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1、实时荧光定量PCR技术 常规PCR与实时荧光定量PCR常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析实时荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析荧光定量PCR常用的三个概念 扩增曲线 荧光阈值 CT值Cycle（循环数）Rn（荧光强度）BaselineLgliner phase平台期荧光基团荧光检测元件扩增曲线Cycle（循环数）（循环数）Rn（荧光强度）（荧光强度）BaselineLgliner phase1 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）1 荧光阈值的缺省设置
2、是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍1 手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段1 真正的信号:荧光信号超过阈值Threshold荧光阈值平台期平台期Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数Cycle（循环数）（循环数）Rn（荧光强度）（荧光强度）Ct value Ct值Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值极具重现性Ct值的数学原理理想的PCR反应：Xn=X02n非理想的PCR反应：Xn=X0(1+Ex)n方程式两边同时取对数得:log Xn=log X0(1+Ex)n整理方程式得:lo
3、g X0=(-log(1+Ex)n+log Xn将C(t)和达到C(t)值时终产物的量Xc(t)带入上式得：log X0=(-log(1+Ex)C(t)+log Xc(t)初始浓度的对数与循环数呈线性关系n：扩增反应的循环次数Xn：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率数据分析等方面的操作标准和规范都做了详尽的阐述。BioerLinegene series荧光定量PCR-NTC实时荧光定量PCR的分类分子信标结果与双标准曲线法相近大多数荧光定量PCR实验的CT值在18-30之间。荧光定量PCR参数解析-CT值realmastermix-引物和扩增产物二级结构的预测乙肝病人血液中HB
4、V的绝对定量1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii已知在50%的乳腺肿瘤样本中,ERBB2表达异常,因此可以作为一个检测标准样品扩增：正常vs肿瘤设计合适引物，防止非特异性扩增！相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；方 法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测ERBB2 copies/GAPDH copies对引物特异性要求较高Ct Method:使用内参基因定量所研究样品和参照样品目的基因，-扩增长度50-150 bp(max 400)Cycle numberCk 104Ck 102SampleLg of DNA concentration0 模板DNA
5、量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct值越小。0 Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。Ct值与模板起始量的关系qPCR 常用实验方法p 简单p 成本较低p 适用于多重PCRp 特异性较好p可进行SNP检测p特异性非常好ABCSYBR Green I 染料法原理 SYBR Green I 是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料SYBR Green ISYBR Green ISYBR Green ISYBR Green I热热热热 变变变变 性性性性引物退火引物退火引物退火引物退火延伸反应延伸反应延伸反应延伸反应SYBR Green I 染料法作用机理问题点：问题点：
6、SYBR Green I与双链与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如进行结合后散发荧光，因此如 果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将 同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。SYBR Green I染料法问题点与关键点关键点：关键点：设计合适引物，防止非特异性扩增！设计合适引物，防止非特异性扩增！将温度与荧光强度的变化求导将温度与荧光强度的变化求导 (-dI/dT)(-dI/dT)原始图谱原始图谱对数图谱对数图谱SYBR Green I 染料法融解曲线融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准
7、确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确SYBR Green I染料法融解曲线%使用方便，不必设计复杂 探针%具有价格优势优 点%无模板特异性%对引物特异性要求较高%不能进行多重定量%灵敏度相对较低缺 点SYBR Green I 染料法优缺点Taqman探针法原理+5端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等+3端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)+探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光+Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针Taqman探针法工作机理热变性热变性热变性热变性引物和探针与模板退火引物和探针与模板退
8、火引物和探针与模板退火引物和探针与模板退火延伸反应延伸反应延伸反应延伸反应探针探针探针探针报告基团报告基团报告基团报告基团淬灭基团淬灭基团淬灭基团淬灭基团探针探针探针探针DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶引物引物引物引物1、引物、探针的设计：、引物、探针的设计：探针Tm为68-70，30 bp,5不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段80CT18-30 cyclesR20.95Slope(-3.58)-(-3.10)Efficiency90%-110%NTCCT(NTC)=0CT(NTC)CT(样品)5NRCCT(NTC)=0CT(NTC)CT(样品)5MIQE
9、 qPCR国际标准1.提出发表文章时所要求的最低限度的必要信息标准。2.对QPCR的术语；概念；研究与临床应用；样本的采集、处理和制备；核酸的质量控制；反转录；QPCR过程；数据分析等方面的操作标准和规范都做了详尽的阐述。CT值是判断实验成功与否的重要参考双标准曲线法：对每个样品的内参基因和目的基因都做绝对定量，求出每个样品中内参基因和目的基因的绝对数量，然后根据相对定量的基本公式来求出目的基因的差异表达。-Tm(58-600 C)SYBR Green I 染料法优缺点-Tm的计算重复反应孔 建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。样品扩增：正常vs肿瘤-引物和双标记水解探针的设
10、计Healthy RNACT值是判断实验成功与否的重要参考果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将一个或一个以上的未知样本相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；-Tm(58-600 C)2492/130800=0.Real-Time PCR引物序列待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量61014BioerLinegene series大多数荧光定量PCR实验的CT值在18-30之间。设计TaqMan探针并标记探针；荧光定量PCR参数解析-CT值Export Department Export Management Export Department Ex
11、port ManExport Department Export Management Export Department Export Management EExport Department Export Management Export Department Export Management Export Department Export Management Export Department Export Management Export Department Export Management Export Department Export Management ExpReportThank you for your attention!