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1、第四讲基因工程动物细胞培养制药工艺药用蛋白质的合成复杂，要有精确折叠的空间结构，要有糖基化，才能使药物发挥真正的功能。细菌和酵母等产品要么是包涵体，要么难以糖基化功能修饰。动物细胞的培养技术来生产有功能的蛋白质，大规模动物细胞特别是人源细胞的培养在药物生产中的位置会越来越重要。人畜病毒疫苗:口蹄疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病和脊髓灰质炎、乙肝疫苗。干扰素、单克隆抗体、重组基因工程产品。组织型血纤蛋白溶酶原激活剂、免疫珠蛋白G、M、尿激酶、人生长因子等。第一节动物细胞制药的表达系统与特征昆虫系统、哺乳动物细胞系统，最成功、重要表达活性外源蛋白的有效系统，应用于药物蛋白质的表达。一、哺乳动物细胞表达系
2、统与特征1.动物细胞的特征细胞膜、细胞质和细胞核没有细胞壁。亚细胞器，功能独特。2.动物细胞代谢动物细胞的不同代谢途径及其相应的酶体系定位于特定的亚细胞区域。通过胞内运输（囊泡包裹）实现区域之间的物质、信息和能量流动，通过穿梭实现不同代谢途径之间的交换。在动物细胞培养中，葡萄糖和谷氨酰胺提供能量并作为合成代谢的前体，因此动物细胞的培养具有一定的灵活性。葡萄糖受限可增加谷氨酰胺的消耗得以补偿，反之亦然。谷氨酰胺是动物细胞的氮源，谷氨酰胺受限时，可增加其他氨基酸的消耗得以补偿。糖代谢特点：动物细胞吸收葡萄糖后，进行糖酵解，大部分葡萄糖分解为丙酮酸，进一步被还原为乳酸，乳酸分泌到胞外并在培养液中积累
3、。丙酮酸还可转化为乙酰辅酶A，进入三羧酸循环，彻底氧化产生CO2和水。小部分（48）葡萄糖进入戊糖磷酸途径，把葡萄糖转化为4、5、7碳糖和还原力NADPH，5碳糖用于核酸合成，其他中间产物进入脂肪酸代谢、核酸代谢和氨基酸代谢。葡萄糖代谢旺盛，会产生大量的乳酸，对细胞产生毒性。氨基酸代谢特点：吸收谷氨酰胺后，进入氨基酸代谢途径，通过脱氨、转氨等作用，合成其他必需和非必需氨基酸。大多数谷氨酰胺在脱氨酶催化下，生成谷氨酸，并释放氨，对细胞产生毒性。小部分谷氨酰胺通过转氨生成其他嘌呤、嘧啶和氨基糖等合成代谢的前体。谷氨酸还原酶把谷氨酸转化为中间产物-酮戊二酸，进入三羧酸循环，为细胞提供能量。所以谷氨酰
4、胺在细胞能量代谢中具有重要作用。谷氨酰胺与丙酮酸和草酰乙酸发生转氨作用，生成丙氨酸和天门冬氨酸，丙氨酸可进入培养液并积累。在快速生长的动物细胞培养体系，转氨作用是主要的代谢途径。不同的培养条件，葡萄糖和谷氨酰胺代谢重叠于丙酮酸。在正常细胞系中，丙酮酸羧化产生草酰乙酸，而草酰乙酸来源于谷氨酰胺。在连续细胞系中，没有这种流动。能量是以ATP和NADPH的形式提供，来源于葡萄糖和谷氨酰氨，但二种细胞系对各个代谢途径的贡献和所起的作用不同。常流加葡萄糖或谷氨酰氨，控制整个代谢过程，避免有毒废物积累。3.蛋白质糖基化蛋白质合成是以mRNA为模板，在核糖体上完成。而蛋白质的糖基化无需模板指导，因此糖蛋白的
5、寡糖结构容易发生变化。糖蛋白的单糖单元:-D-葡萄糖、-D-半乳糖、-D-甘露糖、-D-木糖、-D-岩藻糖、N-乙酰-D-葡萄糖胺、N-乙酰-D-半乳糖胺和-N-乙酰神经氨酸（或唾液酸）。糖基化类型：寡糖基以共价键与蛋白质的氮原子结合为N-糖基化，或与氧原子结合为O-糖基化。这两种糖基化的位点和数量及糖的种类都不同。N-糖基化：聚糖部分连接在天门冬酰胺的氨基上，其模体的保守序列为Asn-X-Thr/Ser(X为除脯氨酸以外的任意氨基酸)。如果X为Trp、Asp、Glu和Leu，对糖基化有负影响，而第三位Thr能增强糖基化。N-糖基化分为高甘露糖型、复合型和杂合型三种类型，共同核心是 3个甘露糖
6、和 2个 N-乙酰葡萄糖胺组成的 5糖（Man3GluNAc2），其他糖形成支链。高甘露糖型的支链为甘露聚糖（59聚体），无其他糖。复合型含有2个以上支链，如乙酰半乳糖胺、果糖和唾液酸等。杂合型至少含有一条复合糖链，另一个链含有甘露糖。O-聚糖连接在Thr/Ser的羟基上，还没有发现保守序列。O-聚糖有四种不同的核心结构，都含有N-乙酰半乳糖胺基，糖基化会影响蛋白质的局部构象。O-糖基化比较小，一般为16个寡聚糖，但比N-糖基化变化更大。O-糖基化只在高尔基体上进行，糖基单元有木糖、葡萄糖。糖基化磷脂酰肌醇锚着点：它在膜与蛋白质之间形成稳定的相互作用，都具有相同的核心结构：胆胺-PO4-Man
