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1、收稿日期:2019-05-20基金项目:国家自然科学基金-河南联合基金项目(U1804108);河南省高等学校重点科研项目计划(19A230005);河南省科技攻关重点项目(132102310033);河南省科技攻关重点项目(162102310439;172102310437)作者简介:邢国珍(1983),女,河南新乡人,实验师,硕士,主要从事分子生物学和病理学研究。通信作者:许君(1972),女,河南开封人,教授,博士。乙型脑炎病毒可视化快速检测方法的建立摘要:利用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立了简便、可靠的快
2、速检测乙型脑炎病毒 JEV(Japanese encephalitis virus)的可视化方法。根据 GenBank 数据库中 JEV Henan-09-03 毒株(GenBank ID:GQ336809.1)E 蛋白序列,设计了 3 对特异性 LAMP 引物,建立 Bst DNA Polymerase 等温扩增体系,优化后的反应体系可高灵敏性、特异性检测 JEV。本方法通过在扩增产物中加入 SYBR Green I 染料后用石蜡进行封闭,在可见光下根据反应液荧光的颜色深浅来判断 JEV 扩增阳性强弱。结果显示,该方法的灵敏度可达 5 copiesmL-1,且与其他病毒,如乙型肝炎病毒 HB
3、V(Hepatitis B virus,HBV)无交叉反应。关键词:乙型脑炎病毒;E 蛋白;环介导等温扩增技术(LAMP);RT-LAMP;特异性;灵敏度中图分类号:R373.31文献标志码:AEstablishment of a rapid and visual detection method for Japanese encephalitis virusXING Guozhen,JI Kai,XUE Jichu,XU Zhao,ZHENG Wenming,XU Jun(College of Life Science,Henan Agricultural University,Zhengz
4、hou 450002,China)Abstract:A method for detecting Japanese encephalitis virus(JEV),which is rapid,simple,reliable and visual,was established by loop-mediated isothermal amplification(LAMP).Based on the E pro-tein sequence of JEV Henan-09-03 strain(GenBank ID:GQ336809.1)in GenBank database,three speci
5、fic pairs of LAMP primers were designed and used.The optimized reaction system can detect JEV virus with specificity and sensitivity.The specific and highly sensitive detection method was established by LAMP technology.The SYBR Green I dye was added to the amplification product obtained in the react
6、ion system and blocked with paraffin.Under the visible light,the JEV virus could be detected ac-cording to the color of the reaction liquid.Different shades of green represented different amounts of the JEV virus,while orange turned out JEV negative.The sensitivity of this LAMP method can reach 5cop
7、ies mL-1 for JEV while had no cross-reaction with other viruses such as hepatitis B virus,HBV).Key words:Japanese encephalitis virus;E protein;loop-mediated isothermal amplification(LAMP);RT-LAMP;specificity;sensitivity流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)又称日本脑炎,是由乙型脑炎病毒(JEV)引起的以中14 河南农业大学学报第 53 卷枢神经系统损
8、害为主的虫媒人兽共患病1。该病主要能引起猪的繁殖障碍和人的神经性疾病2,严重危害畜牧业和人类的健康。对 JEV 流行状况的快速监测,对于该病的预警和防治具有极其重要的意义。目前对 JEV 的检测常采用 2 种方法:基于酶联免疫吸附法(ELISA)的免疫学方法和基于聚合酶链式反应(PCR)的基因扩增法,这 2 种方法分别依赖于专门的仪器,对于家畜养殖以及 JEV的早期检测和防疫带来一定的被动性3-5,因此,建立简便和可靠的 JEV 检测方法尤为重要。乙型脑炎病 毒 属 于 黄 病 毒 科(Flaviridae)、黄 病 毒 属(Flavivirus)成员。病毒颗粒呈球形,有膜囊,直径约 40 n
