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1、重组DNA技术与基因工程5 2 3 4 1 6 重组重组DNADNA技术与基因工程的基本概念技术与基因工程的基本概念重组重组DNADNA技术所需的基本条件技术所需的基本条件重组重组DNADNA技术的操作过程技术的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在酵母中的表达外源基因在酵母中的表达3 3 重组重组DNADNA技术的操作过程技术的操作过程切切接接转转增增检检A DNAA DNA的体外重组（切与接）的体外重组（切与接）3 3 重组重组DNADNA技术的操作过程技术的操作过程同种内切酶生产的粘性末端的连接同
2、种内切酶生产的粘性末端的连接同尾酶生产的粘性末端的连接同尾酶生产的粘性末端的连接不同粘性末端的连接不同粘性末端的连接人工粘性末端的连接人工粘性末端的连接重组率重组率基于同源重组的基于同源重组的In-FusionIn-Fusion连接连接同种内切酶生产的粘性末端的连接同种内切酶生产的粘性末端的连接5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRIEcoRI5GCTTAAAATTCG5 5 GCTTAA 55 AATTCG5 退火退火GCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGGCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGT4-DNA ligaseT4-DN
3、A ligaseGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAG同尾酶生产的粘性末端的连接同尾酶生产的粘性末端的连接BamHIBamHI5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 TACTAG 55 GATCAT5 退火退火GCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCATT4-DNA ligaseT4-DNA ligaseTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT5 TGATCAACTAGT5 BclIBclIGCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCATT
4、GATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT不同粘性末端的连接不同粘性末端的连接BamHIBamHI5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 CTGCAG5 GACGTC3 T4-DNA ligaseT4-DNA ligaseCGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGC5 CTGCAGGACGTC5 PstIPstI3 T4-DNA polT4-DNA pol切平切平5 CG5 GCKlenowKlenow补平补平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGGCGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGC人工粘性末端的连接
5、人工粘性末端的连接 55突出末端突出末端5GCCTAGGATCCG5 5 GCTTAA 555 AATTCGT4-DNA ligaseT4-DNA ligase5 5KlenowKlenow补平补平KlenowKlenow补平补平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGG5 GAATTCTTAA 555 AATTCTTAAGTdTTdTTdTTdTdGTPdGTPdCTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAA AATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCC
6、CAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5 5GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG退火退火BamH IBamH IBamH IBamH IEcoR IEcoR IBamH IBamH I人工粘性末端的连接人工粘性末端的连接 33突出末端突出末端CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGT4-DNA ligaseT4-DNA ligaseTdTTdTTdTTdTdCTPdCTPdGTPdGTPGCATGCCCCCC 3C退火退火Pst IPst IPst IPst IC3
7、 CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowKlenowPst
8、 IPst ISph ISph I人工粘性末端的连接人工粘性末端的连接 平头末端平头末端C 3 GG5 G 3C5C3 GT4-DNA ligaseT4-DNA ligaseTdTTdTTdTTdTdTTPdTTPdATPdATPGTTTTTTTTTT 3C退火退火C3 TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA 3 GG3 AAAAAAAAAAC5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGS1S1C3 5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG加热加热GTCATTTTTTT
9、TTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGT基于同源重组的基于同源重组的In-FusionIn-Fusion连接连接载体质粒载体质粒重组质粒重组质粒每条引物外侧设计含有与载体相应末端同源的每条引物外侧设计含有与载体相应末端同源的1515个碱基序列个碱基序列引物引物引物引物In-FusionIn-Fusion酶酶加入加入In-FusionIn-Fusion酶酶373715 min+5015 min+5015 min 15 min PCRPCR扩增扩增转化转化重组率重组率重组率的定义重组率的定义 重组率重组率=含有外源含有外源DNADNA的重组分子数的
10、重组分子数/载体分子总数载体分子总数；在常规实验条件下，重组率一般为在常规实验条件下，重组率一般为25-75%25-75%；重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以 大大简化大大简化DNADNA重组的后续操作。重组的后续操作。重组率重组率提高重组率的方法提高重组率的方法提高外源提高外源DNADNA片段与载体的分子比片段与载体的分子比：5 5:1 1-10 10:1 1 载体载体DNADNA分子在连接前先除去磷酸基团：分子在连接前先除去磷酸基团：5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRIEcoRI5GCTTAA
11、 pAATTCG5 p5 GCTTAA OH 55 AATTCG5 HO退火退火5 G-A-A-T-T-CC-T-T-A-A G5G A-A-T-T-CC-T-T-A-A-GOHHOOHHO碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶重组率重组率提高重组率的方法提高重组率的方法加装同聚尾末端：加装同聚尾末端：CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGT4-DNA ligaseT4-DNA ligaseTdTTdTTdTTdTdCTPdCTPdGTPdGTPGCATGCCCCCC 3C退火退火C3 CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3
12、 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowKlenowB B 重组重组DNADNA分子分子的转化和扩增（转与增）的转化和扩增（转与增）3 3 重组重组DNADNA技术的操作过程技术的操作过程转化的原理与技术转化的原理与技术转化率转化率转化细胞的扩增转化细胞的扩增转化的原理与技术转化的原理与技术CaCa2+2+诱导的完整细菌细胞的转化诱导的完整细菌细胞的转化 C
13、a Ca2+2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），大肠杆菌等），19701970年建立此技术，其原理是年建立此技术，其原理是CaCa2+2+与细菌外与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态。使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态。转化的原理与技术转化的原理与技术CaCa2+2+诱导的完整细菌细胞的转化诱导的完整细菌细胞的转化大肠杆菌感受态细胞大肠杆菌感受态细胞的制备：的制备：100 100 ml m
14、l 菌体培养至菌体培养至ODOD600 600=0.5=0.5，离心收集菌体；离心收集菌体；用用10 10 ml ml 冰冷的冰冷的10 10 mMmM CaClCaCl22溶液悬浮菌体，离心溶液悬浮菌体，离心用用1 1 ml ml 冰冷的冰冷的75 75 mMmM CaClCaCl22溶液悬浮菌体；溶液悬浮菌体；冰浴放置冰浴放置12-2412-24小时，备用。小时，备用。收集菌体；收集菌体；转化的原理与技术转化的原理与技术CaCa2+2+诱导的完整细菌细胞的转化诱导的完整细菌细胞的转化大肠杆菌感受态细胞大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：的质粒转化：取取100 100 m ml l 感受态细胞，加