7、2-GlcHN2-肌醇-PO4-脂。胆胺形成膜内蛋白的桥，而肌醇在膜内。在细胞培养生产重组蛋白时，磷脂酶C可切割此类蛋白，有利于纯化。细胞特异性糖基化途径淋巴细胞中进行，它不依赖于内质网和高尔基体。IgG的糖基化，等分GlcNAc残基连接在核心甘露糖上，该糖基化在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性中起重要作用。IgG蛋白的铰链区，富含Ser、Thr和Pro，5个Ser全部糖基化。促黄体激素、促甲状腺素等的硫酸化只能在垂体中发生。尽管哺乳动物细胞具有细胞内的糖基化装置，但不同细胞系，糖基化特征不同。鼠和猪细胞倾向于添加乙酰果糖而不是乙酰唾液酸，在鼠杂交瘤或人鼠杂交瘤生产的抗体中，乙酰果糖占优势。CHO
8、细胞不能合成等分N-乙酰葡萄糖胺，而鼠细胞系却能形成半乳糖末端，对人有免疫原性。要根据糖基化的结构，选择适宜的细胞系。细胞系Fuc Gal唾液酸1,61,3Fuc1,3GalSO4-GalNAc2,32,6糖 基化等 分GluNAcBHK+0+0+0-0CHO+-0 0+0+0鼠杂交瘤+0+0+0+0C127+0+0J558L+0+-+0人淋巴细胞+0 0 0+0+人垂体+0 0+0+Namalwa+0 0 0+-人鼠杂交瘤+0 0 0+02.哺乳动物细胞表达系统基因工程哺乳动物细胞系：失去分化能力的无限生长细胞系，即永久性细胞。表达的蛋白质能正确加工、修饰并折叠形成具有生物活性的功能分子，接
9、近或类似天然产物。糖基化等修饰是糖蛋白行使功能所必需的，而且对产品质量有影响，如生物活性、稳定性、免疫原性等。原核细胞表达的EPO无糖基化，在体内表现无活性。原核表达的GMCSF虽有活性，但在体内产生抗体。动物细胞表达产物分泌到培养液，容易分离纯化。约有70批准的蛋白质药物由哺乳动物细胞系统表达制造，而且数目还在不断增加。表达系统O-糖基化寡聚甘露糖 高甘露糖复合体大肠杆菌0 0 0 0酿酒酵母 0昆虫Sf9 0仓鼠CHO 0仓鼠BHK 0鼠杂交瘤 0鼠骨髓瘤 0C127 0J558L 0人淋巴细胞 0 0Namalwa 0人鼠杂交瘤 0大肠杆菌 酵母 哺乳动物细胞产物浓度 高 高 低分子量
10、低 高 高二硫键 有限 不受限制 不受限制分泌 无 有或无 有形式 包涵体 单链，天然 单链，天然折叠 不正确 正确 正确糖基化 无 可能 完全逆转录病毒 无 无 可能热原 可能 无 无培养特点 容易 容易 较难，成本高分离纯化 复杂 复杂 简单细胞类型 表 达 水 平（g/ml）猴CV1 110猴CV1 0.05猴COS 1小鼠成纤维细胞C127 15小鼠成纤维细胞3T3 0.10.5CHO（dhfr）0.010.05CHO（dhfr）10动物细胞表达系统的不足是细胞生长缓慢，生产效率较低，产量远远落后于其他表达系统。骨髓细胞MPG11生产IgG的能力为5pg/(细胞.分钟)，10L反应器，
11、密度为107/ml，生产能力不到1g/d。连续细胞系增加了生长和代谢速率，但同时导致了副产物的增加。动物细胞对培养条件要求苛刻和敏感，对温度、pH、渗透压、剪切力等忍受能力差。培养基要求高，需要添加氨基酸、维生素等，往往需要附加血清，提供生长因子，费用较高。同时可能有潜在的致病因子、免疫原性存在。表达载体的改进和宿主细胞的改造是动物细胞表达系统的研发重要内容。3.昆虫细胞表达系统与特征表达载体为昆虫病毒，转染昆虫细胞，表达出目标蛋白质。昆虫病毒主要有杆状病毒科核多角体病毒。苜蓿尺蠖核多角体病毒秋黏虫细胞表达系统，家蚕核多角体病毒家蚕幼虫表达系统。MicroGeneSys公司表达艾滋病基因工程疫
12、苗，随后猪生长素、CD4膜蛋白及疟疾疫苗、鸡新城病毒疫苗、血吸虫GST疫苗、乙肝表面抗原、重组人GMCSF等。日本批准用家蚕系统生产干扰素已上市。生物试剂盒的标准品大多用昆虫表达系统生产。至少有600多种昆虫可以作为宿主，每年有数百个基因利用昆虫系统进行表达，越来越成为非常有用的表达宿主。优点1）安全：杆状病毒无致病性，产品安全性受FDA认可。2）易饲养：家蚕丧失了野外生存能力，饲养，发育快，3）高量表达：用强启动子，外源基因可超量表达。表达产物在昆虫细胞内能结晶，对产物纯化非常有意义。4）高效表达：可容纳较大的外源基因（12kb），表达数个外源基因，并且正确装配成有功能的分子。如表达抗体的重