9、m,基因组为单链正股 RNA,长度约为 11 kb,编码 3 个结构蛋白,分别是核衣壳蛋白(C)、膜蛋白(prM/M)、囊膜糖蛋白(E)和 7 个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B 和 NS5)6-7。E 蛋白是 JEV 最主要的结构蛋白和免疫原性蛋白,在介导病毒吸附和融合、产生保护性免疫方面起重要作用8-10,也是 JEV 检测的主要目标标志分子。环介导等温扩增技术(LAMP)是由日本学者 NOT-OMI 等11于 2000 年开发的一种基于 PCR 的 DNA恒温扩增方法,其特点是针对靶基因的 6 个区域设计 4 种特异引物,在链置换 DNA 聚合酶(Bst
10、 DNA polymerase)的作用下,60 65 恒温扩增,15 60 min 左右即可实现 1091010倍的核酸扩增,再加上一对环引物,可以加快反应的进行。其产物为具有不同茎环数的 DNA 双链混合物,产物经琼脂糖凝胶电泳检测可见典型的梯形条带。由于 LAMP 检测方法具有高灵敏性、准确性、简便性等特点而被广泛应用于基层检测。ALFONSO 等12利用该技术检测儿童急性呼吸道感染疾病,SUL 等13建立了一种用于鸡肉加工过程中的现场快速检测病原的荧光便携装置和直接扩增方法,ZOHRE 等14用LAMP 方法检测细胞培养中支原体的污染。已有的文献报道针对 JEV 采用 LAMP 方法检测
11、,但是检测灵敏度仍显不足,本研究针对 JEV 的 E 基因序列设计了 3 对特异的 LAMP 检测引物,成功建立了一种简便、准确、高灵敏度和高特异性的可视化检测方法,可用于现场和基层监测部门对乙型脑炎病毒的快速检测。1材料与方法1.1材料pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 质粒、JEV 减毒活疫苗(SA14-14-2)、E.coli DH5 感受态细胞、人肝癌细胞 HepG 2.2.15 等由河南农业大学生命科学学院细胞室保存。氨苄青霉素购自鼎国生物工程公司,dNTP Mix(10 mmol)、HiScriptReverse Tran-scriptase 反转录试剂盒均购自 Vazyme
12、 公司,10 LAMP Buffer、MgSO4(100 mmol)、Bst DNA Polymer-ase 购自 Nova 公 司,1 TE(pH 8.0)溶 液、病 毒RNA 提取试剂盒购自康为世纪,质粒小提试剂盒及 DNA 回收试剂盒等购自 Tiangen 公司,2Ultra SYBR Mixture 购自康为世纪,胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司,DMEM 购自美国 Hy-Clone 公司,液体石蜡油(AR)购自北京索莱宝科技有限公司。1.2引物设计本研究根据 JEV Henan-09-03 毒株 E 蛋白的核酸序列(GenBank ID:GQ336809.1),使用 LAMP
13、 Designer 引物设计软件设计 E 基因保守区域的引物,包括外引物 F3/B3、内引物 FIP/BIP 和环引物LoopF/LoopB,引物序列见表 1。表 1JEV LAMP 检测引物序列Table 1Primer sequences for JEV LAMP引物名称Primers序列Primer sequences(5-3)F3TGCTTGACAATCATGGCAB3CTGGCTGGATTGTTCTCCFIPCGAGCCACCGTCGAGATGTGCTGAGGTCAGAAGTTACTBIPCACAACGAGAAGCGAGCTGATAAAATCCA-CATCCGTTGCCLoopFAG
14、TGACTGAAGCGTGATAGCLoopBACAAGGCTTCACTGACCG1.3标准质粒制备质粒 pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 转 化 E.coli DH5 感受态细胞,氨苄青霉素平板筛选阳性克隆子,质粒小提试剂盒提取质粒,经微量紫外分光光度计 Nanodrop 1000 测定质粒质量浓度。1.4RT-LAMP 反应体系优化根据 Nova Bst DNA Polymerase 说明书推荐的反应体系配制反应液-(表 2),根据试验条件的优化配制了反应液-(表 3)。反应条件为:65 恒温水浴 1 h。1.5扩增产物的可视化检测在扩增产物中加入 SYBR Green I,每个反
15、应体系中加入 20 L 液体石蜡油进行封闭,自然光下,肉眼观察不同反应管中的颜色并拍照。在 LAMP反应结束后反应管目测为绿色荧光判为阳性,橙色第 6 期邢国珍,等:乙型脑炎病毒可视化快速检测方法的建立15 荧光则判为阴性。并取 2 L 扩增产物经 2.0%琼脂糖凝胶电泳检测,若出现 LAMP 特征性的梯子形带判为阳性,未出现扩增条带为阴性。表 2反应液-反应体系Table 2Liquid-reaction system组成Constitute体积/LVolume终浓度Final concentrationBst DNA Polymerase1.00.32 UL-110LAMP Buffer2
