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1、-781-中华生殖与避孕杂志 2019 年 10 月第 39 卷第 10 期 Chin J Reprod Contracep,October 2019,Vol.39,No.10规范与标准应用胚胎植入前遗传学检测技术阻断常染色体显性多囊肾病遗传的中国专家共识PGT 阻断 ADPKD 遗传专家共识委员会通信作者：李文，Email：；曹云霞，Email：；梅长林，Email：【摘要】常染色体显性多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)是最为常见的遗传性肾病，主要由 PKD1 和 PKD2 基因突变所致。该疾病的主要病理特点是肾脏
2、囊肿进行性增大增多，破坏正常肾脏结构，最终导致终末期肾病。患者只能依靠透析或肾移植维持生命，给家庭和社会带来沉重负担。应用胚胎植入前遗传学检测技术(preimplantation genetic test，PGT)阻断 ADPKD 致病基因遗传可极大地降低患儿出生率，提高我国出生人口素质。为明确 PGT 阻断 ADPKD 遗传的适宜患者人群，规范 PGT 阻断 ADPKD 遗传的诊治流程，我们会同国内相关肾脏病和生殖遗传专家，结合我国 PGT的临床实践，共同讨论和制定本专家共识，供临床应用参考。【关键词】常染色体显性多囊肾病；胚胎植入前遗传学检测；遗传阻断；专家共识基金项目：“十三五”国家重点
3、研发计划“罕见病临床队列研究”项目(2016YFC0901502)；国家自然科学基金(81670612，81873595)；上海市重中之重临床重点学科建设基金(2017ZZ02009)DOI：10.3760/cma.j.issn.2096-2916.2019.10.001A Chinese experts consensus on blocking the inheritance of autosomal dominant polycystic kidney disease with preimplantation genetic testExpert Consensus Committee
4、of Blocking ADPKD Inheritance by PGT Corresponding author:Li Wen,Email:;Cao Yunxia,Email:;Mei Changlin,Email:【Abstract】Autosomal dominant polycystic kidney disease(ADPKD)is the most common hereditary kidney disease,and mainly caused by mutations in PKD1 and PKD2 genes.The main pathological features
5、of ADPKD are progressive enlargement of renal cysts,destruction of normal renal structure,and eventually leading to end-stage renal disease.Many patients have to maintain life with dialysis or kidney transplantation,which brings heavy burden to the influenced families and society.Blocking the inheri
6、tance of ADPKD with preimplantation genetic test(PGT)can significantly reduce the incidence of ADPKD and improve the quality of population.In order to identify the suitable patients for blocking ADPKD inheritance with PGT and standardize the diagnosis and treatment process of blocking ADPKD inherita