15、入相当于感受态细胞，加入相当于50 50 ng ng 载体的重载体的重组组冰浴放置半小时；冰浴放置半小时；在在4242保温保温 2 2 分钟（热脉冲）；分钟（热脉冲）；快速将转化细胞转移至冰浴中放置快速将转化细胞转移至冰浴中放置1-21-2分钟；分钟；DNADNA连接液，混匀；连接液，混匀；加入加入1 1 ml ml 新鲜培养基，新鲜培养基，于于3737培养培养 1 1 小时（扩增）；小时（扩增）；涂在合适的固体培养基平板上进行筛选。涂在合适的固体培养基平板上进行筛选。转化的原理与技术转化的原理与技术细菌原生质体的转化细菌原生质体的转化 革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源革兰氏阳性
16、细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNADNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体原生质体（细胞（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNADNA分子。分子。酵母菌、霉菌、植物细胞也可用酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化。原生质体法进行转化。转化的原理与技术转化的原理与技术细菌原生质体的转化细菌原生质体的转化 不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在高渗培养基中（如细菌需生长在高渗培养基中（如34%34%的蔗糖溶液
17、，并加入甘氨的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在应始终悬浮在10.3%10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂。有器皿应保持无水无去污剂。细菌原生质体细菌原生质体的制备：的制备：转化的原理与技术转化的原理与技术细菌原生质体的转化细菌原生质体的转化 取取0.2-10.2-1mlml的原生质体悬浮液（的原生质体悬浮液（10108 88 8-10-109 99 9个原生质体），加个原生质体），加入入10-20 10-20 m ml
18、 DNAl DNA重组连接液，同时加入含有重组连接液，同时加入含有PEG1000PEG1000和和CaCa2+2+细菌原生质体细菌原生质体的转化：的转化：细菌原生质体细菌原生质体的再生的再生：原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生的等渗溶液，混匀。的等渗溶液，混匀。在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素。在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素。转化的原理与技术转化的原理与技术l l噬菌体噬菌体DNADNA的转染的转染感受态细胞的培养：感受态细胞的培养：将将大大肠肠杆杆菌菌在在含含有有麦麦芽芽糖糖（不不含含葡葡萄萄糖糖
19、）和和MgClMgCl22的的培培养养基基中中培培养至养至ODOD600 600=0.5=0.5；吸附：吸附：加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，3030保温保温1010分钟；分钟；转染裂解：转染裂解：加入加入2020倍体积的新鲜培养基，倍体积的新鲜培养基，3030培养培养2 2小时，直至培养液中菌体小时，直至培养液中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选。裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选。转化的原理与技术转化的原理与技术电击转化电击转化 将将待待转转化化的的质质粒粒或或DNADNA重重组组连连接接液液滴滴加加在在电电穿穿孔孔转转化化仪仪的的样样品品池
20、池中中，两两极极施施加加高高压压电电场场。在在强强大大电电场场的的作作用用下下，细细菌菌细细胞胞壁壁和和细细胞胞膜膜产生缝隙，质粒或产生缝隙，质粒或DNADNA重组分子便可进入细胞内。重组分子便可进入细胞内。电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大。胞均有效，但转化效率差别很大。同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验。同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验。转化率转化率转化率的定义转化率的定义 转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微
21、克载体DNADNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体也可以表征为：每微克载体DNADNA转化后，受体细胞接纳转化后，受体细胞接纳DNADNA的个数，的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）。即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）。转化率转化率转化率的定义转化率的定义 例例如如，pUC18pUC18对对大大肠肠杆杆菌菌的的转转化化率
