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1、2/23/20231实时荧光定量PCR技术暨南大学医学院中心实验室廖继东2/23/20232主要内容实时荧光定量实时荧光定量PCR的基本原理的基本原理Chromo4介绍介绍实时荧光定量实时荧光定量PCR实验程序的建立实验程序的建立实时荧光定量实时荧光定量PCR的应用的应用2/23/20233主要内容实时荧光定量实时荧光定量PCR的基本原理的基本原理Chromo4介绍介绍实时荧光定量实时荧光定量PCR实验程序的建立实验程序的建立实时荧光定量实时荧光定量PCR的应用的应用2/23/20234PCRPCR技术简介技术简介PCR:polymerasechainreaction多聚酶链式反应英文词首字母
2、的缩写，是一种体外选择性扩增DNA或RNA片段的方法。其基本原理是依据DNA双螺旋结构及其半保留复制特性，用人工合成的小片段2/23/20235PCRPCR技术简介技术简介寡核甘酸引物与经高温（变性温度）变性形成的单链DNA模板，在特定温度（复性温度）下产生序列特异性互补结合，在适当温度（延伸温度）条件下，由DNA多聚酶催化使已经结合的寡核甘酸引物沿模板序列延伸产生与模板序列2/23/20236常规常规PCRPCR完全互补的新的DNA单链。PCR技术自1985年由美国PE公司的Mullis等发明并推出市场应用以来，实现了小片段DNA的体外快速扩增，为各种因DNA序列的变异、缺失以及由此导致的遗
3、传缺陷和相关疾病的研究和临床诊断提供了强有2/23/20237常规常规PCRPCR力的手段，为各种病原体包括微生物、细菌、病毒等所致疾病的快速确诊提供了技术条件，极大地促进和加速了整个生命科学研究的进程。2/23/20238常规常规PCRPCR的定量的定量在PCR反应中，理论上扩增产物的量与起始样本中模板的含量成正比。但受多种因素的影响，其精确定量模板的可信度明显不足。为克服上述不足，人们设计出包括内标、竞争、酶联、尿苷酶降解等多种定量方法。2/23/20239内标法内标法在不同的PCR反应管中加入已知量的内标模板和引物，内标模板可由基因工程合成或采用已知量的标准品。在样品模板扩增的同时，内标
4、模板也被扩增。二者的扩增产物可通过电泳或其它方法分离，以内标为对照进行样本模板定量。2/23/202310竞争法竞争法将含有一个新内切酶位点的外源性模板加入PCR反应管中，待测样品模板与外源性模板用同一对引物进行扩增，经内切酶消化竞争性模板的产物成为两个片段，通过电泳等分离检测，根据已知模板的量推测未知模板的起始拷贝数。2/23/202311酶联免疫酶联免疫利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固定在固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素抗体辣根过氧化物酶结合物，检测酶底物显色情况，通过内标标准曲线实现定量检测的目的。2/23/202312参照物在参照物在PCRPCR定量中的作用定
5、量中的作用1.作为扩增系统的阳性对照；2.作为未知样本定量的参比标准；3.通过竞争性作为矫正扩增系统内部的扩增效率，使其具有可比性。4.（参照物按其性质不同可分为内标和外标）2/23/202313内标基因的选择原则：内标基因在不同组织或者处理前后表原则：内标基因在不同组织或者处理前后表达量不变达量不变内标基因的选择内标基因的选择 一般选取一般选取GAPDHGAPDH、-actinactin等看家基因等看家基因(GAPDH:Glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase,3磷酸甘油醛脱氢酶)2/23/202314传统传统PCRPCR定量方法的特点和不足定量方法的特点
6、和不足1.定量的准确度：传统PCR定量方法的共同特点是针对PCR扩增的最终产物进行分析。因受酶活性、扩增效率、尤其是平台效应等诸多因素的影响，检测重现性极差，无法直接从终产物量推算出起始模板的精确含量。2/23/202315传统传统PCRPCR定量方法的特点和不足定量方法的特点和不足2.假阳性污染：传统PCR定量方法均依赖于各种不同类型的PCR后处理过程，这些过程极易使数量巨大的PCR扩增产物飞散到实验室的环境中，造成待检样本的污染，导致假阳性结果的上升。2/23/202316实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR在PCR反应体系中引入DNA结合荧光染料或荧光探针，对每一循环扩增反应产物DNA片
