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1、Life science unlimitedLife science unlimited实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术与应用技术与应用Life science unlimited提纲提纲 PCR PCR简介简介 荧光定量荧光定量PCRPCR技术原理技术原理 荧光化学物质简介荧光化学物质简介定量方法定量方法实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术简介：技术简介：Life science unlimitedPCR概念什么是什么是PCRPCR？Polymerase Chain Reaction(Polymerase Chain Reaction(PCR)PCR)聚合酶链反应是在体聚合酶链反
2、应是在体外选择性的扩增特定外选择性的扩增特定DNADNA片段的方法。片段的方法。Life science unlimitedClassic PCRLife science unlimitedLife science unlimitedPCR PCR 循环循环第一步第一步 加热变性、双链打开加热变性、双链打开第二步第二步退火、引物与单链结合退火、引物与单链结合第三步第三步 -引物延伸引物延伸变为两个双链变为两个双链DNADNALife science unlimitedLife science unlimited常规常规PCRPCR常规常规PCRPCR技术：技术：PCR后借助电泳对扩增反应的后借
3、助电泳对扩增反应的终产物终产物进行定量及进行定量及定性定性分析分析S1 S2 MPowercyclerLife science unlimitedLife science unlimited定量定量PCRPCR定量定量PCRPCR技术：技术：利用利用荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测PCRPCR扩增反应中扩增反应中每一每一个循环扩增产物量的变化个循环扩增产物量的变化，通过，通过CtCt值值和标准曲线实和标准曲线实现对现对起始模板起始模板的的定量分析定量分析 Qtower2.2Life science unlimitedPCRPCR反应混合物反应混合物Mg2+Mn2+dCTPdGTPd
4、UTPdATPTaq DNA多聚酶多聚酶引物引物模板模板DNA或或缓冲液缓冲液荧光物质荧光物质Life science unlimitedLife science unlimited SYBR Green 1 TaqMan荧光化学荧光化学Life science unlimitedLife science unlimitedSYBR Green I SYBR Green I 工作原理工作原理l SYBR Green 1SYBR Green 1 结合到双链结合到双链DNADNA的小沟部位的小沟部位l SYBR Green 1SYBR Green 1染料结合状态时荧光强度是非染料结合状态时荧光强度
5、是非结合状态的结合状态的800-1000800-1000倍倍GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAALife science unlimitedSYBR Green ILife science unlimitedLife science unlimitedSYBR Green ILife science unlimited与传统与传统PCRPCR的比较的比较实现了初始模板的绝对定量实现了初始模板的绝对定量检测灵敏度高检测灵敏度高可以检测到低拷贝的目的基因可以检测到低拷贝的目的基因可以区分微小的拷贝数差异可以区分微小的拷贝数差异可以对初始模板含量差异较大的样品同时
6、定量可以对初始模板含量差异较大的样品同时定量省时省力省时省力检测设计灵活检测设计灵活Life science unlimitedMelt Curve AnalysisLife science unlimitedMelt Curve AnalysisLife science unlimitedSYBR Green I SYBR Green I 优点优点l 使用方便使用方便 -不必设计复杂的不必设计复杂的荧光探针荧光探针 l 没有序列特异性没有序列特异性 -可以用于不同的模板可以用于不同的模板 l 便宜便宜 l 灵敏灵敏Life science unlimitedLife science unli
7、mitedTaqManTaqMan探针探针荧光素荧光素淬灭剂淬灭剂TaqMan水解型杂交探针水解型杂交探针Life science unlimitedTaqManTaqManl 目标特异性探针目标特异性探针l 55为荧光素，为荧光素，3 3为淬灭剂为淬灭剂5 荧光素3淬灭剂与目标序列互补与目标序列互补Life science unlimitedTAQMAN TAQMAN ProbesProbesLife science unlimitedLife science unlimitedLife science unlimitedTaqManTaqMan缺点缺点 价格较高价格较高 只适合于一个特定的
8、目标只适合于一个特定的目标 不能进行融解曲线分析不能进行融解曲线分析 背景高背景高Life science unlimited兼容化学试剂总结兼容化学试剂总结结合于双链结合于双链DNA的小沟的小沟中中发夹型杂交探发夹型杂交探针针水解型杂交探水解型杂交探针（针（5-3外切）外切）延伸延伸复性复性任何任何步骤步骤定量和检测目标基因定量和检测目标基因融解曲线分析融解曲线分析SNP分析分析定量和检测目标基因定量和检测目标基因SNP分析分析定量和检测目标基因定量和检测目标基因信号检测信号检测工作原理工作原理有否淬灭剂有否淬灭剂化学试剂化学试剂否否有有有有主要应用范围主要应用范围Life science