13、链和轻链，自主装配成有功能的抗体。5）翻译后的加工：昆虫细胞能进行一系列翻译后的加工，包括糖基化、脂肪酸酰基化、磷酸化、氨基酸的乙酰化、氨酰化等，大部分产物显示出良好的活性。缺点：1）重组率低，筛选困难，周期长，需要410天。2）外源基因的表达在转染的晚期，大约在20h后起始基因表达，在7294h细胞裂解死亡，基因表达时间约3050h，高水平表达不连续且时间短，这对表达不利。3）昆虫细胞糖基化等加工途径与哺乳动物细胞不完全相同，它不提供复杂的N糖基化，如添加半乳糖和唾液酸残基，有可能造成溶解性、稳定性、免疫性等变化。表达水平非常高，加工装备跟不上，蛋白质修饰效率可能不高。研究开发的主要方向：有
14、效的病毒表达载体；决定基因表达时期启动子，无血清培养昆虫细胞系。第二节 基因工程动物细胞系的构建构建高效表达载体转染动物细胞筛选鉴定获得生产用工程化细胞系动物细胞的表达载体：病毒载体，质粒载体。病毒载体：逆转录病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒等载体，对原始病毒改造而来。同源重组构建腺病毒载体，在静止期转染细胞，表达时间较长。痘病毒载体可插入2540kb外源基因，甚至是多个基因。无感染性和致癌性，可用于构建基因工程疫苗。美国Genentech公司已用SV40载体生产乙肝疫苗，其他载体可用于基因治疗。质粒载体：微生物的质粒载体类似，一般是穿梭质粒，具有两个复制子和抗性筛选标记基因。大肠杆菌的复制子
15、，细菌中繁殖。抗生素抗性标记，原核细胞筛选。动物细胞的复制子，在宿主细胞中稳定表达。还有丝状噬菌体复制子。启动子序列：含有RNA聚合酶识别和结合位点，以便有效转录。TATA盒，确定起始位置；GG盒，影响转录频率。来源于病毒、动物基因和噬菌体的启动子。动物病毒启动子：逆转录病毒的长末端重复序列（LTRS）、SV40病毒的早期和晚期启动子、腺病毒的晚期启动子、人巨噬病毒（CMV）立即早期基因启动子。动物基因的启动子：转录因子EF-1启动子、泛素蛋白启动子、-肌动蛋白启动子、干扰素-启动子、IgG启动子、鼠金属硫蛋白基因启动子等。噬菌体T7启动子比动物基因启动子表达水平高。PolyA信号序列：保持m
16、RNA的稳定性，防止降解，保证了转录产物的加工和正确性，但序列不宜太长，避免能量过度消耗。添加PolyA信号和5端转录暂停位点，可以减少上游序列转录通读造成的背景。牛生长素（BGH）基因的PolyA信号比SV40PolyA更强，常用于高效表达载体中。终止序列：AAUAAA或连续的终止密码UGA、UAA和UAG，能防止转录通读，使转录在正确的位点结束。在转录起始点上游或下游使用相同类型的增强子，有利于提高外源基因的转录水平。双顺反子表达载体：两个基因在同一启动子控制之下，内部核糖体进入位点使同一mRNA中的第二个基因得到翻译。将dhfr与目标基因串连，dhfr的cDNA插入内含子中，其转录产物被
17、剪切，翻译不出蛋白质，而目标基因的转录产物得到翻译。顺反子在多亚基蛋白的偶联表达及其控制策略等方面有广泛应用前景。使筛选容易，而且能高效表达。选择适宜的启动子，可实现定向表达。CMV启动子和人EF-1启动子，可实现同一载体上的二个基因的独立表达。组织特异性启动子：如鼠、山羊酪蛋白启动子，可使基因主要在乳腺中表达。N端设计分泌信号肽：如Ig链的可变区和恒定区之间序列，使外源基因的表达产物向胞外分泌。C端设计跨膜锚定序列：可使外源蛋白展示在细胞表面。亚细胞定位信号肽：目标基因产物将转运到细胞核、线粒体、内质网或细胞质中，这对基因的功能研究非常合适。基因的扩增系统：在逐渐提高选择压的情况下，使选择标
18、记基因拷贝数增加，并可连带其两侧序列一起扩增，从而提高表达基因水平。最常用二氢叶酸二氢叶酸还原酶（DHFR）基因系统和谷氨酰氨合成酶（GS）基因系统。氨甲喋呤基因与目标基因重组，氨甲喋呤使dhfr基因与目标基因大量增加，达到数千拷贝。硫胺蛋氨酸使GS系统的基因得到大量扩增。二、受体细胞1人源细胞株系Namalwa：类淋巴母细胞，非整体核型。表达IgM，悬浮生长。外源基因的表达水平较高，可用无血清培养基高密度培养，已成功地表达了rhEPO、rhG-CSF、tPA等。英国Wellcome公司用Namalwa细胞的反应器达8000L，用Sendai病毒诱导，大规模生产干扰素，并批准上市。WI-38：
19、二倍体成纤维细胞系，2n=46，第一个被用于制备疫苗。贴壁生长，对很多病毒敏感，广泛用于疫苗生产。MRC-5：二倍体成纤维细胞系，但生长较WI-38快，对逆境有一定抗性也用于制备疫苗。2哺乳动物细胞株系CHO细胞：中国仓鼠卵巢中分离的上皮样细胞系，贴壁型生长，是目前使用最为普遍和成熟的表达糖基化蛋白药物的宿主细胞。核型为亚二倍体，分泌表达外源蛋白，而内源蛋白分泌很少。贴壁型生长细胞，但可进行悬浮培养，对剪切力和渗透压有较高的忍受能力。蛋白质翻译后的修饰准确，表达产物的结构、性质和生物活性接近天然。有多种衍生突变株应用于药物的生产，培养时需要添加脯氨酸。二氢叶酸还原酶缺陷株表达的药物有tPA、E