7、段的累积情况进行实时监测记录，通过数学模型实现对起始模板的定量及定性的分析。其特点为全封闭（污染少）、高精确、高灵敏。2/23/202317实时荧光定量与常规实时荧光定量与常规实时荧光定量与常规实时荧光定量与常规PCRPCR的区别的区别的区别的区别常规常规PCRPCR：通过电泳、酶联等通过电泳、酶联等后处理后处理技术，技术，对PCR扩增反应的终末产物进行定量及定性分析。实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR：通过引入DNA结合荧光染料或荧光探针，对PCR扩增反应过程中每一轮循环产物的累积进行实时检测，从而实现对起始模板的定量及定性分析。三个关键词：三个关键词：实时，荧光，定量实时，荧光，定量2/
8、23/202318P PC CR RR Re ea al l t ti imme e P PC CR RS1 S2 M实时荧光定量与常规实时荧光定量与常规实时荧光定量与常规实时荧光定量与常规PCRPCR的区别的区别的区别的区别2/23/202319在在实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术中常用的概念技术中常用的概念荧光共振能量转移荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer,FRET）：）：在两个不同的荧光基在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团（团中，如果一个荧光基团（供体供体）的发射光谱与）的发射光谱与另一基团（另一基团（受体受体）的
9、激发光谱有一定的重叠，当）的激发光谱有一定的重叠，当两个基团之间的距离足够近（小于两个基团之间的距离足够近（小于100100）时，以时，以供体供体基团的激发波长进行基团的激发波长进行激发激发，可获得由，可获得由受体受体基基团团发射发射的荧光的荧光。2/23/202320荧光共振能量转移荧光共振能量转移即：在供体基团的激发状态下由一对偶极即：在供体基团的激发状态下由一对偶极子介导的子介导的能量能量直接直接转移转移给了受体。在此过程给了受体。在此过程中中没有没有光子光子的的参与参与，是非辐射性的能量转移，是非辐射性的能量转移过程，转移效率与供受体两个基团之间距过程，转移效率与供受体两个基团之间距离
10、的离的6 6次幂倒数成正比例。次幂倒数成正比例。在实时荧光定量在实时荧光定量在实时荧光定量在实时荧光定量PCRPCRPCRPCR技术中常用的概念技术中常用的概念技术中常用的概念技术中常用的概念2/23/202321FRET产生条件产生条件1.存在荧光供体和受体，存在荧光供体和受体，而且供体的发色光谱与而且供体的发色光谱与受体的激发光谱有重叠受体的激发光谱有重叠 常用的常用的FRET组合：组合：CFP-YFP CFP-YFP/CFP-/CFP-dsREDdsRED/BFP-GFPBFP-GFP/GFP-GFP-dsREDdsRED/YFP-/YFP-dsREDdsRED/Cy3-Cy5/Alex
11、a488-Alexa555/Cy3-Cy5/Alexa488-Alexa555/Alexa488-Cy3/FITC-TRITC/Alexa488-Cy3/FITC-TRITC/YFP-TRITC/YFP-Cy3 YFP-TRITC/YFP-Cy32/23/202322 2 供体和受体的距供体和受体的距离足够近：离足够近：1-10nm （110nm为分子内为分子内/间互作的距离：间互作的距离：如蛋白质构象转如蛋白质构象转 变、酶催变、酶催化反化反 应等。）应等。）超显微观察超显微观察 3 合适偶极方向合适偶极方向 4 足够荧光寿命足够荧光寿命无FRETFRETFRET产生条件产生条件2/23/2
12、02323荧光域值线荧光域值线（fluorescence threshold line）：）：背景背景荧光与荧荧光与荧光信号的分界值，光信号的分界值，可以通过标准曲可以通过标准曲线或经验来设定，常设定为初始线或经验来设定，常设定为初始3-7个循环荧光值标准差的个循环荧光值标准差的10倍。倍。在实时荧光定量在实时荧光定量在实时荧光定量在实时荧光定量PCRPCRPCRPCR技术中常用的概念技术中常用的概念技术中常用的概念技术中常用的概念2/23/202324Threshold line C(t)value CtCt值值：是在是在PCR扩增过程中，各反应管的扩增过程中，各反应管的荧光信号与荧光域值线