22、率为为101088，即即每每微微克克pUC18pUC18中中只只有有101088个个分分子子能能进进入入受受体体细细胞胞。一一微微克克pUC18pUC18共共有有3.43.4X10X101111个个分分子子（6.026.02X10X1017 17/2686X6602686X660），也也就就是是说说，每每34003400个个pUC18pUC18分分子子才才有有一一个分子进入受体细胞。个分子进入受体细胞。另另一一方方面面，在在实实际际操操作作过过程程中中，转转化化一一微微克克pUC18pUC18共共需需2 2mlml感感受受态态细细胞胞，大大约约含含有有2 2X10X101010个个大大肠肠杆杆
23、菌菌细细胞胞，也也就就是是说说，每每200200个个细细胞胞只有一个细胞能接纳只有一个细胞能接纳pUC18 DNApUC18 DNA。转化率转化率 转化率的用途转化率的用途 利用转化率和重组率等参数可以帮助设计利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNADNA重组实验规模。重组实验规模。例例如，如，某一某一DNADNA重组实验的重组率为重组实验的重组率为20%20%，转化率为，转化率为101077/m mg g载体，经切载体，经切接处理后的载体转化率一般要比天然的载体低接处理后的载体转化率一般要比天然的载体低100100倍。欲获得倍。欲获得10104 44 4个重个重组克隆，需投入多少载体组克隆
24、，需投入多少载体DNADNA进行重组实验？进行重组实验？若重组率为若重组率为100%100%，则转化后产生，则转化后产生101044个重组克隆需要：个重组克隆需要：10 1044/10/1077 X 10 X 10-2-2=0.1 =0.1 m mg g 载体载体DNADNA 考虑到实验系统的重组率为考虑到实验系统的重组率为20%20%，所以实际投入载体应为：，所以实际投入载体应为：0.1/20%=0.50.1/20%=0.5 m mg g 载体载体DNADNA 载体投入量确定后，外源载体投入量确定后，外源DNADNA的投入量即可按的投入量即可按（5 5 m mg g），甚至还可以估算需要涂布
25、多少块平板进行筛选。），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选。转化率转化率 转化率的影响因素转化率的影响因素载体及载体及DNADNA重组分子方面：重组分子方面：载体本身的性质：载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同。不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同。载体的空间构象：载体的空间构象：质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级。两个数量级。插入片段的大小：插入片段的大小：对质粒载体而
26、言，插入片段越大，转化效率越低。对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低。转化率转化率转化率的影响因素转化率的影响因素受体细胞方面：受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配，例如：受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322pBR322转化大肠杆转化大肠杆菌菌JM83JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767ED8767株的转化率则株的转化率则较高。较高。转化率转化率 转化率的影响因素转化率的影响因素转化方法方面：转化方法方面：受体细胞的预处理：受体细胞的预处理：影响最大影响最大供受体的比例：供受体的比例：CaCa2+2+诱导转化诱导转化 0.1 0.1 ml
27、 ml 感受态感受态细胞细胞 50 50 ng DNAng DNA 转化方法：转化方法：CaCa2+2+诱导转化诱导转化 101066-10-1077/m mg DNAg DNA 原生质体转化原生质体转化 101099 个个原生质体原生质体 50 50 ng DNAng DNA 原生质体转化原生质体转化 101055-10-1066/m mg DNAg DNA l l-DNA-DNA转染转染 101077-10-1088/m mg DNAg DNA 电穿孔转化电穿孔转化 101066-10-1099/m mg DNAg DNA 转化细胞的扩增转化细胞的扩增扩增操作扩增操作 转化细胞的扩增操作是
28、指转化完成之后细胞的短时间培转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如：养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如：CaCa2+2+诱导转化后的诱导转化后的3737培养一个小时；培养一个小时；原生质体转化后的再生过程；原生质体转化后的再生过程；l l噬菌体转染后的噬菌体转染后的3030培养等，均属扩增操作。培养等，均属扩增操作。转化细胞的扩增转化细胞的扩增扩增操作的目的扩增操作的目的增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序 扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选扩增和表