7、nce with PGT,we discussed and formulated this expert consensus together with relevant domestic kidney disease and reproductive genetic experts,combined with the clinical practice of PGT in China.【Key words】Autosomal dominant polycystic kidney disease;Preimplantation genetic test;Blocking inheritance
8、;Expert consensusFund program:National Key Research and Development Program of China(2016YFC0901502);National Natural Science Foundation of China(81670612,81873595);Shanghai Top Priority Key Clinical Disciplines Construction Project(2017ZZ02009)DOI:10.3760/cma.j.issn.2096-2916.2019.10.001常染色体显性多囊肾病(
9、autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)是 最 常 见 的遗传性肾病，患病率约 1/1000。患者多在成年后双侧肾脏出现囊肿，随年龄增长，逐渐长大的囊肿压迫正常肾组织，损害肾脏结构和功能。60 岁时，约 50%患者进展至终末期肾病(end-782-中华生殖与避孕杂志 2019 年 10 月第 39 卷第 10 期 Chin J Reprod Contracep,October 2019,Vol.39,No.10stage renal disease，ESRD)，是 ESRD 的第四大病因。ADPKD 还可引起肝囊肿、心脏瓣膜病、颅内
10、动脉瘤等肾外病变1-2。临床上，缺乏有效治疗 ADPKD 的药物和措施，多以对症支持治疗为主。新近一些国家批准托伐普坦(tolvaptan)治疗ADPKD，但从有效性和安全性考虑，该药仅适用于部分快速进展型 ADPKD 患者3-4。ADPKD 是一种单基因遗传病，主要致病基 因 有 2 个，分 别 称 为 PKD1 和 PKD2。近 来报 道 GANAB 和 DNAJB11 基 因 突 变 也 可 引 起ADPKD5-6。该病可遗传至子代，子代发病概率为50%1。传统的产前诊断仅能在孕中晚期通过彩色超声诊断技术、绒毛或羊水细胞进行基因检测，无论终止妊娠与否，均给孕妇及家庭带来极大的身心痛苦。胚
11、 胎 植 入 前 遗 传 学 检 测(preimplantation genetic test，PGT)是将遗传检测与辅助生殖相结合的一项技术，通过体外受精、培养，对体外形成的胚胎进行基因检测和信息学分析，挑选不携带致病基因、基因组拷贝数正常的胚胎移植入母体内，获得健康的婴儿，阻断致病基因遗传给子代7。应用 PGT 阻断 ADPKD 致病基因遗传可极大地降低患儿出生率，提高我国出生人口素质8。为了规范和推广 PGT 阻断 ADPKD 遗传技术，我国肾脏病和生殖遗传专家组成专家委员会，结合我国 PGT 技术的临床实践，共同讨论和制定本专家共识，供临床应用参考。1 ADPKD 诊断1.1 ADPK
12、D 临床诊断 ADPKD 诊断标准如下：ADPKD 家族遗传病史，大约 80%患者有家族遗传病史9；影像学检查显示双肾体积增大，有多个大小不一囊肿，B 超检查诊断标准见表 110。同时具备此 2 项即可确诊 ADPKD。若无家族遗传史或影像学检查不典型，需进行 PKD1/PKD2 基因突变检测，突变检出率约 90%11。1.2 ADPKD 基因诊断 PKD1 和 PKD2 是引起ADPKD 的 2 个主要致病基因。PKD1 位于 16 号染色体(16p13.3)上，有 46 个外显子，其蛋白产物称为多囊蛋白 1(polycystin1，PC1)，由 4303 个氨基酸残基组成，属于完整的膜蛋白
