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1、第一节食品中菌落总数的测定第一节食品中菌落总数的测定第一节食品中菌落总数的测定第一节食品中菌落总数的测定菌落总数菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后后,所得所得1mL(g)或或1cm2面积检样中所含菌落的总数。面积检样中所含菌落的总数。一、菌落总数测定的意义一、菌落总数测定的意义o判定食品被细菌污染的程度及卫生质量判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。o预测食品存用的期限长短。预测食品存用的期限长短。o了解细菌在食品中的繁殖动态。了解细菌在食品中的繁殖动态。二、菌落总数测定的方法二、菌落总数测定的方法本标准与本标准与GB/T 4789.2-200
2、8相比，主要修改如下：相比，主要修改如下：修改了标准的中英文名称；修改了标准的中英文名称；修改了菌落总数计算公式中的解释；修改了菌落总数计算公式中的解释；修改了培养基和试剂；修改了培养基和试剂；删除了第二法删除了第二法 菌落总数菌落总数PetrifilmTM 测试片法。测试片法。第一节食品中菌落总数的测定第一节食品中菌落总数的测定检测标准：检测标准：GB/T 4789.2-2010平板菌落计数法平板菌落计数法:(一一)检验步骤检验步骤(程序程序)：（二）（二）操作步骤操作步骤1样品的稀释样品的稀释1.1 固体或半固体样品：固体或半固体样品：称取检样称取检样25g 225mL灭菌磷酸盐缓冲液或生
3、理盐水的无灭菌磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，菌均质杯内，8000r/mim10000r/min均质均质12min，或无，或无菌均质袋内，用拍击式均质器拍打菌均质袋内，用拍击式均质器拍打12min 制成制成1 10的的样品匀液样品匀液1.2 液体样品：液体样品：吸取检样吸取检样25mL 225mL灭菌磷酸盐缓冲液或生理盐水的无灭菌磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶，菌锥形瓶，(瓶内预置适量的玻璃珠瓶内预置适量的玻璃珠)，充分混匀，充分混匀 制成制成1 10的均匀稀释液的均匀稀释液1.3 1.3 用用1mL1mL灭菌吸管灭菌吸管 吸取吸取110110稀释液稀释液1ml 1ml 注入含有注入
4、含有9mL9mL灭菌生理盐水的试管内灭菌生理盐水的试管内 振摇试管混合均匀振摇试管混合均匀 制制成成l100l100的稀释液。的稀释液。1.4 1.4 另取另取1mL1mL灭菌吸管，按以上灭菌吸管，按以上和和步骤操作顺序，制步骤操作顺序，制1010倍递增稀释液。倍递增稀释液。1.5 1.5 选择选择2-32-3个适宜稀释度，各吸取个适宜稀释度，各吸取1mL1mL分别置于灭菌平皿中，分别置于灭菌平皿中，每个稀释度做每个稀释度做2 2个平皿。个平皿。（二）（二）操作步骤操作步骤1样品的稀释样品的稀释1.6 1.6 稀释液移人平皿后，将凉至稀释液移人平皿后，将凉至4646左右的左右的平板计平板计数琼
5、脂数琼脂培养基注入平皿约培养基注入平皿约15mL15mL，并转动平皿混合，并转动平皿混合均匀。均匀。（二）（二）操作步骤操作步骤同时将同时将平板计数琼脂平板计数琼脂培养基倾人加有培养基倾人加有1mL稀释液稀释液(不含样品不含样品)的灭菌平皿内作空白对照。的灭菌平皿内作空白对照。1样品的稀释样品的稀释样品稀释及做平板样品稀释及做平板1mL1mL1mL1mL1:101:10001:1001:100001mL1mL1mL加入加入46平板计数琼脂平板计数琼脂培养基培养基1520mL25g/ml样品样品生理盐生理盐水水225ml均质均质12min注意：注意：o每递增稀释一次，换用一次每递增稀释一次，换用
6、一次1mL无菌吸管或吸头无菌吸管或吸头o检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。，以防止细菌有所死亡或繁殖。（二）（二）操作步骤操作步骤1样品的稀释样品的稀释2.2.培养培养 待琼脂凝固后翻转平板待琼脂凝固后翻转平板,n 置置(361)(361)恒温箱内培养恒温箱内培养(482)h,(482)h,n 水产品水产品(301)(301)恒温箱内培养恒温箱内培养(723)h(723)h。（二）（二）操作步骤操作步骤注意：注意：如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，如果样品中可能含有在琼脂培养基
7、表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL），），凝固后翻转培养。凝固后翻转培养。以菌落形成单位（以菌落形成单位（colony-forming units,CFU）表示）表示3.1 选菌落数在选菌落数在30300CFU，无蔓延菌落生长的平板，无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落的平板记录具体菌落数，大于数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。度的菌落数应采用两个平板的平均数。（二）（二）操作步骤操作步骤3