20、PO、HBsAg疫苗、G-CSF、凝血因子、DNA酶，已上市。使用氨甲酰喋呤，增加外源基因的拷贝数，提高蛋白质表达水平。BHK21：幼仓鼠肾脏中分离的成纤维样细胞，非整倍体。用于增殖病毒、制备疫苗和重组蛋白。BHK-21表达的重组凝血因子已被获准上市。C127：从小鼠乳腺肿瘤中分离获得的上皮样细胞，贴壁型生长。C127细胞系已表达多种外源基因，其中EPO的水平达10mg/L，生产rhGH已被批准上市。3T3：HINSwiss小鼠胚胎培养物中分离建立的连续细胞系，能大量表达外源蛋白，广泛用于药物毒理学研究。骨髓瘤细胞：J558L是小鼠BALB/c骨髓瘤细胞，分泌IgA，用于转染研究。NSO和SP
21、2/OAg14不分泌Ig，与淋巴细胞融合筛选杂交瘤，分泌制备特异性抗体。杂交瘤细胞：从小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞中分离获得杂交瘤细胞系，能在无血清培养基中高密度悬浮生长，容易转染和生长，能进行糖基化等加工修饰，大量分泌和高效表达。很多杂交瘤细胞系用于抗体的制备。Vero：从成年非洲绿猴肾中分离获得的贴壁型成纤维细胞，多倍体核型，能适应灌流操作，进行连续培养。已有突变细胞系能用无血清培养。最为常用Vero E6增殖多种病毒，如脊髓灰质炎、狂犬病毒、乙脑病毒等，生产病毒性疫苗，已被批准用于人体。也可作为转染的宿主细胞，用于表达外源基因的蛋白质药物和病毒的检测。COS：是从SV40 DNA转化
22、的非洲绿猴肾细胞CV1中分离得到的，广泛用于外源基因瞬时表达的研究。GH3用于生长激素研究，293细胞系用于基因治疗的研究。3昆虫细胞株系Sf21：从秋粘虫卵巢细胞中分离得到，细胞较大，容易放大，高效表达外源基因。Sf9：从秋粘虫的卵巢细胞（SF21）中分离得到，是最常用的昆虫表达细胞。对杆状病毒高度敏感，生长快，能高效表达外源基因。抗机械剪切，能在无血清培养基的搅拌反应器中生长。TN-5B1-4：从粉纹夜蛾卵细胞匀浆中分离得到，无血清培养，快速倍增。分泌表达重组蛋白的能力比Sf9细胞系高20多倍，能适应悬浮培养。三、细胞转染转染（是将外源基因导入哺乳动物细胞的技术通用名称。基因导入真核细胞的
23、方法很多，主要有化学转染、物理转染和病毒介导的转化。方法 表达类型毒性 细胞类型 特点基因枪 瞬时，稳定无 多种细胞组织，器官有效，仪器操作显微注射 瞬时，稳定无 多种细胞 有效，技术难度大电穿孔 瞬时，稳定无 多种细胞 有效，仪器操作冲击波 瞬时，稳定无 多种细胞，局部组织简单有效，仪器操作方法 表达类型毒性 细胞类型 特点逆转录病毒瞬时，稳定无 对应的宿主细胞有效原生质体融合瞬时，稳定无 悬浮细胞 技术复杂生物转染特点化学转染是最常用的转染方法。其基本原理是磷酸钙、二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖（dextran）和阳离子树脂与核酸形成复合物，附着于细胞表面，通过细胞的内吞作用进入细胞。磷酸钙
24、与DNA形成不溶性沉淀，带正电荷的DEAE葡聚糖与带负电荷的DNA磷酸基团结合，阳离子树脂包裹DNA形成脂质体。渗透性休克和DMSO等化学试剂能促进DNA进入细胞。转染试剂盒商业化供应，特别是脂质体材料的转染试剂。影响因素：细胞培养物的密度、DNA的大小、纯度与用量、化学试剂的用量与处理时间、促进剂的使用等。方法 表达类型毒性 细胞类型 特点磷酸钙 瞬 时、稳定无 贴壁细胞，悬浮细胞简单DEAE-葡聚糖瞬时 有CV1，COS简单阳离子树脂 瞬 时、稳定有或无贴壁、原代悬浮细胞简单，有效化学转染的特点四、转染体筛选与分离转染后16天收获细胞，进行核酸分子杂交或蛋白质杂交，检测外源基因的瞬时表达。
25、为了获得稳定整合的细胞系，先在非选择性培养基上培养2448小时，让细胞倍增12代，使转染DNA表达。再按1：15比例转移到选择性培养基上，每24天更换培养基，持续23周，促进抗性细胞生长，清除死细胞残骸，最后得到独立的克隆。在转染中大约有万分之一的细胞将稳定整合外源基因，因此需要显性选择标记来分离转染细胞。哺乳动物细胞的选择标记，使用与之相对应的选择剂。选择剂 基因 使用浓度氨甲喋呤dhfr0.01300mol/L氨喋呤tk0.4mol/L5-溴脱氧尿苷 tk30g/mlG418,Zeocin neo 100800g/ml潮霉素B hyg 10400g/ml杀瘟稻菌素bsd 210g/ml霉酚