13、，包含细胞外段、11 个跨膜区和细胞内段12。约 85%ADPKD 患者由于 PKD1 基因突变所致13。PKD2 位于 4 号染色体(4q22.1)上，编码蛋白产物为 968 个氨基酸残基组成的多囊蛋白 2(polycystin 2，PC2)，主要功能是二价离子(Ca2+)通道12。约 15%ADPKD 患者由于 PKD2 基因突变致病13。PKD2 导致 ADPKD起病比 PKD1 引起的晚 20 年，病情也较轻13-14，故应用 PGT 阻断 ADPKD 致病基因遗传主要针对PKD1 突变引起的患者。PKD1 基因已被发现数十年，但由于其结构复杂性使得 ADPKD 基因诊断难以突破15。
14、PKD1 基因 5 端 133 外显子区域内存在 6 个同源性在 98%以上的假基因，外显子1区域内GC占比高(85%)，内含子 21 区域内还有一段较长的多聚嘧啶序列，使 PKD1 极易发生不均衡重排及基因转换，这些结构特点也使得 PKD1 无突变热点16-17。PKD2 在结构和序列上要简单得多，也比较便于基因突变检测。随着长链 PCR 技术改进和二代测序应用，ADPKD 患者中 PKD1/2 致病基因突变检出率已达到 90%11。1.2.1 基因检测对象 基因检测适用于无家族史散发的 ADPKD 患者；影像学检查表现不典型；ADPKD 家族史阳性的活体肾脏捐献者；儿童ADPKD 疑似患者
15、的早期诊断以及生殖遗传咨询等。抽取患者外周血进行 PKD 基因检测，并采集临床特征，以验证突变与疾病表型的相关性，确定突变的致病性。同时选择患者父代和子代直系亲属作为检测结果的验证对象(包括父母及子女，如无父母及子女可考虑同父母兄弟姐妹)。1.2.2 样本采集 采血前患者不需要空腹，具体抽血时间没有特别限制。抽血时使用EDTA抗凝管，抽取 5 mL 全血，混匀后静置，4 保存送检。1.2.3 检测方法 利用长链 PCR 和二代测序技术进行 PKD 基因突变位点检测，检测出的突变位点均需利用 Sanger 测序来进一步验证突变位点的真实性。对于 PKD 基因突变位点检测阴性样本，表 1 ADPK
16、D 超声诊断标准和排除标准10 年龄(岁)诊断标准 排除标准15394059 60无每侧肾囊肿 2 个每侧肾囊肿 500 mg/24 h；合并其他可能由于妊娠或辅助生殖操作而加重的疾病或功能异常(如肝、肾功能异常等)。3.2 术前准备 生殖医师详细询问患者家族遗传病史、先证者情况，致病基因检测方法及结果，孕产史，建立病历档案，保存资料；审查二证合格(身份证、结婚证)；排除禁忌证，对患者所提供的疾病基因位点检测结果，结合患者家系血液样本进行再次验证和胚胎植入前遗传诊断预实验(参见5.2 PGT 检测前的验证及 5.3 检测方法部分)。3.3 控制性超促排卵 根据女方卵巢功能评估选用适当的超促排卵
17、方案。需根据患者多囊肾病病情适当调整用药，特别是女方为多囊肾病患者，如存在肾功能损害，应酌情降低促排卵药物用量，避免加重肾脏负担。3.4 取卵 卵泡成熟后按照辅助生殖技术程序经阴道超声引导下穿刺取卵。应进行多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)检测，以明确是否存在大片段重复/缺失突变18。对于检测出的突变位点，建议进行家系位点验证，以进一步明确致病性。进行基因检测的实验室必须经过相关部门的基因检测技术审核；检测人员需要有基因检测和数据分析的资质；实验室内部要有完善的方法学验证及质量控制体系。1.2.4
18、基因检测结果的分析与解读 结合 2015 年美国医学遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)针对突变位点制定的分类标准19，以及 PKDB 数据库对PKD 基因突变的分类(http:/pkdb.mayo.edu/)，可将检出的突变分为以下 2 类。1.2.4.1 明确致病突变 PKDB 数据库中收录的明确致病突变；突变类型为无义突变，典型剪切位点突变，移码突变(非 3 倍碱基插入或缺失)，大片段缺失或重复的新发突变，并可通过家系验证明确致病性。1.2.4.2 非明确致病突变 PKDB 数据库收录的非明确
19、致病突变(如极可疑致病突变、可疑致病突变、疑似良性突变、良性突变)；突变类型为同义突变、错义突变、非典型剪切位点突变、非移码突变(3 倍碱基插入或缺失)、内含子突变(非剪切位点)的新发突变，可利用PolyPhen-220、SIFT21 和 Mutation22 等软件评估致病可能性，但仅可作为参考，需进一步功能验证及家系连锁验证。检测出明确致病突变的 ADPKD 患者，当其具有 ADPKD 家族史时，推荐实施 PGT 阻断ADPKD 遗传；当其不具有 ADPKD 家族史时，建议利用单精子扩增与胚胎互推策略，实施 PGT 阻断 ADPKD 遗传。检测出非明确致病突变的 ADPKD 患者，建议充分
