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1、病毒和亚病毒Viruses and Subviruses微生物学第4 章 类病毒 Viroid拟病毒 Virusoid朊病毒 Prion至少含核酸和蛋白质二种组分只含蛋白质只含侵染性RNA 组分只含不具侵染性RNA 组分真病毒 Euviruses亚病毒 Subviruses非细胞生物 non-cellular organisms 病毒是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的超显微“非细胞生物”，其本质是一种只含有DNA 或RNA 的遗传因子，它们能以感染态和非感染态两种状态存在。Chapter 4 1 病毒（Viruses）一、病毒的发现（The discovery of viruses）18
2、86年，A.Mayer：烟草花叶病；1892年，D.Ivanovsky：烟草花叶病病原体能通过细菌滤器；1898年，M W Beijerinck：烟草花叶病病原体能通过细菌滤器；可被乙醇沉淀而不失去其感染性；能在琼脂凝胶中扩散；不能用培养细菌的方法培养；1900年前后，口蹄疫等多种动植物疾病病原体的滤过性特性被证明；1915，F W Twort；1917年，F Herelle：发现细菌病毒；1935年，W M Stanley：提纯并结晶烟草花叶病毒；Bawden 等：证明烟草花叶病毒的本质为核蛋白；1940年，Kansche，观察到烟草花叶病毒颗粒；不具有细胞结构，具有一般化学大分子的特征；一
3、种病毒只含一种核酸，DNA 或者RNA；无产能、蛋白质和核酸合成酶系，必须依赖宿主细胞进行蛋白质和核酸合成，再装配形成子代；个体微小，在电子显微镜下才能观察；对大多数抗生素不敏感，对干扰素敏感。二、病毒的主要特点（General features of viruses）离体条件下，以有感染性的无生命的生物大分子形式存在；三、病毒的类型（Types of viruses）1、根据核酸类型（based on nucleic acid）DNA 病毒DNA virusesRNA 病毒RNA viruses双链DNA 和单链DNA 病毒单链RNA 和双链RNA 病毒2、根据宿主（based on hos
4、t）噬菌体（phage）植物病毒（plant viruses）动物病毒（animal viruses）细菌细胞（bacteria cell）植物细胞（plant cell）动物细胞（animal cell）个体小，直径一般在100nm 左右；四、病毒的形态结构和成分1、病毒的大小和形状（size and shape）最大的：动物痘病毒（poxviruses）；D200nm；最长的：丝状病毒（Filoviridae）；L 790-14,000nm；最小的：植物联体病毒（Geminiviruses）；D 18-20nm 病毒的形状大致可分为：球状、杆状和复杂形状3种。病毒的形态（Virus sha
5、pes）把病毒个体称为病毒粒子、病毒颗粒或毒粒，指成熟的、完整的、有感染性的单个病毒。一团能够自主复制的遗传物质保护遗传物质免遭环境破坏，并作为将遗传物质从一个宿主细胞传递给另一个宿主细胞的载体。蛋白质外壳 包膜2、毒粒的结构（structure of virus particle）衣壳 capsid核衣壳nucleocapsid核心 core包膜envelop毒粒virus particle核酸 nucleic acid衣壳粒 capsomere（1）衣壳（capsid）衣壳结构类型螺旋对称壳体二十面体对称壳体双对称结构 包围着病毒核酸的蛋白质外壳，由蛋白质亚基(衣壳粒，capsomere)
6、按对称的形式、有规律地排列而成。螺旋对称壳体：亚基有规律地沿着中心轴（核酸）呈螺旋排列，进而形成高度有序、对称的稳定结构。螺旋对称壳体helical symmetry二十面体对称壳体：蛋白质亚基围绕具立方对称的正多面体的角或边排列，进而形成一个封闭的蛋白质的鞘。腺病毒 二十面体对称壳体icosahedral symmetry 有尾噬菌体（tailed phage）的壳体由头部和尾部组成。包装有病毒核酸的头部通常呈二十面体对称，尾部呈螺旋对称。双对称结构Bisymmetry 仅由核衣壳构成的病毒称作裸露病毒（naked virus）。有些病毒核衣壳包裹着的一层脂蛋白膜，它是病毒以出芽方式成熟时，