29、达载体分子上的标记基因，便于筛选 表达外源基因，便于筛选和鉴定表达外源基因，便于筛选和鉴定 C C 转化子的筛选和鉴定（检）转化子的筛选和鉴定（检）3 3 重组重组DNADNA技术的操作过程技术的操作过程载体遗传标记检测载体遗传标记检测克隆克隆DNADNA序列检测序列检测外源基因产物检测外源基因产物检测C C 转化子的筛选和鉴定（检）转化子的筛选和鉴定（检）3 3 重组重组DNADNA技术的操作过程技术的操作过程 由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分选和鉴定方法区分转化子转化子与非转化子与非转化子、重组
30、子重组子与非重组子、与非重组子、目的重组目的重组子子与非目的重组子。与非目的重组子。转化子转化子重组子重组子目的重组子目的重组子载体遗传标记检测载体遗传标记检测抗药性筛选法抗药性筛选法抗药性筛选法的基本原理：抗药性筛选法的基本原理：ROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IAprpBR3224363 bpori抗药性筛选法可区分转化子与非转抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子。化子、重组子与非重组子。将外源将外源DNADNA片段插在片段插在EcoRIEcoRI位点：位点：非重组子呈非重组子
31、呈 ApAprr、TcTcr r 重组子呈重组子呈 ApAprr、TcTcr r 将外源将外源DNADNA片段插在片段插在BamHIBamHI位点：位点：非重组子呈非重组子呈 ApAprr、TcTcr r 重组子呈重组子呈 ApAprr、TcTcss 载体遗传标记检测载体遗传标记检测抗药性筛选法抗药性筛选法抗药性筛选法的基本操作：抗药性筛选法的基本操作：先将转化液涂布含有先将转化液涂布含有ApAp的平板，的平板，再再将将ApAp平板上的转化子影印至平板上的转化子影印至含有含有ApAp和和TcTc的平板上。的平板上。在在ApAp平板上生长、但在平板上生长、但在ApAp和和TcTc平板平板上上不长
32、的转化子即为重组子。不长的转化子即为重组子。ApApAp+TcAp+Tc影印影印挑选挑选载体遗传标记检测载体遗传标记检测营养缺陷型筛选法营养缺陷型筛选法营养缺陷型筛选法的基本原理：营养缺陷型筛选法的基本原理：营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子。
33、此营养组份的培养基上，长出的便是转化子。载体遗传标记检测载体遗传标记检测显色筛选法显色筛选法显色筛选法的基本原理：显色筛选法的基本原理：显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒肠杆菌质粒pUC18pUC18携带的携带的lacZlacZ基因（蓝色反应）、链霉菌质粒基因（蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702pIJ702
34、携带的携带的melCmelC基因（黑色反应）等。基因（黑色反应）等。载体遗传标记检测载体遗传标记检测显色筛选法显色筛选法显色筛选法的基本操作：显色筛选法的基本操作：Ap+X-galAp+X-gal重组子（重组子（ApAprr+lacZ+lacZ-）将将外外源源基基因因克克隆隆在在pUC18pUC18的的lacZ lacZ 标标记记基基因因内内部部，使使之之灭灭活活，此此时时重重组组子子为为ApAprr、lacZlacZ-基基因因型型，乳乳白白色色菌菌落落；而而非非重重组组子子则则为为ApAprr、lacZlacZ+基基因型的因型的蓝色菌落。蓝色菌落。pUC18AprlacZori克隆克隆DNA
35、DNA序列检测序列检测限制性酶切图谱法限制性酶切图谱法 所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNADNA片片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高。作量极大，实验成本也高。克隆克隆DNADNA序列检测序列检测限制性酶切图谱法限制性酶切图谱法
36、全酶解图谱法：全酶解图谱法：pUC18 pUC18 2.7 kb2.7 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIApAprrlacZlacZorioriBBBBEEPP4.0 kb4.0 kb1.0 kb1.0 kb0.8 kb0.8 kb区分重组子与非重组子区分重组子与非重组子用用BamHIBamHI酶切转化子质粒酶切转化子质粒DNADNA；电泳观察酶解产物片段。电泳观察酶解产物片段。重组子：重组子：2.7 2.7 kb+4.0 kbkb+4.0 kb非