20、评估该突变的致病性(软件评估和家系连锁验证)，并在充分遗传咨询的基础上，考虑是否利用 PGT 阻断 ADPKD 遗传。2 遗传咨询和知情同意2.1 遗传咨询 患者夫妇选择行 PGT 阻断 ADPKD-784-中华生殖与避孕杂志 2019 年 10 月第 39 卷第 10 期 Chin J Reprod Contracep,October 2019,Vol.39,No.104 胚胎实验室的显微操作4.1 授精方式 建议采用卵胞质内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)授精方式，以最大限度地减少母源颗粒细胞和父源精子对下游遗传学检测准确性的干扰。4
21、.2 胚胎活检 囊胚活检对胚胎发育的潜在影响较小，已成为目前主要活检方式。囊胚期活检是在授精后第 56 日、囊胚充分扩张后进行。建议活检囊胚评分 4BC，通常活检后的囊胚需立即冷冻保存，待胚胎遗传学分析完成后，择期对染色体拷贝数正常、不携带亲代基因突变的胚胎进行复苏移植。4.2.1 透明带打孔 透明带打孔方法有机械法和激光法。目前激光法更为常用。在活检时应尽量避免对细胞造成热损伤。囊胚活检透明带打孔可以在授精后第3日、第5日、活检前4 h或活检时进行。4.2.2 活检细胞的数目 囊胚活检采集的滋养细胞数目应控制在 510 个。4.2.3 重复活检 二次活检、反复活检将影响胚胎的发育潜力，但在首
22、次活检诊断不明时，可以考虑二次活检；如果胚胎活检后已冷冻，可考虑复苏后再次活检。4.2.4 囊胚活检部位 囊胚活检应选择远离内细胞团的部位。4.3 活检胚胎的冷冻 在等待遗传学检测结果时，需要对活检后的胚胎进行冷冻保存。建议采用玻璃化冷冻技术，活检后的卵裂期或囊胚期胚胎的冷冻方法与常规胚胎冷冻方法相同。4.4 活检样本的预处理 利用核酸扩增法进行遗传学检测，活检所移取的细胞经过洗涤后应放入含有 2.5 L 磷酸盐缓冲液(或遗传检测试剂盒所要求的预装试剂)的 PCR 管中，同时移取少许洗涤液到空白 PCR 管中作为空白对照。4.5 胚胎活检生物样本的储存和运输 4.5.1 胚胎活检样本的运输 胚
23、胎活检样本在 4 8 冷藏条件下冷链运输，运输时间建议在4 h内。如在 0 以下冷冻运输不超过 72 h。4.5.2 胚胎活检样本的储存 已进行全基因组扩增的胚胎样本应长期保存在-80，保存过程中避免反复冻融。4.6 胚胎活检实验室的质量控制4.6.1 胚胎活检环境的质量控制 同 ICSI 体外胚胎操作实验室标准，在百级层流、37 恒温、覆盖于无菌矿物油下的无菌培养液滴中进行。为减少胚胎之间的相互污染，必须确保每个微滴中仅包含一个胚胎，活检针和活检材料转移吸管必须无活检细胞成分的残留。4.6.2 胚胎活检人员的质量控制 胚胎活检技术人员应具备熟练的 ICSI 操作经验，在操作中全程遵循严格的无
24、菌原则，以防外源性污染。4.6.3 编号 胚胎活检的细胞及其在整个检测流程中需具有清晰且唯一的编号，与胚胎一一对应。4.6.4 核对 所有实验操作过程中需要严格的双人核对，实时记录并签字。5 实验室的遗传检测5.1 检测策略和原则要求5.1.1 检测策略 对胚胎细胞进行 PKD 基因突变位点检测时，为避免扩增失败、优势扩增、等位基因脱扣(allele drop-out，ADO)、样本污染等因素引起的误诊或诊断不明，建议联合使用突变位点的直接测序和遗传多态位点的连锁分析2种方法。5.1.2 单核苷酸多态位点连锁分析 单核苷酸多态位 点(single nucleotide polymorphism
25、，SNP)所 能用于连锁分析的位点较多，能提供更准确、更全面的信息。建议对胚胎细胞进行连锁分析时采用SNP 连锁分析。5.1.3 SNP 位点选择策略 建议在 PKD 基因致病突变位点上、下游 2 Mb 的范围内分别选择至少3 个可提供遗传信息的多态位点，同时避免选择同源性高、相邻序列中 GC 含量高或有多聚核苷酸序列的 SNP 位点。5.1.4 连锁分析注意事项 在进行遗传多态位点连锁分析时，需注意突变位点附近的基因组重组，如果发现有基因重组情况，应该缩小 PKD 基因致病突变位点上、下游连锁分析距离进行连锁分析。5.2 PGT 检测前的验证5.2.1 突变位点验证 在检测前，需要在家系样本