13、的交叉点所对应的荧光信号与荧光域值线的交叉点所对应的循循环次数环次数（指数扩增的开始阶段指数扩增的开始阶段）。）。在实时荧光定量在实时荧光定量在实时荧光定量在实时荧光定量PCRPCRPCRPCR技术中常用的概念技术中常用的概念技术中常用的概念技术中常用的概念2/23/202325q每个模板的每个模板的CtCt值与该值与该模板的起始拷贝数的模板的起始拷贝数的对数值存在线性关系。对数值存在线性关系。起始拷贝数越多，起始拷贝数越多，CtCt值越小。值越小。q用已知起始拷贝数的用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲标准品可作出标准曲线，由此可对样本中线，由此可对样本中目标基因的含量进行目标基因的含量进行
14、精确计算精确计算。初始模板浓度的确定初始模板浓度的确定2/23/202326DetermineDetermine C(t)value for unknown C(t)value for unknown Interpolate quantity of unknown using the Interpolate quantity of unknown using the standard curvestandard curveunknown104103Unknown contains 3108 copies2/23/202327用用CtCt值定量的意义值定量的意义实时荧光定量实时荧光定量PCR方法
15、利用循环阈方法利用循环阈值（值（CtCt）的概念，在指数扩增的开始的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该差尚未放大，因此该CtCt值具有极好的值具有极好的重复性。重复性。2/23/202328 相同模板在同一台相同模板在同一台PCR仪上相同条件仪上相同条件下重复下重复96次扩增的扩增曲线图次扩增的扩增曲线图 终点处检测产物量不恒定；终点处检测产物量不恒定；Ct值则极值则极具重现性具重现性 2/23/202329绝对定量成为可能绝对定量成为可能灵敏度高灵敏度高可检测10100个细胞中个拷贝数量的基因低拷贝基因的检测低拷贝基因的检
16、测细小倍数差异样品的检测细小倍数差异样品的检测实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的优势的优势的优势的优势2/23/202330线性范围宽线性范围宽(6-9个数量级)，无需稀释高浓，无需稀释高浓度样品度样品可以在一次实验中同时检测定量高表达和低表达基因荧光探针使荧光探针使PCRPCR产物检测特异性进一步提高产物检测特异性进一步提高全封闭全封闭无PCR后处理*几乎没有污染机会实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的优势的优势的优势的优势2/23/202331 相对定量和绝对定量：相对定量和绝对定量：相对定相对定量量指的是确定样本中靶序列相对于指的是确
17、定样本中靶序列相对于另一参照样本中靶序列量的另一参照样本中靶序列量的变化值变化值，绝对定量绝对定量指的是确定样本中靶序列指的是确定样本中靶序列的的拷贝数拷贝数。实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的定量方法的定量方法的定量方法的定量方法2/23/202332相对定量的方法：相对定量的方法：标准曲线法标准曲线法比较比较Ct值法值法绝对定量的方法：绝对定量的方法：标准曲线法标准曲线法实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的定量方法的定量方法的定量方法的定量方法2/23/202333标准曲线法：标准曲线法：制作标准曲线的标准制作标准曲线的标准序列的绝对量
18、是未知的，将标准品序列的绝对量是未知的，将标准品进行相对稀释制成曲线，用以计算进行相对稀释制成曲线，用以计算样本靶序列的含量，结果为样本靶样本靶序列的含量，结果为样本靶序列与标准序列的序列与标准序列的比值比值。相对定量方法相对定量方法相对定量方法相对定量方法2/23/202334比较比较Ct法法:运用数学公式计算相对运用数学公式计算相对量，前提是假设每个循环增加一倍量，前提是假设每个循环增加一倍的产物量，在的产物量，在PCR反应的指数期得反应的指数期得到到Ct值来计算起始模板的量。值来计算起始模板的量。前提：靶基因和内源控制物的扩增前提：靶基因和内源控制物的扩增效率基本一致效率基本一致。相对定
