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1、生物化学实验15 蛋白质的定量测定-微量凯氏定氮法电子课件 生物化学实验技术生物化学实验技术蛋白质的定量测定微量凯氏定氮法实验类型：综合性实验类型：综合性实验类型：综合性实验类型：综合性 教学时数：教学时数：教学时数：教学时数：9 9生物化学实验技术一、实验目的一、实验目的1、学习微量凯式定氮法测定蛋白质含量的原、学习微量凯式定氮法测定蛋白质含量的原理。理。2、了解微量凯氏定氮仪的结构，掌握微量凯、了解微量凯氏定氮仪的结构，掌握微量凯式定氮法测定蛋白质含量的操作方法。式定氮法测定蛋白质含量的操作方法。生物化学实验技术二、实验二、实验原理原理 蛋白质蛋白质（或其他含氮有机化合物）与浓硫（或其他含
2、氮有机化合物）与浓硫酸共热时，其中所含的碳、氢两种元素被氧化酸共热时，其中所含的碳、氢两种元素被氧化成二氧化碳和水，氮元素转化成氨，并进一步成二氧化碳和水，氮元素转化成氨，并进一步与硫酸反应生成硫酸铵残留于反应液中。该过与硫酸反应生成硫酸铵残留于反应液中。该过程称之为程称之为“消化消化”。该消化过程进行缓慢，所需。该消化过程进行缓慢，所需时间较长，通常须加入硫酸钾或硫酸钠以提高时间较长，通常须加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，同时加入硫酸铜作为催化剂，反应液的沸点，同时加入硫酸铜作为催化剂，加速反应速度。加速反应速度。生物化学实验技术 消化消化完毕后，再加入过量的浓氢氧化钠溶完毕后，再加入
3、过量的浓氢氧化钠溶液使消化液碱化，其中的硫酸铵与氢氧化钠反液使消化液碱化，其中的硫酸铵与氢氧化钠反应生成氨，以蒸馏法使释放出的氨游离出来，应生成氨，以蒸馏法使释放出的氨游离出来，用硼酸溶液（用硼酸溶液（H3BO3）吸收后再以硫酸或盐酸）吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。大多数蛋白质的含氮量均值即为蛋白质含量。大多数蛋白质的含氮量均值为为16%，所以将测得的蛋白质的含氮量乘以蛋，所以将测得的蛋白质的含氮量乘以蛋白质系数白质系数6.25（即每含有（即每含有1克氮，即表示该物克氮，即表示该物质含蛋白质质含蛋白质6.
4、25克）。克）。生物化学实验技术 生物生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。凯氏定氮法由于具有测定正确度高，氏定氮法。凯氏定氮法由于具有测定正确度高，可测定各种不同形态样品等优点，被公以为是可测定各种不同形态样品等优点，被公以为是测定蛋白质含量的标准分析方法。测定蛋白质含量的标准分析方法。生物化学实验技术三、仪器与试剂三、仪器与试剂1、材料：玉米秸秆或其他待测样品、材料：玉米秸秆或其他待测样品2、仪器：凯氏定氮仪、凯氏烧瓶、仪器：凯氏定氮仪、凯氏烧瓶、容量瓶、容量瓶、电子天平、烘箱、电炉、酒精灯、玻璃电子天平、烘箱、电炉、酒精灯、玻璃珠、珠、滴定管、洗瓶
5、、锥形瓶、铁架台。滴定管、洗瓶、锥形瓶、铁架台。3、试剂、试剂：消化液，催化剂，田氏指示剂，：消化液，催化剂，田氏指示剂，30%氢氧化钠氢氧化钠溶液，溶液，2%硼酸硼酸溶液，标准溶液，标准盐酸盐酸溶液（溶液（0.01mol/L）。）。生物化学实验技术四、实验内容四、实验内容1、凯氏定氮仪的构造与安装、凯氏定氮仪的构造与安装 凯凯氏定氮仪由蒸汽发生器、反应室及冷凝氏定氮仪由蒸汽发生器、反应室及冷凝器三部分组成。按照仪器说明书要求及所标注器三部分组成。按照仪器说明书要求及所标注连接方式仔细安装在一平稳的实验台上。连接方式仔细安装在一平稳的实验台上。生物化学实验技术生物化学实验技术2、样品处理、样品
6、处理（1）液体样品：取一定体积测试样品直接进行消化即）液体样品：取一定体积测试样品直接进行消化即可。可。（2）固体样品：一般用每）固体样品：一般用每100g样品样品（干重）中所含氮（干重）中所含氮的克数来表示。因此在进行消化之前，必须要将样品的克数来表示。因此在进行消化之前，必须要将样品中所含水分去除掉。通常采用中所含水分去除掉。通常采用105下烘干的方法。取下烘干的方法。取一定量的样品，充分粉碎后放入已称重的称量瓶内，一定量的样品，充分粉碎后放入已称重的称量瓶内，置于置于105的烘箱内持续烘干的烘箱内持续烘干4小时。用坩埚钳将称量小时。用坩埚钳将称量瓶取出放入干燥器内，待降至室温后称重。按上