16、.51MgSO4(100 mmol)1.58 mmoldNTP Mix(10 mmol)3.51.4 mmolFIP/BIP(25)1.01.6 molF3/B3(25)1.00.2 molLoopF/LoopB(25)1.00.4 molddH2O 12.5质粒 DNA Plasmid DNA1.0表 3反应液-反应体系Table 3Liquid-reaction system组成Constitute体积/LVolume终浓度Final concentrationBst DNA Polymerase1.0 0.32 UL-110 LAMP Buffer2.5 1.0MgSO4(100 mmo
17、l)1.5 8 mmoldNTP Mix(10 mmol)4.0 1.4 mmolFIP/BIP(25)1.0 1.6 molF3/B3(25)4.0 0.8 molLoopF/LoopB(25)1.5 0.6 molddH2O 质粒 DNA9.0 Plasmid DNA1.0 1.6灵敏度试验根据 pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 载体的长度和浓度,计算标准品的拷贝数,并且采用 10 倍梯度稀释,得到梯度稀释后的模板,按照 LAMP 体系配置反应体系,反应后用上述 1.5 方法进行检测,阳性结果中模板拷贝数可检测到最低浓度即为灵敏度。1.7特异性试验提取 HBV 的基因组,并分别取
18、HepG2.2.15细胞培养上清液和细胞基因组 DNA 作为待检样品,于-20 保存备用。利用病毒 RNA 提取试剂盒抽提 JEV 减毒活疫苗的 RNA,将 RNA 反转录合成 cDNA 第一条链。采用本研究中所用的 LAMP引物扩增,检测引物的特异性。2结果与分析2.1RT-LAMP 引物特异性检测采用反应液-反应体系反应结束后,将反应混合液等体积分装成 2 份,1 份加入 0.5 L 2Ul-tra SYBR Mixture 显色,另 1 份加入 2 L 6Loading Buffer 进行 2%琼脂糖电泳检测。结果显示,反应液-反应体系可以检测 pCDNA3.1(+)-JEV-ProE
19、1.00108拷贝,并且肉眼可观察到反应液颜色有明显差异,JEV 阳性为绿色,而阴性为橙褐色(图 1-A),琼脂糖凝胶电泳检测显示扩增出大小为 209 bp 左右的主条带(图 1-B),表明所设计的引物可以用于后续试验。M:Hind DNA Maker;1:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 1.00108拷贝;2:阴性对照。M:Hind DNA Maker;1:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 1.00108 copies;2:Negative control.图 1反应液-反应体系 JEV 阳性检测Fig.1liquid-reaction system for JEV pos
20、itive test2.2RT-LAMP 反应的优化条件通过对反应条件的摸索试验,最佳反应体系为:25 L,各组分终浓度分别为:Bst DNA Polymer-ase 0.32 UL-1、10LAMP Buffer 2.5 L、MgSO4 8 mmol、dNTP Mix 1.4 mmol、FIP/BIP 1.6 mol、F3/B3 0.8 mol、LoopF/LoopB 0.6 mol、ddH2O 9 L、DNA 1 L。2.3RT-LAMP 的灵敏度所获得的标准质粒质量浓度为1 000.01 mgL-1,OD260/280=1.82,OD260/230=2.63。全长为6 916 bp,根据
21、 质 粒 拷 贝 数 计 算 公 式:copies/ml(拷 贝数)=(6.021023(mgL-110-9)/(DNA Length660),计算得出标准品拷贝数为1.321011,将该标准品用 TE 缓冲溶液(Tris-EDTA buffer solution)(pH 8.0)稀释成758 mg L-1,则获得拷贝数为1.001011的标准品,对标准品进行10倍体积梯度稀释,得到拷贝数分别为1.00109、1.00108、1.00107、1.00106、1.00105、1.00104、1.00103、1.00102的质粒模板,未优化前的反应体系扩增(图2)。16 河南农业大学学报第 53
22、卷M:DL2000TM DNA Maker;CK:阴 性 对 照;1:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 102拷贝;2:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 103拷贝;3:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 104拷贝;4:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 105拷贝;5:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 106拷贝;6:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 107拷贝;7:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 108拷贝;8:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 109拷贝。M:DL2000TM DNA Maker;CK:Negative co