19、量方法相对定量方法相对定量方法相对定量方法2/23/202335标准曲线法：标准曲线法：制作标准曲线的标准序列的绝制作标准曲线的标准序列的绝对量是已知的，将标准品进行相对稀释制成对量是已知的，将标准品进行相对稀释制成曲线，用以计算样本靶序列的含量，结果为曲线，用以计算样本靶序列的含量，结果为样本靶序列的样本靶序列的绝对含量绝对含量。质粒质粒DNADNA和体外转入的和体外转入的RNARNA常用作绝对定常用作绝对定量标准品。量标准品。标准品的量可根据标准品的量可根据260260nmnm的吸光度值并用的吸光度值并用DNADNA或或RNARNA的分子量来换算成其拷贝数。的分子量来换算成其拷贝数。绝对定
20、量方法绝对定量方法绝对定量方法绝对定量方法2/23/202336qDNA结合染色：结合染色：SYBRGreen1q水解探针：水解探针：TaqManqMolecularBeaconsq荧光标记引物荧光标记引物q杂交探针杂交探针实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR使用的荧光化学方法使用的荧光化学方法2/23/202337qSYBRGreen1qTaqManqMolecularBeacons荧光化学试剂荧光化学试剂荧光化学试剂荧光化学试剂2/23/202338SYBR Green ISYBR Green ISYBR Green 1SYBR Green 12/23/202339SYBR Green I
21、 SYBR Green I 工作原理工作原理工作原理工作原理qSYBR Green 1SYBR Green 1结合到双链DNA的小沟部位qSYBR Green 1SYBR Green 1染料只有和双链DNA结合后才发荧光。GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA2/23/202340Bound SYBR Green IUnbound SYBR Green IPCR SYBR Green I fluorescence SYBR Green I fluorescence increases upon binding increases upon binding ds
22、DNA dsDNA Post-amplification melting Post-amplification melting curve analysiscurve analysisSYBR Green I SYBR Green I 工作原理工作原理工作原理工作原理2/23/202341SYBR Green I SYBR Green I 工作原理工作原理工作原理工作原理2/23/202342 荧光强度荧光强度VsVs温度温度 荧光强度的变化是由于荧光强度的变化是由于 温度不断升高温度不断升高 双链双链DNADNA解离，解离，SGISGI重新游离到溶液中重新游离到溶液中 TmTm是熔解曲线的特
23、征值是熔解曲线的特征值Temperature increasesFluorescencedecreasesTmSYBR Green I SYBR Green I 熔解曲线分析熔解曲线分析熔解曲线分析熔解曲线分析2/23/202343以荧光值随温度变化作负导-dIdTTmSYBR Green I SYBR Green I 熔解曲线分析熔解曲线分析熔解曲线分析熔解曲线分析2/23/202344优化的读板温度优化的读板温度 -高于非特异产物的高于非特异产物的Tm值值 -低于目标产物的低于目标产物的Tm值值AmpliconNon-specificproducts熔解曲线分析的应用熔解曲线分析的应用熔解
24、曲线分析的应用熔解曲线分析的应用2/23/202345不同读板温度对实验结果的影响：802/23/202346不同读板温度对实验结果的影响：862/23/202347SYBR Green ISYBR Green I反应体系的设计反应体系的设计反应体系的组成：反应体系的组成：传统传统PCRPCR反应体系反应体系+SYBR Green ISYBR Green I1.SG1.SG浓度：浓度：终浓度终浓度1:5,0001:5,0001:100,0001:100,000，一般为一般为1:10,0001:10,0001:70,0001:70,0002/23/202348 2.2.PrimerPrimer浓