26、中对已知致病突变进行验证。5.2.2 构建单体型连锁模型 应选择突变位点上、下游的多态位点，在家系样本中进行连锁分析，-785-中华生殖与避孕杂志 2019 年 10 月第 39 卷第 10 期 Chin J Reprod Contracep,October 2019,Vol.39,No.10从中选择能够提供遗传信息的位点建立单体型连锁关系。5.2.3 单细胞预验证 在实施检测前，需要在单个细胞上验证方案的有效率，评估目标检测位点扩增的有效性以及 ADO 率。5.2.4 预验证样本选择 验证样本可采用淋巴细胞、颗粒细胞、口腔黏膜细胞、胚胎细胞、精子等，应注意来源的细胞可能影响扩增的效率和ADO
27、率。5.2.5 预验证重复 采用全基因组扩增(whole genome amplification，WGA)法进行扩增，建议至少在 10 份验证样本中进行预验证检测。5.2.6 预验证质控 扩增效率应 90%，ADO 率应 10%。若 ADO 率较高，可适当增加上、下游的连锁遗传多态位点进行分析。5.3 检测方法5.3.1 单细胞 WGA 方法 目前采用的单细胞WGA 方法主要有以下 3 种23，即简并寡核苷酸引 物 PCR 扩 增(degenerate oligonucleotide-primed polymerase chain reaction，DOP-PCR)、多重置换扩增(multi
28、ple displacement amplification，MDA)和多次退火环状循环扩增(multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC)。5.3.2 MALBAC 技术 MALBAC 是一种新型的全基因组扩增技术，经 MALBAC 扩增后测序的人类基因组在平均 25 测序深度下可达 93%的覆盖率，扩增产物应用于高通量测序及全基因组范围的染色体遗传分析24-25。5.3.3 WGA 后检测 WGA 扩增的产物可采用多种方法进行突变位点及遗传连锁位点的鉴定，包括荧光定量 PCR、Sanger 测序、单核苷酸多
29、态微阵列芯片(SNP array)、高通量测序(next generation sequencing，NGS)以及联合检测等。5.3.4 联合检测 目前，通过 PGT 可将特定基因突变与染色体非整倍性检测相结合，同时避免染色体异常和单基因遗传病，建议采用联合检测方法。检测结果需要 2 人独立分析判读，最后由第 3人审核判断。未达成一致意见的胚胎应判读为诊断不明。诊断不明的胚胎不建议移植。5.4 检测报告 检测报告需包括患者夫妇的姓名、年龄、检测指征、胚胎编号、胚胎活检阶段、活检日期、检测方法和项目、检测结果(含胚胎致病基因携带与胚胎染色体拷贝数变异)、检测者、审核者、报告日期及备注说明。除医疗
30、目的性别鉴定外，报告不准提示胚胎的性别。6 胚胎移植及随访6.1 胚胎移植前咨询 医疗机构向患者夫妇解释各个胚胎的检测结果，根据检测结果告知胚胎的处置方式并根据具体情况为患者提供建议。对于结果为可移植的胚胎，应告知其不排除误诊的可能。不携带致病基因突变但为染色体嵌合的胚胎，经充分知情同意后，可作为备选移植胚胎。6.2 胚胎移植 建议行单胚胎移植。根据女方月经周期、宫内环境、激素水平等情况，择期行可移植胚胎复苏移植。黄体支持等后续处理同其他体外受精-胚胎移植患者。对于女方为多囊肾病患者，黄体支持应选择对肝肾功能无影响或影响尽量小的药物及给药途径。6.3 随访6.3.1 产前筛查 胚胎移植后获得持
31、续妊娠者，在妊娠 1820 周抽取 2030 mL 羊水进一步做产前诊断。产前诊断结果与胚胎检测结果符合率应为100%。现阶段不建议采用无创产前筛查的方法。6.3.2 随访内容 包括妊娠情况，产前诊断结果，妊娠结局以及胎儿、新生儿情况等。远期随访同其他体外受精-胚胎移植患者。7 PGT 阻断 ADPKD 遗传的流程(图 1)7.1 进入 PGT 流程前 ADPKD 患者进行 PKD 基因检测，明确致病突变位点，进行生殖遗传咨询，决定是否进行 PGT 阻断 ADPKD 遗传，并签署知情同意书。7.2 进入试管周期前 验证 PKD 基因致病突变位点，完善家系连锁分析，进行 PGT 单细胞预实验。生