37、重组子：非重组子：2.7 2.7 kbkb如果外源如果外源DNADNA片段也是片段也是2.7 2.7 kbkb，最好最好选用单一切口的酶将质粒线型化，然选用单一切口的酶将质粒线型化，然后通过其长度来鉴定其是否为重组子后通过其长度来鉴定其是否为重组子克隆克隆DNADNA序列检测序列检测限制性酶切图谱法限制性酶切图谱法全酶解图谱法：全酶解图谱法：区分重组子与非重组子区分重组子与非重组子如果外源如果外源DNADNA片段插在片段插在pUC18pUC18的的SphISphI位点处，原则上也可用位点处，原则上也可用SphISphI酶解鉴定，但这样做很不经济，酶解鉴定，但这样做很不经济，因为因为SphISp
38、hI非常昂贵（每非常昂贵（每100100单位单位5050美元）。用美元）。用HindIIIHindIII和和EcoRIEcoRI联联合酶解同样可以达到目的，但这合酶解同样可以达到目的，但这两种酶的价格只及两种酶的价格只及SphISphI的的1/501/50。pUC18 pUC18 2.7 kb2.7 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIApAprrlacZlacZorioriSSSSBBPP4.0 kb4.0 kb1.0 kb1.0 kb0.8 kb0
39、.8 kb克隆克隆DNADNA序列检测序列检测限制性酶切图谱法限制性酶切图谱法全酶解图谱法：全酶解图谱法：pUC18 pUC18 2.7 kb2.7 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIApAprrlacZlacZorioriBBBBEEPP4.0 kb4.0 kb1.0 kb1.0 kb0.8 kb0.8 kb区分目的重组子与非目的重组子区分目的重组子与非目的重组子用用EcoRIEcoRI酶切转化子质粒酶切转化子质粒DNADNA目的重组子：目的重组子
40、：3.0 3.0 kb+3.7 kbkb+3.7 kb 或者：或者：1.0 1.0 kb+5.7 kbkb+5.7 kb用用PstIPstI酶切转化子质粒酶切转化子质粒DNADNA目的重组子：目的重组子：3.2 3.2 kb+3.5 kbkb+3.5 kb 或者：或者：0.8 0.8 kb+5.9 kbkb+5.9 kb克隆克隆DNADNA序列检测序列检测限制性酶切图谱法限制性酶切图谱法全酶解图谱法：全酶解图谱法：pUC18 pUC18 2.7 kb2.7 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIHindIII SphI PstI SalI
41、BamHI SmaI KpnI EcoRIApAprrlacZlacZorioriBBBBEE4.0 kb4.0 kb2.0 kb2.0 kb2.0 kb2.0 kb区分目的重组子与非目的重组子区分目的重组子与非目的重组子对图示的克隆片段，转化子质粒对图示的克隆片段，转化子质粒DNADNA用用EcoRIEcoRI酶切开后，只出现酶切开后，只出现2.0 2.0 kbkb和和2.7 2.7 kbkb两条带子，实际上两条带子，实际上2.0 2.0 kbkb的条带中含有两种不同的的条带中含有两种不同的2.7 kb2.7 kb2.0 kb2.0 kbEE分子。分子。克隆克隆DNADNA序列检测序列检测限
42、制性酶切图谱法限制性酶切图谱法部分酶解图谱法：部分酶解图谱法：2.2 kb2.2 kbPstI EcoRI BamHIPstI EcoRI BamHIBBBBEE4.4 kb4.4 kb1.2 1.2 1.8 kb1.8 kbEEBB0.6 0.6 0.8 0.8 该重组质粒经酶解后，分别得到下列几组数据：该重组质粒经酶解后，分别得到下列几组数据：BamHIBamHI全酶解：全酶解：0.6 0.8 1.8 3.4 0.6 0.8 1.8 3.4 kbkbBamHI+EcoRIBamHI+EcoRI全酶解：全酶解：0.6 0.8 1.8 1.2 2.2 0.6 0.8 1.8 1.2 2.2 k
43、bkb其中，其中，1.2 1.2 kbkb片段的存在表明该片段位于一端。片段的存在表明该片段位于一端。BamHIBamHI部分酶解：部分酶解：1.4 2.6 4.0 1.4 2.6 4.0 kbkb其中，其中，1.4 1.4 kbkb的片段必为的片段必为0.6 0.6 kbkb和和0.8 0.8 kbkb两片段，表两片段，表明两者是连在一起的；同理，明两者是连在一起的；同理，2.6 2.6 kbkb的片段必为的片段必为0.8 0.8 kbkb和和1.8 1.8 kbkb两片段，表明两者是连在一起的；最后，两片段，表明两者是连在一起的；最后，4.0 4.0 kbkb的片段必为的片段必为0.6 0
44、.6 kbkb和和3.4 3.4 kbkb两片段，表明两者两片段，表明两者是连在一起的。是连在一起的。克隆克隆DNADNA序列检测序列检测菌落噬菌斑原位杂交法菌落噬菌斑原位杂交法 菌落或噬菌斑原位杂交法的工作原理是根据克隆的目的基菌落或噬菌斑原位杂交法的工作原理是根据克隆的目的基因或因或DNADNA片段的同源序列设计并合成片段的同源序列设计并合成探针探针，以此搜寻筛选含有，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。其中，目的基因的目的重组子。其中，DNADNA同源序列之间的特异性互同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据。补杂交是该技术的基本理论依据。克隆克隆DNADNA序列检测序列检测