7、由细胞膜衍生而来的，有维系毒粒结构，保护病毒核壳的作用。病毒的包膜糖蛋白具有多种生物学活性，是启动病毒感染所必需的。有包膜的病毒（enveloped virus）（2）包膜（envelop）裸露的二十面体毒粒；裸露的螺旋毒粒；有包膜的二十面体毒粒；有包膜的螺旋毒粒；不同病毒的毒粒结构复杂程度有很大的区别；有些病毒，如有尾噬菌体、痘病毒等结构更为复杂，不包括在这些结构类型之内。（3）毒粒的结构类型（types of virus particle）有包膜的二十面体毒粒裸露的二十面体毒粒裸露的螺旋毒粒有包膜的螺旋毒粒complex viruses痘苗病毒（vaccinia virus）在病毒中体积最
8、大，在光学显微镜下勉强可见。有尾噬菌体毒粒virus particle碳水化合物（carbohydrate）病毒颗粒在化学上表现为核蛋白3、毒粒的化学组成（chemical composition）核酸（nucleic acid）蛋白质（protein）脂类（lipid）基本化学组成 核酸是病毒的遗传物质；一种病毒的毒粒只含有一种核酸：DNA 或RNA；核酸存在的状态可以是双链或单链、线状或环状。病毒核酸单链DNA（ss DNA）：线状或环状双链DNA（ds DNA）：线状或环状单链RNA（ss RNA）：线状双链RNA（ds RNA）：线状（1）病毒的核酸（nucleic acid of v
9、irus）（2）病毒的蛋白质（protein of virus）病毒蛋白质结构蛋白非结构蛋白 病毒基因组编码的，在病毒复制过程中产生并具有一定功能，但并不结合于毒粒中的蛋白质。构成一个形态成熟的有感染性的病毒颗粒所必需的蛋白质。壳体蛋白、包膜蛋白、存在于毒粒中的酶。病毒粒子无法用光学显微镜观察，但当它们大量聚集并使宿主细胞发生病变时，就形成了具有一定形态、构造并能用光镜甚至肉眼观察和识别的特殊群体，如包涵体（inclusion body）、噬菌斑（plaque）、空斑（plaque）、枯斑（lesion）。4、病毒的群体形态五、病毒的繁殖（Multiplication）病毒感染敏感宿主细胞后，
10、病毒核酸进入细胞，通过其复制与表达产生子代病毒基因组和新的蛋白质，然后由这些新合成的病毒组分装配成子代毒粒，并以一定方式释放到细胞外。病毒的这种特殊繁殖方式称做复制（replication）。噬菌体的繁殖一般分为5个阶段：吸附；侵入；增殖；装配；释放；1、烈性噬菌体的增殖周期（productive cycle）凡是能在短时间内连续完成以上5个阶段而实现其繁殖的噬菌体，称为烈性噬菌体（virulent phage），反之称为温和噬菌体（temperate phage）。烈性噬菌体的繁殖过程也叫裂解性周期（lytic cycle）。（1）吸附（adsorption，attachment）毒粒敏感细
11、胞随机碰撞而接触无特异性，可逆病毒表面蛋白与细胞受体结合特异性，不可逆（2）侵入（penetration，injection）有尾噬菌体以注射方式使噬菌体核酸侵入细胞：l 尾丝收缩；l 基板使尾鞘蛋白亚基移位、收缩；l 尾管插入细胞并释放溶菌酶；l 头部的核酸通过尾管进入细胞。（3）增殖（replication）包括核酸和蛋白质的生物合成：噬菌体以核酸中的遗传信息向宿主细胞发出指令并提供“蓝图”，使宿主细胞的代谢系统按严密的时序性转向合成噬菌体的组分。T4 噬菌体的时序性生物合成（4）装配（maturity）新合成的毒粒结构组分组装成完整的病毒颗粒，称做病毒的装配，亦称成熟。（5）释放（rel
12、ease）当宿主细胞内的大量子代噬菌体成熟后，由于脂肪酶和溶菌酶等的作用，细胞裂解，子代噬菌体释放。2、噬菌体的效价（titer）效价：每毫升试样中所含有的具有侵染性的噬菌体粒子数，又称噬菌斑形成单位数（plaque-forming unit，pfu）。测定效价常用双层平板法（two layer plating method）。3、一步生长曲线（one step growth curve）定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线称为一步生长曲线。一步生长曲线反映了每种噬菌体的3个最重要的特征参数：潜伏期（latent phase）、裂解期（rise phase）和裂解量（burst size）。自