8、.菌落计数菌落计数（二）（二）操作步骤操作步骤 3.2 其中一平板有较大片状菌落生长时，不宜采用，其中一平板有较大片状菌落生长时，不宜采用，应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落数不到平板的一半，而其余一半中菌落若片状菌落数不到平板的一半，而其余一半中菌落分布均匀，即计算半个平板后乘以分布均匀，即计算半个平板后乘以2，代替一个平，代替一个平板菌落数。板菌落数。3.3 当平板上出现菌落间无明显当平板上出现菌落间无明显 界线的链状生长时，则每条单链作界线的链状生长时，则每条单链作 为一个菌落计数为一个菌落计数3.菌落计数菌落计数（二）
9、（二）操作步骤操作步骤4.结果的表述结果的表述4.1.1 若只有一个稀释度平板的菌落数在适宜计数范若只有一个稀释度平板的菌落数在适宜计数范围内，计算两平板菌落数的平均值，再将平均值乘以围内，计算两平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（或毫升）中菌落总数结果。相应稀释倍数，作为每克（或毫升）中菌落总数结果。4.1 菌落总数的计算方法菌落总数的计算方法（二）（二）操作步骤操作步骤4.结果的表述结果的表述4.1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式（按式（1）计算：）计算：N=C/(n1+0.1n2)d-(1
10、)式中：式中：N-样品中菌落总数；样品中菌落总数；C-平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1-第一个适宜稀释度平板数；第一个适宜稀释度平板数；n2-第二个适宜稀释度平板数；第二个适宜稀释度平板数；d-稀释因子（第一稀释度）。稀释因子（第一稀释度）。4.1 菌落总数的计算方法菌落总数的计算方法（二）（二）操作步骤操作步骤4.结果的表述结果的表述稀释度稀释度1100（第一稀释度）（第一稀释度）11000（第二稀释度）（第二稀释度）菌落数菌落数232；24433；35N=C/(n1+0.1n2)d =232+244+33+35/2+(0.12)10-
11、2 =544/0.022=24727数据数据“四射五入四射五入”后，表示为后，表示为25000或或2.51044.1 菌落总数的计算方法菌落总数的计算方法示例示例4.1.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于若所有稀释度的平板上菌落数均大于300，则对稀释度，则对稀释度最高的平板进行计数，最高的平板进行计数，其它平板可记为多不可计，其它平板可记为多不可计，结果按结果按平均菌落数乘以最高稀释度计算。平均菌落数乘以最高稀释度计算。4.1.4 若所有稀释度的平均菌落数均小于若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则按稀释度最低，则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。的平均菌落数乘以稀释倍数计算。（二
12、）（二）操作步骤操作步骤4.结果的表述结果的表述4.1 菌落总数的计算方法菌落总数的计算方法4.1.5 若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低乘以最低稀释倍数计算。稀释倍数计算。4.1.6 所有稀释度的平板菌落数均不在所有稀释度的平板菌落数均不在30300之间，其中一之间，其中一部分小于部分小于30或大于或大于300时，则以最接近时，则以最接近30或或300的平均菌落的平均菌落数乘以稀释倍数计算数乘以稀释倍数计算（二）（二）操作步骤操作步骤4.结果的表述结果的表述4.1 菌落总数的计算方法菌落总数的计算方法4.2.1 4.2.1 菌落数在菌落数在
13、100100以内时，按以内时，按“四射五入四射五入”原则修约，采用两位有效原则修约，采用两位有效数字报告。数字报告。4.2.2 4.2.2 大于或等于大于或等于100100时，则报告前面两位有效数字，第三位数采用时，则报告前面两位有效数字，第三位数采用“四射五入四射五入”原则修约后，取前两位数字，后面用原则修约后，取前两位数字，后面用0 0代替位数；也代替位数；也可用可用1010的指数形式表示。的指数形式表示。4.2.34.2.3若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。4.2.44.2.4若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。若
14、空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。4.2.5 4.2.5 称重取样以称重取样以CFU/gCFU/g为单位报告，体积取样以为单位报告，体积取样以CFU/mLCFU/mL为单位报告为单位报告（二）（二）操作步骤操作步骤4.结果的表述结果的表述4.2 菌落总数的报告菌落总数的报告复习题1 1、什么是菌落、什么是菌落总总数？数？2 2、测测定食品、定食品、饮饮料等料等产产品的菌落品的菌落总总数有什么意数有什么意义义？3 3、画出平板、画出平板倾倾注法注法测测定菌落定菌落总总数的示意数的示意图图。4 4、在、在测测定菌落定菌落总总数数时时，如何，如何选择选择菌落菌落进进行行计计数？数？5 5、在