25、度：浓度：设计原则同普通设计原则同普通PCRPCR 终浓度终浓度5050nMnM300nM300nM 固定摸板浓度的梯度实验固定摸板浓度的梯度实验 不加摸板的对照实验（不加摸板的对照实验（NTCNTC）有无非特异信号有无非特异信号SYBR Green ISYBR Green I反应体系的设计反应体系的设计2/23/202349 熔解曲线的分析熔解曲线的分析是否单峰是否单峰 建议使用建议使用HPLC纯化的引物纯化的引物3.MgCl2浓度浓度 降低降低MgCl2浓度以减少非特异性产物浓度以减少非特异性产物 最低可至最低可至1.5nM同时做梯度实验和同时做梯度实验和NTC对照对照SYBR Green
26、 ISYBR Green I反应体系的设计反应体系的设计2/23/202350 4.反应温度和时间参数：反应温度和时间参数：反应温度参考所用酶的种类；反应温度参考所用酶的种类；退火温度使用温度梯度功能优化；退火温度使用温度梯度功能优化；反应时间与常规反应时间与常规PCR类似；类似；扩增片断一般为扩增片断一般为200300bp。SYBR Green ISYBR Green I反应体系的设计反应体系的设计2/23/202351SYBR Green ISYBR Green I的特点和不足的特点和不足1.1.不涉及特异的探针，方法设计不涉及特异的探针，方法设计简单简单，特异特异性差性差；2.2.荧光强
27、度依赖于体系中所有的荧光强度依赖于体系中所有的dsDNAdsDNA分子，分子，不能区分引物二聚体、非特异性扩增片断等；不能区分引物二聚体、非特异性扩增片断等；3.3.通过绘制溶解曲线可较好地保证特异性。通过绘制溶解曲线可较好地保证特异性。2/23/202352TaqManTaqMan探针探针荧光素荧光素淬灭剂淬灭剂TaqMan水解型杂交探针水解型杂交探针2/23/202353TaqManTaqManq目标特异性探针q5为荧光素，3为淬灭剂5荧光素3淬灭剂与目标序列互补2/23/202354RQReporterQuencherRQIntact probe-reporter quenched by
28、 FRETFRRQDuring PCR,probe hybridizes to target sequenceRQProbe is partially displaced during extensionRQProbe cleaved by 5-3 nuclease activity of polymeraseRQFree reporter exhibits unquenched fluorescenceTaqManTaqMan 工作原理工作原理工作原理工作原理2/23/202355Taqman探针反应体系的设计引物、探针设计原则：优先选择探针的序列；Tm值应比引物的Tm值高810度（6870
29、）；GC含量：3080；长度不应超过30碱基，18-30bp,optimal20；5端不应是G，G有可能会淬灭荧光素。2/23/202356Taqman探针反应体系的设计选择合适的模板链，使探针的选择合适的模板链，使探针的CsGs；扩扩增增片片断断不不超超过过400bp，通通常常为为80150bp。避避免免相相同同碱碱基基连连续续出出现现，特特别别是是四四个个或或四四个个以上以上Gs连续出现；连续出现；引物应尽量靠近探针；引物应尽量靠近探针；引物的引物的Tm值为值为5960度，长度度，长度约约20碱基；碱基；避免引物、探针之间的二级结构。避免引物、探针之间的二级结构。2/23/202357引物
30、、探针浓度的优化引物、探针浓度的优化目标：最高的信号/背景比，最小的Ct值引物浓度：50nM900nM探针浓度：50nM250nM通过多次实验确定各自的浓度和比例Taqman探针反应体系的设计2/23/202358Taqman探针的不足1.采用荧光淬灭及双末端标记，淬灭难以彻底，本底较高；2.采用酶外切活性，受酶性能影响；3.探针标记成本较高。改进：用不发光的淬灭荧光分子取代TAMRA2/23/202359Molecular BeaconsMolecular BeaconsMolecular Beacons发夹型杂交探针发夹型杂交探针2/23/202360Molecular BeaconsMo