26、酸gpt 25g/ml嘌呤霉素乙酰基转移酶0.510g/mlXyl-A ada 4mol/L报告基因 特点 使用与分析方法cat内源活性低，蛋白稳定，线性范围窄，体外，荧光或免疫分析lacZ 有内源活性，X-gal染色，线性范围宽体内外，染色，比色、化学发光或荧光分析碱性磷酸酶分泌型，线性范围宽，受到细胞类型限制体外，比色、化学发光或荧光分析gus蛋白质稳定，线性范围宽，X-Gluc染色体内外，染色，比色、化学发光或荧光分析gfp无内源活性，分子量小，稳定，无需底物，紫外线激发体内外，荧光分析第三节动物细胞培养的需求与培养基的制备动物细胞离体后，失去了消化等系统，不能利用多糖、蛋白质等聚合程度
27、高的化合物。只能利用简单的单体化合物如单糖、氨基酸等，为了维持细胞正常生长，还必须添加维生素、无机盐类、生长类因子及激素、结合蛋白质、贴附与伸展因子及其它附加成分等。动物细胞对培养环境的要求高，不同细胞系的要求也不尽相同，培养基要尽可能与体内生活条件接近。一、动物细胞培养的营养需求1.糖类糖类是细胞主要的营养物质，分解后释放出能量ATP。培养基中都必须添加葡萄糖，有时添加核糖等。提高细胞生长的碳源和能源，主要是葡萄糖和谷氨酰胺。2.氨基酸氨基酸是蛋白质和酶的组成单位。氨基酸还参与合成一些含氮化合物，核苷酸的四种嘌呤和嘧啶碱基、儿茶酚胺等含氮激素及神经递质等。氨基酸可通过生糖或生酮途径转变为糖或
28、脂肪酸，间接提供能量。动物细胞：810种必须氨基酸。离体容易失去，20种氨基酸中至少12种是必需氨基酸：精氨酸、半胱氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸等。谷氨酰胺还可作为重要的碳源和能源而被利用。3.维生素维生素是一类微量的小分子有机生物活性物质，对代谢和生长起调节和控制作用。水溶性维生素包括B族维生素和维生素C。B族维生素以辅酶或辅基形式参与酶反应，主要调节酶活性和代谢活性。维生素C，抗坏血酸，在体内参与还原反应、羟化反应，促进胶原蛋白合成和粘多糖合成，抗氧化作用。脂溶性维生素包括维生素A、D、E、K四种。维生素A维持正常视觉和上皮组织。
29、维生素D为视固醇类化合物，主要是调节钙磷代谢。维生素E即生育酚，是抗氧化剂，防止生物膜中磷脂的不饱和脂肪酸被氧化。维生素K，促进合成凝血酶原，促进血液凝固。5.无机盐类无机盐是细胞代谢所需的酶的辅基，同时保持细胞的渗透压和缓冲pH的变化。Na和Cl参与生理电活动，维持水平衡、保持渗透压和酸碱平衡。离体培养为细胞提供足够的Na和Cl离子是基本条件，一般生理盐水的离子浓度（0.9%NaCl）。Ca2、Mg2，对细胞间的互黏稳定起重要作用。在离体培养时，螯合细胞间的Ca2和Mg2，可以达到分散细胞的目的。磷是核酸、磷脂等的组成成分。碳酸盐缓冲液是重要的体内缓冲体系，与K、Cl等在维持酸碱平衡具有重要
30、作用。6.生长类因子及激素细胞之间是相互联系的，而非孤立的。特别是高度分化功能的动物细胞更是如此。细胞离体生长时，必要添加激素与细胞生长因子等。胰岛素是最常用的激素，促进糖原和脂肪酸的合成，对细胞的生长有刺激作用。其它激素有促卵泡激素、甲状腺素、乳激素、生育酚等。细胞因子有表皮生长因子、成纤维细胞生长因子和神经细胞生长因子，根据不同细胞添加。为了细胞的贴壁生长，必需添加贴附因子，纤维结合蛋白、胶原等，伸展因子如表皮生长因子、成纤维细胞因子等。二、动物细胞培养的环境需求1.水与渗透压细胞生长离不开水，水是细胞反应的重要介质。1）水是一种良好的溶媒，营养物质在水中被吸收，废物在水中被排泄。2）具有
31、热稳定性和导热性，调节稳定温度。正常血浆渗透压主要是无机盐Na、K、Cl、HCO3等构成，蛋白质构成胶体渗透压较小。动物细胞对渗透压有较强的耐受性，常用增减NaCl的浓度调整渗透压，每增加 1mg/ml NaCl，渗透压增加 32mOsm/kg。离体培养细胞的渗透压应控制为等渗透溶液。2.温度不同种类的动物细胞对温度的要求是不同的，变温动物对温度要求没有恒温动物严格。哺乳动物细胞最佳培养温度为37，鸡细胞为3940，而昆虫类细胞为2528。在培养过程中，根据细胞种类选择确定适宜的培养温度。哺乳动物细胞的耐受温度范围较窄，在35-37内能正常进行代谢和生长，超出范围会引起细胞伤害甚至死亡。细胞对
