个菌种或菌株间能否发生转化
47、，依赖于亲缘关系两个菌种或菌株间能否发生转化，依赖于亲缘关系,但是凡能发生转化，受体细胞必须处于感受态。但是凡能发生转化，受体细胞必须处于感受态。o不同微生物感受态细胞出现的时期不同：如如SPneumoniae在在指数期后期，指数期后期，Bacillus spBacillus sp.在稳定期在稳定期o不同微生物感受态细胞在群体中占的比例不同感受态细胞在群体中占的比例不同如如枯草芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌：2020左右左右 流感嗜血杆菌：流感嗜血杆菌：100100o不同微生物感受态细胞维持感受态的时间不同感受态细胞维持感受态的时间不同如如枯草芽孢杆菌感受态维持几小时枯草芽孢杆菌感受态维持几小时 流感
48、嗜血杆菌仅维持数分钟。流感嗜血杆菌仅维持数分钟。4.感受态因子感受态因子 细菌生长到一定时期，分泌出特异性蛋白来细菌生长到一定时期，分泌出特异性蛋白来调节细胞处于感受态的蛋白称感受态因子调节细胞处于感受态的蛋白称感受态因子。主要成分：*膜相关膜相关DNA结合蛋白结合蛋白*细胞壁自溶素细胞壁自溶素*核酸酶核酸酶5.转化因子转化因子 转化因子的本质是离体的转化因子的本质是离体的DNA片段。片段。转化因子的类型dsDNAdsDNAssDNAssDNA质粒质粒DNADNA在不同的微生物中，转化因子的形式不同：在不同的微生物中，转化因子的形式不同：GG细菌细菌(HaemophilusHaemophilu
49、s)：dsDNAdsDNAG G细菌细菌(StreptococcusStreptococcus)：ssDNAssDNA6.转化过程供体菌供体菌strR dsDNA与感与感受态受体菌受态受体菌strS细胞表面细胞表面的膜连的膜连DNA结合蛋白相结合蛋白相结合，其中一条进入细结合，其中一条进入细胞；胞；供体菌的供体菌的ssDNA片段被片段被细胞内的特异蛋白细胞内的特异蛋白RecA结合后，与受体菌核染结合后，与受体菌核染色体杂合色体杂合DNA区段；区段；杂合杂合DNA区随受体菌染区随受体菌染色体组进行复制；色体组进行复制；细胞分裂后，形成一个细胞分裂后，形成一个转化子转化子(strR)和一个具原和一
50、个具原来基因型来基因型(strS)的子代。的子代。Bacteriumundergoingtransformation影响转化率的因素：受体细胞的感受态：受体细胞的感受态：决定转化因子是否可进入受体细胞决定转化因子是否可进入受体细胞受体细胞的限制性内切酶系统和核酸酶：受体细胞的限制性内切酶系统和核酸酶：决定转化因子在整合前是否被分解决定转化因子在整合前是否被分解受体和供体染色体的同源性：受体和供体染色体的同源性：决定转化因子是否整合。决定转化因子是否整合。二、转导二、转导(transduction)1.定义定义转导：通通过过缺缺陷陷噬噬菌菌体体为为媒媒介介，把把供供体体细细胞胞的的小小片片段段D