15、菌落、在菌落总总数的数的检验检验中，要注意哪些事中，要注意哪些事项项？6 6、在菌落、在菌落总总数的数的检验检验中，如何根据中，如何根据样样品的特性品的特性选择选择培养培养温度和温度和时间时间？思考题思考题第二节第二节 食品中大肠菌群计数食品中大肠菌群计数一、大肠菌群概述一、大肠菌群概述 o 大肠菌群：指一群在大肠菌群：指一群在36条件下培养条件下培养48h能发酵乳糖、能发酵乳糖、产酸产气的需氧及兼性厌氧革兰氏染色产酸产气的需氧及兼性厌氧革兰氏染色阴性阴性无芽胞无芽胞杆菌。杆菌。o主要来源于人畜粪便，作为污染指标评价食品卫生状主要来源于人畜粪便，作为污染指标评价食品卫生状况，推断食品中肠道致病
16、菌污染的可能。况，推断食品中肠道致病菌污染的可能。o大肠菌群的组成大肠菌群的组成:大肠埃希氏菌发属、柠檬酸杆菌属、大肠埃希氏菌发属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属和阴沟肠杆菌。产气克雷伯氏菌属和阴沟肠杆菌。大肠菌群或大肠杆菌大肠菌群或大肠杆菌：粪便污染的指标菌：粪便污染的指标菌二、二、大肠菌群的测定意义大肠菌群的测定意义以大肠菌群作为粪便指标菌原因：以大肠菌群作为粪便指标菌原因：1)在粪便中数量最大；在粪便中数量最大；2)在外环境中存活的时间与致病菌大体相同；在外环境中存活的时间与致病菌大体相同；3)检测方法简便容易。检测方法简便容易。o大肠菌群检验的意义大肠菌群检验的意义（1）判断食品中否受
17、到）判断食品中否受到粪便污染。粪便污染。（2）有利于控制肠道传染病的发生和流行。有利于控制肠道传染病的发生和流行。（3）有利于控制食品在生产加工、运输、保存等有利于控制食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况。过程中的卫生状况。二、大肠菌群的测定意义二、大肠菌群的测定意义三、三、大肠菌群的生物学特性大肠菌群的生物学特性1.形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽胞杆菌。形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽胞杆菌。2.发酵乳糖产酸产气发酵乳糖产酸产气 3.培养特性：培养特性：n 在在EMB琼脂上的典型菌落琼脂上的典型菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，
18、常有金属光泽；圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽；n 在麦康凯琼脂上的典型菌落在麦康凯琼脂上的典型菌落:呈桃红色或中心桃红、呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润。圆形，扁平，光滑湿润。EMB平板照片及原理平板照片及原理麦康凯琼脂平板麦康凯琼脂平板Age of culture is 24 h四、大肠菌群检验方法及操作方法四、大肠菌群检验方法及操作方法采用标准：采用标准：GB/T 4789.32010o第一法第一法 大肠菌群大肠菌群MPN(most probable number)计数法计数法o第二法第二法 大肠菌群平板计数法大肠菌群平板计数法煌绿乳糖胆盐肉汤煌绿乳糖胆盐肉汤（一）
19、检验程序（一）检验程序大肠菌群大肠菌群MPN计数法计数法样品的稀释样品的稀释初发酵试验初发酵试验复发酵试验复发酵试验大肠菌群最可能数大肠菌群最可能数（MPN）报告）报告LST:月桂基硫酸盐胰蛋白胨10-1各加入各加入1ml月桂基硫酸盐胰月桂基硫酸盐胰蛋白胨（蛋白胨（LST）肉汤管肉汤管初初发发酵酵试试验验检检样样稀稀释释检样量1g/ml检样量0.1g/ml检样量0.01g/ml复复发发酵酵试试验验煌绿乳糖胆盐煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉）肉汤管汤管查查MPN表报告结果表报告结果10-310-210-41mL1mL1mL361培养培养24h2h48h2h产气管：用接种环移种一环产气管：用接种环移种
20、一环未产气管未产气管大大肠肠菌菌群群阴阴性性产气为阳性产气为阳性未产气为阴性未产气为阴性361培养培养24h2h48h2h(二二)操作步骤操作步骤1 1样品的稀释样品的稀释:同菌落总数的测定同菌落总数的测定2初发酵试验初发酵试验o选择选择3个稀释度，每个稀释度接种个稀释度，每个稀释度接种3管管月桂基硫酸盐胰蛋月桂基硫酸盐胰蛋白胨（白胨（LST）肉汤，每管接种）肉汤，每管接种1mL(如接种量超过如接种量超过1mL，则用双料则用双料LST)，(361)恒温箱培养恒温箱培养(242)h，观察，观察倒管内是否产气，如未产气，继续培养至倒管内是否产气，如未产气，继续培养至(482)h，记，记录产气的录产