32、低温的耐受性比高温要强，低温抑制生长，但无伤害作用，在冰点温度附近仍能存活。3.氧气动物细胞生长必须有氧气，无氧下，能获得能量供应，但细胞缺氧时不能生存。离体培养的气体含有5CO2和95空气，其中氧浓度为21。有时充以N2气稀释O2浓度。O2浓度在60%以上为高氧环境，对细胞毒性较大。4.pH值动物细胞对pH值很敏感，低于6.8或超过7.6会产生严重影响。机体细胞的pH范围为68，血液和体液中，变化范围很小。人血液pH维持7.36-7.44。pH低于7.05会发生酸中毒，高于7.45发生碱中毒。细胞代谢产生CO2，使培养液变酸，pH发生波动。合成培养基偏酸性，为了稳定pH，可用缓冲体系配制。在
33、开放体系中，CO2逸出，使培养基变碱。通入5CO2，可维持在pH7.2-7.4范围内。5.生长基质改变生长表面特性，促进细胞贴附的物质。贴附细胞生长需要一个支持介质，采用在培养液中添加或在器皿表面覆盖生长基质，帮助细胞的贴附和生长。生长基质为胞外基质成分，多聚赖氨酸、纤维连接蛋白、胶原、层黏蛋白、韧黏素等。生长基质已有商业化产品，用PBS或BBS配成10倍贮存液，在37下包被，静置24小时或室温过夜，对器皿表面进行包被，然后无菌生理盐水洗涤后使用。有些还可以直接加入培养液。生长基质 贮存液浓度 使用浓度 使用方法多聚赖氨酸0.5mg/L 0.05mg/L表面包被纤维连接蛋白10mg/ml 1m
34、g/ml加入培养液层粘蛋白 510g/ml表面包被韧粘素75g/ml 515g/ml包被或加入培养液胶原蛋白13mg/ml 0.1mg/ml表面包被6抗生素动物细胞培养过程中，由于培养基营养丰富，很容易被微生物污染。虽然对使用抗生素仍存在质疑，但还是常添加抗生素，以避免轻度污染。抗生素使用浓度差别很大，一般范围为50100g/ml。在大规模生产中，除了青霉素和-内酰胺类抗生素外，其它抗生素可以使用。抗生素使用对细胞会产生毒性，而且使实验室保留抗药性微生物，应加以注意和克服。抗生素 作用对象工作浓度（g/ml）稳定性（天）两性霉素B真菌12.5 3制霉菌素 真菌50 3氨苄青霉素G、G细菌 10
35、0 3红霉素G细菌，支原体 100 3四环素G、G细菌，支原体10 4庆大霉素G、G细菌，支原体50 5利福平G、G细菌 50 3卡那霉素G、G细菌 100 5链霉素G、G细菌 100 3氯霉素G细菌 5 5青霉素G G细菌 100 3三、动物细胞培养基的种类与组成动物细胞对培养基的要求高，不同细胞系的要求也不尽相同，因此培养基成分复杂而且昂贵。但是要尽可能提供与体内生活条件接近的培养环境。主要组成成分如下：糖类、必需氨基酸、维生素、无机盐类、生长类因子及激素、结合蛋白质、贴附与伸展因子及其它附加成分等。不同细胞对葡萄糖利用相似，但对氨基酸的利用相差很大，不同的细胞过程对氨基酸的需求存在差别。
36、目前停留在流加谷氨酰胺上。血清：蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素和生长因子等。胎牛血清、新生牛或成牛血清、马血清、鸡血清、羊血清及人血清，最广泛应用的为胎牛血清和新生牛血清。水解乳蛋白和胶原富含氨基酸。血清和水解酪蛋白应用于许多细胞系和原代及传代细胞培养。脂类化合物对动物细胞培养是必需的，实际中类脂及其前体和血清常平行使用。添加的蛋白质试剂主要有铁传递蛋白，起离子载体的作用，有时用无机铁盐代替。胰岛素起生长素的作用，白蛋白起保护剂作用。其他附加成分如核苷类及丙酮酸盐等是培养基的必需成分，有助于细胞克隆和特异化细胞的培养。动物细胞培养过程中，被微生物污染。常添加抗生素，以避免轻度污染。1.天然培养基
37、直接取自于动物组织提取液或体液作为培养基，如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸出液等。营养价值高，成分复杂，不稳定，来源受到限制，不宜大量培养和生产使用。2.合成培养基合成培养基用化学成分明确的试剂配制的培养基，组分稳定。现在已有几十种合成培养基，大部分已商品化。组成：无机盐、糖、氨基酸、维生素及其他成分。由于细胞种类和培养条件不同，所用合成培养基也不同，在动物细胞培养中最常用培养基有78种。3.无血清培养基无血清培养基是全部用已知成分组配的、不加血清的合成培养基。在含有营养和贴壁因子的基础培养基中，加入适宜的细胞生长因子，细胞良好生长，适合于制药生产。无血清培养基提高了培养的质量，避免了使用血清