23、ntrol;1:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 102 copies;2:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 103 copies;3:pCD-NA3.1(+)-JEV-ProE 104 copies;4:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 105 copies;5:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 106 copies;6:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 107 copies;7:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 108 copies;8:pCD-NA3.1(+)-JEV-ProE 109 copies.图 2反应液-反应体系的 JEV 灵敏度
24、检测Fig.2liquid-I reaction system for JEV sensitivity detection采用 优 化 的 RT-LAMP 反 应 体 系 分 别 扩 增pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 标准质粒的 4、5、10、102、103、104、105拷贝,反应产物等体积分装成 2 份,其中 1 份加入 0.5 L 2Ultra SYBR Mixture 显色(图3-A),另 1 份加入 2 L 6Loading Buffer 进行 2%琼脂糖电泳检测(图 3-B)。结果显示,优化后的RT-LAMP 反应体系最低可以检测到 5 拷贝。为进一步优化反应条件,提高检
25、测的灵敏度,将 pCD-NA3.1(+)-JEV-ProE 标准质粒的 5、10、102、103拷贝的反应体系孵育时间增加至 1.5 h(如图 4),结果显示能够获得明显的扩增特征性条带(图 4-B)和显色反应(图 4-A)。2.4特异性和重复性根据优化后的 RT-LAMP 反 应体系,将 含有JEV RNA 反转录 PCR 产物样品、4 个不同浓度的pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 质粒样品以及阴性对照的 人 肝 癌 细 胞 HepG2.2.15 的 基 因 组 DNA、HepG2.2.15 细胞培养物上清液作为模板的反应产物 2 等份分装后分别采用 SYBR Green 和琼脂糖凝
26、胶电泳检测。结果显示:HepG2.2.15 细胞的基因组 DNA 以及 HepG2.2.15 细胞培养物上清液均未扩增出梯子形条带,而 JEV RNA 反转录 PCR 产物和 4 组 pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 质粒均能够扩增出来相应的梯子形条带,优化后反应体系能够特异性地检测 JEV 病毒 DNA(图 5)。M:DL2000TM DNA Maker;CK:阴 性 对 照;1:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 106拷贝;2:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 105拷贝;3:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 104拷贝;4:pCDNA3.1(+)-JEV-
27、ProE 103拷贝;5:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 102拷贝;6:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 10拷贝;7:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 5 拷贝;8:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 4 拷贝。M:DL2000TM DNA Maker;CK:Negative control;1:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 106 copies;2:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 105 copies;3:pCD-NA3.1(+)-JEV-ProE 104 copies;4:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 103 copie