13、病毒在受染细胞内消失到细胞内出现新的感染性病毒的时间为为隐蔽期（eclipse phase）。潜伏后期，胞内出现了感染性病毒，为胞内积累期（intracellular accumulation phase）。（1）潜伏期（latent phase）（2）裂解期（rise phase）病毒粒子只有个体装配而没有个体生长，再加上宿主细胞裂解的突发性，理论上裂解期是瞬时出现的，但事实上由于群体细胞中各个细胞的裂解并不同步，所以出现了较长的裂解期。（3）平稳期（plateau）指感染后宿主细胞已全部裂解，溶液中噬菌体效价达到最高点的时期。平均每一宿主细胞裂解后产生的子代噬菌体数称为裂解量（burst
14、size）。温和噬菌体（temperate phage）侵入相应宿主细胞后，基因组整合到宿主基因组上，并随宿主的复制而进行同步复制，因此，这种温和噬菌体的侵入并不引起宿主细胞裂解，称为溶源性或溶源现象。4、温和噬菌体的溶源性反应（lysogeny of temperate phage）温和噬菌体的生活史 二元培养物法六、病毒的培养和纯化（Culturing and purification）1、培养（culturing）噬菌体细菌培养物培养液营养琼脂平板细菌培养液变清亮细菌平板成为残迹平板出现病变出现痘疱细胞聚集、出现空斑动物病毒实验动物鸡胚多种细胞培养植物病毒敏感植物叶片 产生坏死斑，或称枯
15、斑（1）标准（standards）纯化的病毒制备物应保持其感染性病毒是有感染性的生物体病毒具有化学大分子的属性纯化的病毒制备物的理化性质应具有均一性 2、病毒纯化（purification）蛋白质提纯方法盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、凝胶层析、离子交换等（2）方法（methods）主要化学组成为蛋白质具有一定的大小、形状和密度差速离心梯度离心Chapter 4 2 亚病毒（Subvirus）凡在核酸和蛋白质两种成分中，只含其中之一的分子病原体，称为亚病毒，包括类病毒（Viroid）、拟病毒（Virusoid）和朊病毒（Prion）3类。一、类病毒（Viroid）类病毒是当今所知道的最小、只含
16、RNA 一种成分及专性细胞内寄生的分子生物。1971年首次报道，引起马铃薯纺锤形块茎病。二、拟病毒（Virusoid）拟病毒又称类类病毒或病毒的病毒，它是一些必须依赖辅助病毒才能复制的小分子单链RNA 片段，它被包装在辅助病毒的壳体中，本身对于辅助病毒的复制不是必需的，而且它与辅助病毒的基因组无明显的同源性。三、朊病毒（Prion）朊病毒又称“普列昂”或蛋白质侵染因子。据目前所知，朊病毒是一类能侵染动物并在宿主细胞内复制的小分子无免疫性疏水蛋白质。朊病毒在电子显微镜下呈杆状颗粒，直径25nm，长100200nm。杆状颗 粒不单独存在，总是呈丛状排列，每丛大小和形状不一，多时可含100个。Cha
17、pter 4 3 病毒与实践n 噬菌体与发酵工业n 昆虫病毒与生物防治n 病毒与基因工程u 发酵液受噬菌体污染的实例 丙酮丁醇连续发酵异常时，发酵停止，不产生气泡，醪液上层澄清，呈暗黑色，出现睡眠症。正常发酵12-18小时，丙酮产量可达200mg/L，异常发酵时达到相同水平则需36-42 小时，丁醇量也偏低，醪液的蒸馏效率低于正常的10-20%。红霉素发酵液污染噬菌体后，往往在数小时至十几小时突然出现发酵液变稀，氨态氮上升，pH 值升高，菌丝自溶，细胞破碎，噬菌体数可达1010pfu/ml 以上。噬菌体应用的举例u 用于鉴定细菌的分型；u 分子生物学领域的重要实验工 具和最理想的材料；u 细菌
18、的感染治疗：用噬菌体的混合制剂局部外用或口服治疗因耐抗生素等而久治不愈的患者。如术后绿脓杆菌感染、菌痢患者大肠杆菌感染以及呼吸道的金黄色葡萄球菌感染。噬菌体载体 病毒粒子为球状正二十面体，在宿主细胞质内增殖，具蛋白质包涵体，核酸为分段双链RNA。多角体一般为四边形、六边形等，大小大致在0.510m 范围。感染质型多角体病毒的昆虫死亡周期较缓慢，一般为318天乃至更长。但病虫患病期间，病毒不断随粪便排出，感染其它健康虫，感病幼虫繁殖力下降，可经卵传递给下一代，在害虫种群中形成病毒流行病，从而有效的控制害虫的数量。质型多角体病毒（Cytoplasmic polyhedrosis virus,CPV）本章小结v 病毒可分为真病毒和亚病毒两大类；真病毒的本质是含有DNA 或RNA 的遗传因子，能以感染态和非感染态两种状态存在；v 病毒粒的主要成分是核酸和蛋白质；v 病毒的繁殖过程可分为吸附、侵入、增殖、装配和释放5个阶段；v 根据繁殖特征不同，噬菌体可分为烈性噬菌体和温和噬菌体，定量描述烈性噬菌体增殖规律的曲线称为一步生长曲线。v 亚病毒有3类：拟病毒、类病毒和朊病毒。