38、带来的麻烦，产品纯化容易，组分稳定，可大量配制。无血清培养基通常需要添加激素与生长因子、结合蛋白、贴壁与伸展因子、低分子营养成分等。大多数无血清培养基含有蛋白质和激素等大分子物质，适宜于多种细胞系的培养。对于大规模生产用的无血清培养基，往往成分不完全清楚，但简单而且低成本。四、培养基的控制1.培养用水质细胞培养水质最低要求电导率在1X106cm以上。水存放时间不宜超过2周。对于制药，必需使用纯净水配制培养基，普通水必需除去各类元素有毒或有害物质及微生物，还必需除热源，达到纯净水标准。2.缓冲液缓冲液：弱酸与弱酸盐或弱碱与弱碱盐组成的，pH恒定但不干扰试验。不同种类细胞对pH要求不一致，不同生长
39、阶段对pH要求也不同。原代细胞pH要求严格，而传代细胞要求较宽。细胞培养过程中代谢产生酸性物质，使培养基的pH不断下降。缓冲液中和培养液中的酸性物质。最广泛使用为碳酸氢钠/碳酸,其次为磷酸二氢钠/磷酸氢二钠，调节二者的比例，配制成不同pH缓冲液。碳酸盐缓冲液除了直接的缓冲作用外，还有间接作用，碳酸生成挥发性CO2后很快逸出。细胞呼吸产生的CO2与水形成碳酸，任何碱在培养液中都被中和，生产相应碳酸氢盐其他缓冲液:Tricine-Glycine、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、HEPPSO等等有机缓冲液，缓冲能力强。Tris所含氨基具有高的化学反应活性，能抑制细胞生长，并通过生物膜，它调
40、节pH要依赖于温度的变化，因此不宜作为培养液。离体培养中，缓冲液多为平衡盐溶液的重要组分之一，很少单纯使用。3.生理盐水与平衡盐溶液在缓冲液的基础上，添加调节渗透压的盐类，在一定程度上能满足细胞对pH和盐离子要求。缓冲液或缓冲盐溶液用于:配制溶液,处理细胞的溶液。对于直接接触、长期培养的培养液，常用生理盐水和平衡盐溶液，是渗透压与胞浆渗透压平衡的溶液。生理盐水供给细胞水分和各种离子，维持一定渗透压，并能良好溶解试剂和药物。有各种不同成分的生理盐水，分别加入pH缓冲剂与指示剂、葡萄糖，形成平衡盐溶液。平衡盐溶液：集缓冲液的缓冲能力、生理盐水的等渗能力、营养供给为一体，具有多种功能和作用。BSS配
41、制：1）先分别溶解CaCl2、MgCl2、MgSO4。2）在另一容器中依次溶解其他试剂。3）在另一容器中用5.6%NaHCO3数滴溶解酚红。4）将含Ca2+、Mg2+溶液缓慢倒入步骤2配制的溶液中，搅拌，防止沉淀。5）再加入酚红溶液。6）补足水，并用NaHCO3调节pH。含葡萄糖的BSS过滤除菌，不含葡萄糖时常规高压灭菌。小量培养液可置4度保存。一旦出现沉淀，要重新配制。注意事项：细胞只利用L型氨基酸，不能利用D型，对于DL混合型氨基酸，使用量应该加倍。谷氨酰胺溶液中很不稳定，要单独配制成浓缩液。NaHCO3一般配成3.7、5.6%、7.4%三种浓度，过滤除菌或高压灭菌，4度保存，使用前加入，
42、调节培养基pH。为了优化细胞生长环境，还添加其他成分，如嘌呤和嘧啶类，维生素C、谷胱甘肽、巯基乙醇。一般情况下，培养基成分如氨基酸、维生素、葡萄糖、缓冲液等、补充因子几类，先配制成高倍浓缩的母液，过滤灭菌，冷藏。使用时按一定比例稀释，配制成工作液。第二节动物细胞增殖生长的动力学过程一、单细胞生长增殖周期从一个细胞分裂形成两个新细胞的过程为一个细胞周期或一个细胞世代。单个细胞周期包括细胞间期、细胞分裂期，间期又包括间期1、DNA合成期和间期2三个时期。不同的细胞类型其分裂周期及各期的时间都不同，培养条件及培养基成分也会影响细胞周期,一般地动物细胞分裂周期为1248小时,典型的细胞周期为24小时。
43、对连续细胞系，失去了细胞周期控制，人工培养条件不适，细胞将发生程序化死亡即凋亡。在培养过程中，缺乏生长因子或血清、营养受限和逆境等可引发凋亡发生。二、细胞群体的生长过程细胞群体生长增殖过程与微生物的生长增殖过程相似1.潜伏期，细胞经历一段悬浮状态，贴附于器皿表面。2.对数生长期：细胞分裂旺盛，指数增加。细胞相互接触汇合成片，接触抑制，限制分裂和运动，密度不再增加。3.静止期：分裂数与死亡数相等的相对动态平衡时期。4.衰亡期：细胞死亡数目大于分裂数目的时期。三、群体细胞生长的动力学参数细胞分裂代数G就可用下列公式计算：GlogNlogN0）/log2第四节动物细胞的分离与培养一、细胞的种类生物体
44、是由多种多样的分化细胞构成，如人体的细胞类型达200余种。这些细胞都是由受精卵分裂产生的细胞后代生长增殖分化而来。不同细胞具有不同的功能，细胞分化异常导致癌变。分化程度越高，脱分化的能力越差。在胚胎发育过程中，高等动物细胞的分化是由全能性变成多能性，再变成单能性，进而失去再分化的能力。虽然成熟细胞不能再分化，但其细胞核仍然具有全能性，因此可以通过核移植，克隆动物。体外培养细胞，可分为原代细胞系、传代细胞。原代培养：从体内取出的组织细胞进行体外接种培养，原代培养的细胞为原代细胞，它生长分裂并不旺盛，与体内细胞相似，适合于药物检测实验。生产中有些产品仍沿用原代细胞，如鸡胚细胞，兔或鼠肾细胞、淋巴细