28、s;5:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 102 copies;6:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 10 copies;7:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 5 copies;8:pCD-NA3.1(+)-JEV-ProE 4 copies.图 3反应液-反应体系的 JEV 灵敏度检测Fig.3liquid-reaction system for JEV sensitivity detectionM:DL2000TM DNA Maker;CK:阴 性 对 照;1:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 5 拷贝;2:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 10 拷
29、 贝;3:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 102拷贝;4:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 103拷贝。M:DL2000TM DNA Maker;CK:Negative control;1:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 5 copies;2:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 10 copies;3:pCD-NA3.1(+)-JEV-ProE 102 copies;4:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 103 copies。图 4优化后 RT-LAMP 反应体系的 JEV 灵敏度检测(增加孵育时间至 1.5 h)Fig.4optimized RT-L
30、AMP reaction system for JEV sensitivity detection(increase the incubation time to 1.5 h)第 6 期邢国珍,等:乙型脑炎病毒可视化快速检测方法的建立17 M:DL2000TM DNA Maker;CK:阴性对照;1:HepG2.2.15 细胞基因组 DNA(5 g);2:JEV RNA 反转录 PCR 产物(100 pg);3:HepG2.2.15 细胞培养物上清;4 6:不同拷贝数的 pCDNA3.1(+)-JEV-ProE 样品。M:DL2000TM DNA Maker;CK:Negative contr
31、ol;1:HepG2.2.15 cell genome DNA(5 g);2:JEV RNA RT-PCR product(100 pg);3:HepG2.2.15 cell culture supernatant;4 6:pCDNA3.1(+)-JEV-ProE samples with different copy numbers.图 5反应液-反应体系的特异性和重复性检测Fig.5liquid-reaction system for JEV sensitivity and repeatability detection3结论与讨论 LAMP 检测技术在临床疾病诊断和致病微生物的定性定量检
32、测方面已经逐渐被使用。由于LAMP 检测方法的结果灵敏度高,设备要求低,并且反应结束即可用肉眼观察到试验结果,非常适合于基层检测机构和实验室使用。而基于 RT-PCR 和 real-time PCR 方法,尽管很灵敏,但是需要昂贵的荧光定量 PCR 仪器,还需要有经验的人员操作等,而 LAMP 检测方法的设备要求简单而且更加节省时间17。国内的研究者们也尝试采用 LAMP技术建立了 JEV 的检测方法,如:李海洋等18建立的猪乙型脑炎病毒、型的 RT-LAMP 检测方法最低检测灵敏限度为 15 copies;谢晶等19建立的鸡传染性气管炎病毒可视化 LAMP 诊断方法能够检测到的病毒最低质量浓
33、度达到 0.06 gL-1,卢冰霞 等8最 低 可 以 检 测 到 0.5 pg 的 病 毒 JEV RNA;周玉鹏等20建立的检测基因 I 型和基因型日本脑炎病毒的 RT-LAMP 方法最低可以检测到 24 copies,以上研究者所建立的 JEV LAMP 检测的灵敏度为 10 copies 以上级别。本研究针对 JEV 河南流行株的 E 蛋白设计了6 条引物,建立了一种可视化、高效的、高灵敏度以及高特异性检测方法。针对靶序列的 6 个区域设计引物,在 6365 条件下依靠 Bst DNA polymer-ase 的链置换活性,3090 min 内实现 DNA 片段的大量扩增,比普通荧光定
34、量 PCR 灵敏度高出 10 20 倍,增加一对环引物可进一步加快反应,加入钙黄绿素可实现可视化检验。该方法具有良好的特异性,且 JEV 最低检出限为 5 拷贝,使灵敏度达到了个位数,比已有报道的灵敏度提高一个数量级。环介导等温扩增技术由于其引物设计要求较高,难度大,需要优化的条件要求多所以扩增特异性高。但是由于扩增灵敏度高,一旦开盖容易形成气溶胶污染,假阳性问题比较严重,如何避免假阳性的出现,比如提前将用于肉眼观察的染料加入反应液中,以及采用辅助仪器设备来避免开盖等,仍需要后续研究。参考文献:1XU Z,GU W Z,XUE J C,et al.Pig IFITMs are restric-
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