31、lecular Beacons茎由茎由互补配对互补配对的的序列序列组成组成环与目标环与目标序列完全配对序列完全配对茎茎荧光素荧光素淬灭剂淬灭剂环环2/23/202361Target-loop interaction more stable than stem-stemTACCGGGGGTTACGAACG GTAATTTTTGCCCCCAAAAQRTargetDuring the annealing step:During the annealing step:Probe binds targetProbe binds target Reporter and quencher separated
32、Reporter and quencher separated Target-specific fluorescenceTarget-specific fluorescenceMolecular BeaconsMolecular Beacons 2/23/202362Molecular Beacons 特点和不足特点和不足q对目标对目标序列序列有很高的有很高的特异特异性性；q是是用于用于SNPSNP检测的最灵敏的检测的最灵敏的试剂之一试剂之一；q采用非荧光染料作为淬灭分子，采用非荧光染料作为淬灭分子，荧光荧光本底本底低低；q不能完全与模板结合，稳定性差；不能完全与模板结合，稳定性差；q探针探针
33、合成标记较复杂。合成标记较复杂。2/23/202363引物引物/探针设计和评估相关的免费网站探针设计和评估相关的免费网站1.1引物引物/探针的设计探针的设计Primer3(WhiteheadInstitute,MIT)http:/frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgiGeneFisher(BielefeldUniversity)http:/bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/cgi-bin/gf_submit?mode=STARTUP&qid=na&sample=dna2/23/2023641.1引物引物
34、/探针的设计探针的设计FastPCR(Biocenter,UniversityofHelsinki)http:/www.biocenter.helsinki.fi/bi/bare-1_html/oligos.htmPerlPrimer(OwenMarshall)http:/ RT)PCR 引物设计引物设计ExonPrimer(TechnischeUniversitt,Mnchen)http:/ihg.gsf.de/ihg/ExonPrimer.htmlAutoPrimer(DeutschesKrebsforschungszentrum)http:/www.autoprime.de/3.引物特异
35、性的验证Blast(NCBI)http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/引物引物/探针设计和评估相关的免费网站探针设计和评估相关的免费网站2/23/2023664引物引物/探针特性的评估探针特性的评估OligoAnalyzer(IDT)http:/ mfold(Michael Zuker,Rensselaer PolytechnicInstitute)http:/www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/dna/引物引物/探针设计和评估相关的免费网站探针设计和评估相关的免费网站2/23/2023685 5扩增子二级结构的评估扩
36、增子二级结构的评估 mfold(Michael Zuker,Rensselaer PolytechnicInstitute)http:/www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/dna/引物引物/探针设计和评估相关的免费网站探针设计和评估相关的免费网站2/23/202369实时荧光定量实时荧光定量PCR的原理的原理实时荧光定量实时荧光定量PCR的应用的应用Chromo4介绍介绍2/23/202370实时荧光定量PCR技术的应用1.病原体检测；病原体检测；2.肿瘤研究；肿瘤研究；3.基因表达研究；基因表达研究；4.免疫组份分析；免疫组份分析；5.基因突