45、胞。传代细胞:原代细胞转接后培养的细胞。传代后，细胞分裂增殖旺盛，能保持一致的二倍体核型，所以又成为二倍体细胞系。传代细胞的增殖能力有限，所以也称为有限细胞系。如WI38、MRC5、2BS等用于生产。根据细胞的传代次数和寿命，可分为有限细胞系和无限细胞系或连续细胞系。有限细胞系:正常细胞经过多次传代后，一般可连续培养3050代，就会逐渐失去增殖能力，也就是说它们只能生长有限的时间，经过若干传代培养后将老化死亡。无限细胞系：当细胞经过自然或人为的因素转化为异倍体后，才能变为无限细胞系。如肿瘤细胞就是自发形成的永久细胞系，没有分裂次数的限制。物理、化学或生物因素也能获得。细胞寿命无限，生长不受细胞
46、密度的影响，倍增时间短不具接触抑制现象，它对培养条件和生长因子等要求低，非常适合于工业化生产，理想的药物生产细胞系。根据细胞对生长特性和对基质的依赖性，可分为贴壁依赖性细胞和非贴壁依赖性细胞。贴壁依赖性细胞：生长需要在适量带电荷的固体或半固体支持表面，细胞自身分泌或人为在培养基中加入贴附因子，使细胞依附在支持物表面，才能生长和增殖，大多数动物细胞都属于此类。非贴壁依赖性细胞：生长不依赖于固体支持物表面，可在培养液中悬浮生长，有时被称为悬浮细胞。血液、淋巴细胞、肿瘤细胞和某些转化细胞属于此类，生长干扰素的Namalwa细胞。有些细胞对支持物的依赖性不严格，可贴壁生长，可悬浮生长。中国仓鼠卵巢细胞
47、、小鼠L929细胞、BHK细胞。二、工程细胞的获得与保存目前用于制药的动物细胞有4类，即原代细胞系、二倍体细胞系、异倍体细胞系和融合的或重组的工程细胞系。细胞无限传代，使大规模工业化生产药物成为可能。异倍体细胞用于产生重组基因工程产品，使动物细胞成为药物生产的一个新领域。1.原代细胞系的分离与培养用原代细胞系生产药物需要大量的动物。动物组织或器官洗涤粉碎酶解消化离心或过滤接种培养 培养液稀释细胞 洗涤37度消化，检查是否充分和完全。胰蛋白酶：细胞间质较少的软组织，胚胎、肝、肾及传代细胞胶原酶：纤维、上皮、癌组织工作浓度：0.1-0.3mg/ml链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶2.传代细胞培养长满器
48、皿表面的细胞进行分离，接种到新的培养基上，进行新一轮培养。掌握好最佳时期：刚刚全部汇合的细胞，过早产量低，过晚健康状态不佳。过程与原代细胞相同，用3050倍体的0.25胰蛋白酶和EDTA对细胞块消化，消化后再培养。要注意消化程度，细胞对酶的反应不同，有的敏感，掌握好适宜的消化时间和方法，不要过度，获得细胞浓度均匀，生长速度一致的传代细胞。曾经广泛应用，但不是理想的生产细胞系3.细胞系的建立与保存一旦获得了稳定的有一定特性的细胞系，就建立细胞库，进行长期保存。根据药品生产的有关规定，必须建立原始细胞库和生产用细胞库或工作细胞库。WCB1QCWCB2QCQC原始培养物MCBQC内容：细胞活性检测、
49、无菌实验、核型、DNA分析、同工酶分析、支原体试验、其他外源物试验、稳定性和基因型分析等，工作细胞库必须与主细胞库完全一致。低温冷冻保存：用冷冻保护液（含10血清的培养液，附加10甘油或7.5%-10%二甲基亚砜）细胞预冷，稀释成106细胞/ml。分装，火焰下封口。缓慢冷冻，细胞放入CO2低温冰柜或液氮中，温度为-150-190，细胞的全部活动几乎处于停止状态。复苏细胞：冷冻细胞取出，立即在37水浴中，快速融化。在保护剂存在下，慢冻快融是保存复苏细胞的要领。融化后的细胞可用于进一步实验。三、大规模培养方法根据动物细胞的生长特点，只能采用悬浮培养、贴壁培养、固定化培养等三种主要方法进行大规模培养
50、。1.单层贴壁培养细胞贴附于一定的固体支持表面上，进行的培养方法。大多数动物细胞属于贴壁依赖性，贴壁培养是动物细胞培养的一种重要方法。接种后，细胞经过吸附、接触而贴附于基质表面，然后进行生长、分裂繁殖，很快进入对数期。一般数天就长满整个表面，形成致密的单层细胞。贴壁培养容器:转瓶、玻璃珠、微载体和中空纤维等。滚瓶是为早期培养所采用，结构简单，投资少，重复性好，但劳动强度大，占用空间大，产量低，不易控制和监测。细胞贴壁原理：细胞主要靠静电引力和范德华力贴附在固体表面，因为动物细胞在生理状态下带负电，贴壁培养的固体表面要求具有正电荷和高表面活性。适宜的电荷密度是粘附和贴壁的关键，电荷密度低，不能有