9、unlimited荧光曲线 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，得到一条荧光扩增曲线图Life science unlimited定量原理 如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析 引入两个概念：荧光阈值、Ct值Life science unlimited定量原理定量原理荧光阈值荧光阈值在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准标准(即即PCRPCR扩增产物量的标准扩增产物量的标准)阈值线阈值线Life science unlimited定量原理Ct值的概念CtCt
10、值的定义是值的定义是PCRPCR扩增过程中，扩增产物扩增过程中，扩增产物(荧光荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数C(t)值值C(t)值值18.12+/0.04-阈值线阈值线Life science unlimited提纲提纲 PCR PCR简介简介 荧光定量荧光定量PCRPCR技术原理技术原理 荧光化学物质简介荧光化学物质简介定量方法定量方法实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术简介：技术简介：Life science unlimited 绝对定量 确定初始模板的准确含量 需要标准曲线 相对定量 确定样品间初始模板的含量倍数差异 相对标准曲线 不使用
11、标准曲线，利用Ct值计算 Ct方法 Ct方法（看家基因）Pfaffl方法（考虑扩增效率）Vandesompele方法（多看家基因）14500 copies定量方法定量方法 Life science unlimited借助标准曲线由未知样品的借助标准曲线由未知样品的C(t)C(t)值反推出其初始量值反推出其初始量得到未知样品初始量绝对值得到未知样品初始量绝对值unknown104103Unknown contains 3108 copies绝对定量绝对定量Life science unlimited CT 法相对定量 无均一化处理 均一化依赖于加样的一致性相对定量相对定量CT Sample1 C
12、t1(25)Sample2 Ct2(22)CT=Ct1-Ct2 =25-22=3基因表达量Sample1/Sample2=2 CT=2-3=1/8Life science unlimited相对定量CTCT法相对定量法相对定量 考虑到了加样误差考虑到了加样误差 通常使用看家基因来完成均一化处理通常使用看家基因来完成均一化处理Sample1 Ct1(25)Sample2 Ct2(22)内参基因 actin Ct 01 20 Ct02 21CT1=Ct1-Ct01=25-20=5 CT2=Ct2-Ct02=22-21=1CT=CT1-CT2=5-1=4基因表达量Sample1/sample2=2-
13、CT=2-4=1/16Life science unlimitedSimpleComplex 2CT 假定目的基因与看家基因的 扩增效率都是100%只有一个看家基因 Pfaffl Modification 考虑到扩增效率的影响 只有一个看家基因 Vandesompele Method 考虑到扩增效率的影响 有多个看家基因相对定量相对定量Life science unlimited 利用相对标准曲线定量，定量结果相除得到倍数差别 同时建立两条标准曲线 一条目的基因的标准曲线 至少再做一条看家基因的标准曲线 借助标准曲线校准扩增效率的影响 使用标准曲线法进行相对定量分析使用标准曲线法进行相对定量分
14、析相对定量相对定量标准曲线法标准曲线法 Life science unlimited 进行可靠的定量实验需要对引物对进行优化设计进行可靠的定量实验需要对引物对进行优化设计 用于优化扩增产物产量和特异性的参数用于优化扩增产物产量和特异性的参数-引物设计引物设计 -扩增片段选择扩增片段选择-试剂的浓度试剂的浓度-循环条件循环条件l 变性温度和退火温度变性温度和退火温度PCRPCR体系优化体系优化Life science unlimited利用动态温度梯度功能一次实现退火温度的优化利用动态温度梯度功能一次实现退火温度的优化退火温度的优化退火温度的优化Life science unlimited45o
15、C55oC65oC溶解曲线溶解曲线扩增曲线扩增曲线1.95oC for 15 min2.94oC for 10 sec3.Gradient from 45oC to 65oC for 15 sec4.72oC for 30 sec5.83oC for 1 sec6.Plate Read7.Go to line 2 39 more times8.Melting curve from 65oC to 95oC,readevery 0.2oC,hold 1 sec.退火温度的优化退火温度的优化Life science unlimited实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR应用应用定量：定量：l DN
16、ADNA定量定量l RNARNA定量定量定性：定性：l SNPSNP分析分析l 基因型分析基因型分析l RNARNA变异分析变异分析l 融解曲线分析融解曲线分析 Life science unlimited定量PCR应用I-实时定量 病原体定量检测病原体定量检测 转基因拷贝数的检测转基因拷贝数的检测DNADNA定量定量拷贝数研究（替代拷贝数研究（替代Southern BlotSouthern Blot）RNARNA定量定量基因表达差异（替代基因表达差异（替代Northern Blot)Northern Blot)单个或多个基因地表达谱分析单个或多个基因地表达谱分析 不同组织、器官不同组织、器官
17、 不同时期不同时期 不同处理不同处理Life science unlimited定量PCR应用II：终点读板 基因突变分析基因突变分析单基因遗传病诊断，如血友病、地贫单基因遗传病诊断，如血友病、地贫 SNPSNP扫描扫描疾病相关基因鉴定，如牛皮癣、哮喘相关基因疾病相关基因鉴定，如牛皮癣、哮喘相关基因SNPSNP的的鉴定鉴定SNPSNP检测与临床表现的相关性，如抗高血压药物疗效检测与临床表现的相关性，如抗高血压药物疗效的个体差异的个体差异药物副反应的预防，如麻醉意外药物副反应的预防，如麻醉意外 物种鉴定、菌株鉴定物种鉴定、菌株鉴定各种病毒，细菌，病毒各种病毒，细菌，病毒病原体病原体检测，如炭疽菌，检测，如炭疽菌，E coli.O157E coli.O157Life science unlimited感谢各位光临！感谢各位光临！