37、变及多态性的研究基因突变及多态性的研究2/23/202371实时荧光定量PCR技术的应用病原体检测：病原体检测：检测患者血清中肝炎病毒浓度为临床药物检测患者血清中肝炎病毒浓度为临床药物治疗和疗效观察提供依据；治疗和疗效观察提供依据；检测检测HIV的量预测发病时间；的量预测发病时间；选择治疗药物：干扰素对肝炎病毒高拷贝选择治疗药物：干扰素对肝炎病毒高拷贝者不敏感，对低拷贝者敏感。者不敏感，对低拷贝者敏感。2/23/202372实时荧光定量PCR技术的应用肿瘤研究：肿瘤研究：癌基因及其相关基因的定量检测可进行癌基因及其相关基因的定量检测可进行肿瘤的早期诊断、分型、分期和预后判肿瘤的早期诊断、分型、
38、分期和预后判断；断；检测治疗中和治疗后微量残余恶性细胞检测治疗中和治疗后微量残余恶性细胞存在的数量，作为治疗效果和估计复发存在的数量，作为治疗效果和估计复发危险性的依据。危险性的依据。2/23/202373基因差异表达研究标准曲线法使用标准曲线来确定基因表达上的差异相对定量法(2Ct法)不使用标准曲线，直接分析得到基因差异表达的倍数关系2/23/202374标准曲线法步骤：1.通过标准曲线分别测出目标基因和内标基因的量2.均一化校正（Normalization)3.比较不同样品间目标基因表达差异2/23/202375相对定量法前提目标基因和看家基因的扩增效率一致，且接近100。步骤步骤通过实时
39、荧光曲线得到目标基因和看家基因的Ct值均一化校准Ct=Ct目标基因Ct看家基因Ctn=CtnCt0（不同时间、不同组织)基因差异表达的倍数2Ct2/23/202376基因突变及多态性-SNP检测2/23/202377基因分型方法基因分型方法基因分型方法基因分型方法 使用TaqMan探针(双色法)溶解曲线(单色法)序列特异PCR(单色法)2/23/202378FRFQGVQTCSNP G/AFQGVQTForward primerReverse primerAllele-specific probeAllele-specific probe用用TaqManTaqMan探针进行基因型分析探针进行基
40、因型分析SNPSNP检测检测检测检测-基因型分析基因型分析基因型分析基因型分析2/23/202379QF5GCQ53CGFQV53CTQ53Hybridization of TaqMan ProbeDigestion of probe-fluorescenceNO digestion of probe-NO fluorescenceTVQGFQMatchforAllele1Reduced Efficiency of Probe HybridizationMismatchforAllele1Polymerase多色双通道技术应用多色双通道技术应用多色双通道技术应用多色双通道技术应用-基因型分析基
41、因型分析基因型分析基因型分析2/23/202380q从病人血液样品中提取 DNA q基因型分类：qA/A(Allele 1)qG/G(Allele 2)qG/A(Heterozygote)CFQTVQ多色双通道技术应用多色双通道技术应用多色双通道技术应用多色双通道技术应用-基因型分析基因型分析基因型分析基因型分析2/23/202381Allele 1 controlVICFAM多色双通道技术应用多色双通道技术应用多色双通道技术应用多色双通道技术应用-基因型分析基因型分析基因型分析基因型分析2/23/202382Allele 2 controlVICFAM多色双通道技术应用多色双通道技术应用多色
42、双通道技术应用多色双通道技术应用-基因型分析基因型分析基因型分析基因型分析2/23/202383Heterozygote controlFAMVIC多色双通道技术应用多色双通道技术应用多色双通道技术应用多色双通道技术应用-基因型分析基因型分析基因型分析基因型分析2/23/202384多色双通道技术应用多色双通道技术应用多色双通道技术应用多色双通道技术应用-基因型分析基因型分析基因型分析基因型分析2/23/202385SYBR Green ISYBR Green I进行进行进行进行SNPSNP分析分析分析分析T5PCR primers with SNP site at 3 endC5末端不匹配会
43、导致PCR效率上有大约1000倍的差异，由此导致产物积累会有10个cycles延迟末端匹配与否，与反应终产物量的多少没有必然联系PCR#1PCR#22/23/202386SYBR Green ISYBR Green I进行进行进行进行SNPSNP分析分析分析分析MatchMismatch2/23/202387SYBR Green ISYBR Green I进行基因分型进行基因分型进行基因分型进行基因分型Amplicon 1Amplicon 2GCHigher Tmdistinct thermal profileLower Tmdistinct thermal profile2/23/20238