45、 菌落噬菌斑原位杂交法菌落噬菌斑原位杂交法菌落原位杂交法的基本操作：菌落原位杂交法的基本操作：影印影印用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板；用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板；洗涤洗涤杂交杂交感光感光用用0.40.4NN的的NaOHNaOH溶液浸泡影印薄膜；溶液浸泡影印薄膜；用用SSCSSC溶液浸泡清洗影印薄膜溶液浸泡清洗影印薄膜；8080烘干固定影印薄膜；烘干固定影印薄膜；薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温；薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温；用用SSC-SDSSSC-SDS液洗涤杂交薄膜；液洗涤杂交薄膜；用用XX光胶片覆盖薄膜感光。光胶片覆盖薄膜感光。洗涤洗涤压片压片克隆克隆DNADNA序列检测序列检测菌落
46、噬菌斑原位杂交法菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的制备：杂交探针的制备：用于菌落或噬菌斑原位杂交的探针必须满足下列条件：用于菌落或噬菌斑原位杂交的探针必须满足下列条件：单链结构（双链单链结构（双链DNADNA可用碱变性）可用碱变性）足够长度（至少足够长度（至少1212个个碱基）碱基）内部不含互补区内部不含互补区 探针的制备方法或来源包括：探针的制备方法或来源包括：人工合成人工合成 cDNAcDNA合成合成 同源序列同源序列 mRNAmRNA 克隆克隆DNADNA序列检测序列检测菌落噬菌斑原位杂交法菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：杂交探针的标记：逆转录酶逆转录酶介导的反转录标记介导的反转录标记3
47、 3 AAAAAAAAAAACCAGCUUCCAAAAAAAAAAACCAGCUUCCGGAACUGAUUUAGGCUAACUGAUUUAGGCU 55mRNAmRNA反转录酶反转录酶MgMg2+2+dNTP+dNTP+ppppppddATPATP（aa-3232P-dATPP-dATP）5 5 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT55mRNAmRNA33cDNAcDNA3 3 AAAAAAAAAAACCAGCUUCCAAAAAAAAAAACCAGCUUCCGGAACUGAUUUAGGCUAACUGAUUUAGGCU5 5 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTCGGGTC
48、GAAAAGGGGCTTGCTTGA ACTCTAAAAAATCCGTCCGA A克隆克隆DNADNA序列检测序列检测菌落噬菌斑原位杂交法菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：杂交探针的标记：DNADNA聚合酶聚合酶介导的缺刻前移标记介导的缺刻前移标记5 5 GG-CC-T T-CC-AA-GG-CC-T T-GG-GG-AA-GG-T 3T 33 3 CC-GG-AA-GG-T T-CC-GG-AA-CC-CC-T T-CC-A A 5 5 MgMg2+2+5 5 dNTP dNTP 5 5 ppppp p dA dA（a a-3232P-dATPP-dATP）5 5 GG-CC-T T-C
49、AC A-GG-CC-T T-GG-GG-AA-GG-T 3T 33 3 CC-GG-AA-GG-T T-CC-GG-AA-CC-CC-T T-CC-A A 5 5 5 5 GG-CC-T T-CC-A-GA-G-CC-T T-GG-GG-AA-GG-T 3T 33 3 CC-GG-AA-GG-T T-CC-GG-AA-CC-CC-T T-CC-A A 5 5 DNase IDNase IDNA pol IDNA pol I克隆克隆DNADNA序列检测序列检测菌落噬菌斑原位杂交法菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：杂交探针的标记：ABCABC荧光标记荧光标记GCTTGAGCAGTAACCTGG
50、CTTGAGCAGTAACCTG荧光胺荧光胺Biotin Biotin 生物素生物素AvidinAvidin生物素结合蛋白生物素结合蛋白烷烃连接臂烷烃连接臂克隆克隆DNADNA序列检测序列检测菌落噬菌斑原位杂交法菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：杂交探针的标记：ABCABC显色酶标记显色酶标记GCTTGAGCAGTAACCTGGCTTGAGCAGTAACCTG显色酶显色酶Biotin Biotin 生物素生物素Avidin Avidin 生物素结合蛋白生物素结合蛋白烷烃连接臂烷烃连接臂生色底物生色底物颜色产物颜色产物克隆克隆DNADNA序列检测序列检测菌落噬菌斑原位杂交法菌落噬菌斑原位杂交法