21、气的LST肉汤管数。肉汤管数。(二二)操作步骤操作步骤如所有发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有如所有发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，进行复发酵试验。产气者，进行复发酵试验。(二二)操作步骤操作步骤3复发酵试验复发酵试验o用接种环从所有用接种环从所有(482)h内发酵产气的内发酵产气的LST肉管中分别取肉管中分别取培养物一环，移种于煌绿乳糖胆盐（培养物一环，移种于煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，）肉汤管中，(361)恒温箱培养恒温箱培养(482)h，观察产气情况，产气者，观察产气情况，产气者，记为大肠菌群阳性管记为大肠菌群阳性管(二二)操作步骤操作步骤4大肠菌群最
22、可能数（大肠菌群最可能数（MPN）的报告）的报告o根据大肠菌群阳性管，检索根据大肠菌群阳性管，检索MPN表（见附表），报告每表（见附表），报告每克（毫升）样品中大肠菌群的克（毫升）样品中大肠菌群的MPN值。值。大肠菌群平板计数法大肠菌群平板计数法（一）检验程序：（一）检验程序：样品的稀释样品的稀释平板计数平板计数平板菌落数的选择平板菌落数的选择 大肠菌群平板计数大肠菌群平板计数的报告的报告 证实试验证实试验(二二)操作步骤操作步骤1 1样品的稀释样品的稀释:同菌落总数的测定同菌落总数的测定(二二)操作步骤操作步骤2.平板计数平板计数2.1 选取选取23个适宜连续稀释度，每个稀释度接种两个无菌个
23、适宜连续稀释度，每个稀释度接种两个无菌平皿（平皿（1mL）。同时分别取）。同时分别取1mL生理盐水加入两个无菌生理盐水加入两个无菌平皿作空白对照。平皿作空白对照。2.2 将将1520mL冷至冷至46的结晶紫中性红胆盐琼脂的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）倾注于每个平皿，旋转平皿混匀，琼脂凝固后，）倾注于每个平皿，旋转平皿混匀，琼脂凝固后，再加再加34mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于覆盖平板表层。翻转平板，置于361培养培养1824h。3.平板菌落数的选择平板菌落数的选择n 选取菌落数在选取菌落数在15150 CFU之间的平板，分别计数平板之间的平板，分别计数平板上典型和可疑大肠菌群菌落
24、。上典型和可疑大肠菌群菌落。n典型菌落：紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌典型菌落：紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为落直径为0.5mm或更大。或更大。(二二)操作步骤操作步骤4.证实试验证实试验从从VRBA平板上挑取平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于移种于BGLB肉汤管内，肉汤管内，361培养培养2418h，观察产气情况。，观察产气情况。凡凡GBLB肉汤管产气，可报告为大肠菌群阳性。肉汤管产气，可报告为大肠菌群阳性。5.大肠菌群平板计数报告大肠菌群平板计数报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以经最后证实为大肠菌群阳性的试管
25、比例乘以3.中计数的中计数的平板菌落数，在乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）样平板菌落数，在乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）样品中大肠菌群数。品中大肠菌群数。例：例：10-4样品稀释液样品稀释液1mL，在，在VRBA平板上有平板上有100个典型个典型和可疑菌落，挑取其中和可疑菌落，挑取其中10个接种个接种BGLB肉汤管，证实有肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：1006/10104/g(mL)=6.0105CFU/g(mL)1 1、从制备样品匀液至稀释完毕、从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过全过程不得超过15min15min。2 2、对产酸但
26、未看到气泡的乳糖发酵，用手轻打动试管，、对产酸但未看到气泡的乳糖发酵，用手轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，应考虑可能有气体产生，应作如有气泡沿管壁上浮，应考虑可能有气体产生，应作进一步试验。进一步试验。3 3、挑选菌落进行证实试验时，最少要挑、挑选菌落进行证实试验时，最少要挑2 2个以上的典型个以上的典型菌落或非典型可疑菌落进行接种。菌落或非典型可疑菌落进行接种。4 4、不可用其他胆盐代替指定的胆盐。、不可用其他胆盐代替指定的胆盐。五、检验注意事项五、检验注意事项六、饮用水的大肠菌群检验六、饮用水的大肠菌群检验GB/T8538-2008饮用天然矿泉水检验方法饮用天然矿泉水检验方法复习题1、什么是大肠菌群？大肠菌群由哪些微生物组成？2、测定食品、饮料等产品的大肠菌群数有什么意义？3、大肠菌群具有哪些生物学特性？4、在大肠菌群数的检验中，要注意哪些事项？5、在水的大肠菌群数检验中，如何进行水样的采集？