44、8SYBR Green ISYBR Green I进行基因分型进行基因分型进行基因分型进行基因分型IntensityIntensity-dIdI/dTdT2/23/202389TaqManMicroRNA分析方法加长靶基因的反转录荧光定量PCR2/23/202390miRNAs的研究MicroRNAs是一种内源性长度在个碱基左右的RNA分子，它在动植物中具有重要的基因调控作用，它们通过与mRNAs结合抑制翻译或造成mRNAs被酶解切割而起作用目前在各种生命体中发现的miRNAs类型共有约700种以上,通过实验验证或经数据库和软件推测其中人源的约有种高丰度存在：平均每个细胞中约有50,000个拷
45、贝2/23/202391为什么miRNAs非常重要?MicroRNAs是一类新的基因调控因子某些miRNAs控制了动植物的发育理解miRNA的功能将帮助现在流行的siRNA实验结果：RNA干扰基因沉默MicroRNAs有可能成为新型的疾病标志物MicroRNAs可能具有重要临床应用价值2/23/202392现有的miRNA检测方法克隆法Cloning杂交法NorthernBlotRibonucleaseProtection-basedPAGE电泳法基因芯片法Microarray-basedmiRNAprofiling上列各种方法均未被证实是有效，准确并且是高度重现的：不少小RNA间只有一个碱基
46、的不同2/23/202393miRNAStep 1:Stem-loop RTStep 2:Real-time PCRFQOligos required per miRNA1.Specific RT primer2.Specific forward primer3.Specific reverse primer4.Specific TaqMan probe5.Enzymes required6.Reverse transcriptase7.AmpliTaq Gold DNA Polymerase2/23/202394MicroRNA定量方法EstimatedsyntheticmiRNAinput
47、(lin-4)inRTbasedonOD:707-71copies已经实验证明可达7个数量级的线性范围Slope=-3.4R2=0.9991No.PCR cyclesFluorescence signal(Rn)No.copiesThreshold Cycle(CT)70Mcopies7copiesAB2/23/202395MicroRNA的应用实时定量分析miRNAsmiRNA表达谱分析：疾病正常的比较分析发现疾病的miRNA标志物or疾病相关的基因表达标签通过同时并行比较基因和miRNA表达类型，发现新的miRNA靶基因细胞分化研究转录后基因调控研究生物标志物的发现2/23/202396实
48、时荧光定量实时荧光定量PCR的原理的原理实时荧光定量实时荧光定量PCR的应用的应用Chromo4介绍介绍2/23/202397Chromo4定量PCR仪外形2/23/202398Chromo 4构造DNA DNA 热循环仪底座热循环仪底座(PTC-0200)PTC-0200)Chromo4 实时检测单元实时检测单元(CFD-3240)96-孔样品模块孔样品模块(ALS-3296)Chromo4 Chromo4 光电探头光电探头(CDM-3240-01)CDM-3240-01)2/23/202399MJ Chromo 4LEDs(1perchannel)Photodiodes(1perchann
49、el)Filters2/23/2023100光学系统四个通道相互独立2/23/2023101温度梯度2/23/2023102实验结果四通道2/23/2023103实验结果重复性96个重复扩增的Log-荧光强度对C（t）值的作图通过 DyNAMo 热启动 SYBR Green qPCR 试剂盒扩增并检测初始模板浓度=1062/23/2023104线性范围扩增从1010 到 1 个拷贝的初始模板所得Log-荧光强度 vs.Ct 图,每个样本作2个重复。VIC-标记的水解探针用于产物检测标准曲线回归系数R2 值为 0.998用 FAM 和Cy5标记的Taqman探针检测也得到了同样的结果 2/23/2023105感谢各位光临感谢各位光临！clmcjnclmcjn