32、殖中心完善辅助生殖前筛查。7.3 体外受精形成囊胚 签署知情同意，制定助孕方案促排卵，取卵并进行体外受精形成囊胚。7.4 胚胎PGT 检测 对胚胎囊胚期细胞进行活检，活检样本质控处理后进行突变位点检测及连锁分析，挑选出不携带致病突变位点的正常胚胎。7.5 胚胎移植及产前产后诊断 将挑选出的正常胚胎移植到母体内。若正常妊娠，则定期随访，孕-786-中华生殖与避孕杂志 2019 年 10 月第 39 卷第 10 期 Chin J Reprod Contracep,October 2019,Vol.39,No.101820 周进行羊水穿刺，产前筛查以排除胎儿携带致病突变位点，胎儿出生后可利用脐带血进
33、行突变位点检测以排除。若未妊娠，则选择其它正常胚胎植入，或重新进入促排卵周期，挑选正常胚胎植入。主 审：乔杰 执笔专家：孙宁霞 马熠熠 徐德超PGT 阻断 ADPKD 遗传专家共识委员会(以姓氏笔画为序)生殖专家：王秀霞(中国医科大学附属盛京医院)；王晓红(空军军医大学第二附属医院)；吕群(四川省人民医院)；刘平(北京大学第三医院)；刘芸(解放军联勤保障部队第九 OO 医院)；孙海翔(南京鼓楼医院)；李尚为(四川大学华西医院)；李艳萍(中南大学湘雅医院)；陈大蔚(安徽医科大学第一附属医院)；杨菁(湖北省人民医院)；何畏(陆军军医大学西南医院)；沈鉴东(江苏省人民医院)；张松英(浙江大学医学院附
34、属邵逸夫医院)；张学红(兰州大学第一医院)；张清学(中山大学孙逸仙纪念医院)；茅彩萍(苏州大学附属第一医院)；林戈(中信湘雅生殖与遗传专科医院)；郝燕(安徽医科大学第一附属医院)；郝桂敏(河北医科大学第三医院)；徐艳文(中山大学附属第一医院)；徐家伟(郑州大学第一附属医院)；高颖(华中科技大学同济医学院附属协和医院)；商微(解放军总医院第六医学中心)；靳镭(华中科技大学同济医学院附属同济医院)；颜军昊(山东大学附属生殖医院)。肾脏病专家：丁国华(湖北省人民医院)；马熠熠(海军军医大学第二附属医院)；王荣(山东省立医院)；王悦(北京大学第三医院)；王莉(四川省人民医院)；毛海萍(中图 1 PGT
35、 阻断 ADPKD 遗传的流程图-787-中华生殖与避孕杂志 2019 年 10 月第 39 卷第 10 期 Chin J Reprod Contracep,October 2019,Vol.39,No.10山大学附属第一医院)；卢国元(苏州大学附属第一医院)；付平(四川大学华西医院)；邢昌赢(江苏省人民医院)；庄永泽(解放军联勤保障部队第九 OO 医院)；刘天喜(兰州大学第一医院)；刘虹(中南大学湘雅二医院)；刘章锁(郑州大学第一附属医院)；孙脊峰(空军军医大学第二附属医院)；李华(浙江大学医学院附属邵逸夫医院)；李英(河北医科大学第三医院)；李明旭(解放军总医院第六医学中心)；李荣山(山西
36、省人民医院)；李贵森(四川省人民医院)；李德天(中国医科大学附属盛京医院)；肖湘成(中南大学湘雅医院)；吴永贵(安徽医科大学第一附属医院)；余学清(中山大学附属第一医院/广东医科大学)；张苗(南京鼓楼医院)；张春(华中科技大学同济医学院附属协和医院)；郁胜强(海军军医大学第二附属医院)；罗琰琨(山西省人民医院)；赵洪雯(陆军军医大学西南医院)；徐安平(中山大学孙逸仙纪念医院)；徐钢(华中科技大学同济医学院附属同济医院)；唐琳(郑州大学第一附属医院)利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突参 考 文 献1 Bergmann C,Guay-Woodford LM,Harris PC,et al.Po
37、lycystic kidney diseaseJ.Nat Rev Dis Primers,2018,4(1):50.DOI:10.1038/s41572-018-0047-y.2 Cornec-Le Gall E,Alam A,Perrone RD.Autosomal dominant polycystic kidney diseaseJ.Lancet,2019,393(10174):919-935.DOI:10.1016/S0140-6736(18)32782-X.3 Chebib FT,Perrone RD,Chapman AB,et al.A practical guide for tr
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