7、述操瓶取出放入干燥器内，待降至室温后称重。按上述操作继续烘干样品，每隔作继续烘干样品，每隔1小时称重一次，直至两次称量小时称重一次，直至两次称量重量不变，即达到恒重。精确称量已达恒重的样品重量不变，即达到恒重。精确称量已达恒重的样品0.1g作为作为本次实验测试样品。本次实验测试样品。生物化学实验技术3、消化、消化（1）加样：取干燥的凯氏烧瓶）加样：取干燥的凯氏烧瓶4个，分别编号个，分别编号后各加数粒玻璃珠。在后各加数粒玻璃珠。在1、2号瓶中各加样品号瓶中各加样品0.1g，消化液，消化液5mL，催化剂，催化剂0.2g。注意加样品。注意加样品时应直接送入瓶底，不可粘在瓶口和瓶颈上。时应直接送入瓶底
8、，不可粘在瓶口和瓶颈上。在在3、4号瓶中各加蒸馏水号瓶中各加蒸馏水0.1mL代替样品。其代替样品。其他试剂同样品瓶，作为对照，用以测定试剂中他试剂同样品瓶，作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。可能含有的微量含氮物质。生物化学实验技术（2）消化：每个瓶口放一漏斗，在通风橱内，）消化：每个瓶口放一漏斗，在通风橱内，于电炉上加热消化。开始消化时应以微火加热，于电炉上加热消化。开始消化时应以微火加热，不要使液体冲到瓶颈或冲出瓶外，否则将严重不要使液体冲到瓶颈或冲出瓶外，否则将严重影响测定结果。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分影响测定结果。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出二氧化硫白烟后，适当加强
9、火力，使解并放出二氧化硫白烟后，适当加强火力，使瓶内液体微微沸腾而不致跳荡。继续消化，直瓶内液体微微沸腾而不致跳荡。继续消化，直至消化液呈透明淡绿色为止。至消化液呈透明淡绿色为止。生物化学实验技术（3）定容：消化完毕，静置，待烧瓶中液体）定容：消化完毕，静置，待烧瓶中液体冷却后，缓慢沿瓶壁加蒸馏水冷却后，缓慢沿瓶壁加蒸馏水10mL，随加随随加随摇。冷却后将瓶内液体倾人摇。冷却后将瓶内液体倾人50mL的容量瓶中，的容量瓶中，并以少量蒸馏水洗烧瓶数次，将洗液并入容量并以少量蒸馏水洗烧瓶数次，将洗液并入容量瓶中，并加水稀释至刻度线，充分混匀后备用。瓶中，并加水稀释至刻度线，充分混匀后备用。生物化学实
10、验技术4、蒸馏、蒸馏（1）蒸馏器的洗涤）蒸馏器的洗涤 接通接通冷凝水，打开自由夹冷凝水，打开自由夹2。先向蒸汽发生器中加。先向蒸汽发生器中加入一定量的水（以排水管的高度为宜），并关闭自由入一定量的水（以排水管的高度为宜），并关闭自由夹夹2，用酒精灯或电炉将其加热烧开。将蒸馏水由加样，用酒精灯或电炉将其加热烧开。将蒸馏水由加样漏斗加入反应室，关闭自由夹漏斗加入反应室，关闭自由夹1，移开酒精灯或电炉片，移开酒精灯或电炉片刻，可使反应室中的水自动吸出，如此反复清洗刻，可使反应室中的水自动吸出，如此反复清洗35次次。清洗清洗后在冷凝管下端放一盛有后在冷凝管下端放一盛有5mL 2%H3BO3溶液溶液和和
11、12滴指示剂混合液的锥形瓶。蒸馏数分钟后，观察滴指示剂混合液的锥形瓶。蒸馏数分钟后，观察锥形瓶内溶液是否变色，如不变色则表明蒸馏装置内锥形瓶内溶液是否变色，如不变色则表明蒸馏装置内部已洗涤干净。如变色，继续洗涤，直至不变色为止。部已洗涤干净。如变色，继续洗涤，直至不变色为止。生物化学实验技术（2）蒸馏）蒸馏 取取50mL锥形瓶锥形瓶3个，各加入个，各加入2%H3BO3溶溶液和液和12滴指示剂，溶液呈淡紫色，用表面皿滴指示剂，溶液呈淡紫色，用表面皿覆盖备用。覆盖备用。关闭关闭冷凝水，打开自由夹冷凝水，打开自由夹2，使蒸汽发生，使蒸汽发生器与大气相通。将上述已加试剂的锥形瓶放在器与大气相通。将上述
12、已加试剂的锥形瓶放在冷凝器下面，并使冷凝器下端浸没在液体内。冷凝器下面，并使冷凝器下端浸没在液体内。生物化学实验技术 用用移液管取消化液移液管取消化液5mL，打开自由夹，打开自由夹1，小心，小心地从加样漏斗下端加入反应室，随后加入地从加样漏斗下端加入反应室，随后加入30%NaOH溶液溶液5mL，关闭自由夹，关闭自由夹1；在加样漏斗；在加样漏斗中加少量水做水封，以防止其体从漏斗处逸出。中加少量水做水封，以防止其体从漏斗处逸出。关闭关闭自由夹自由夹2，打开冷凝水（注意不要过快过，打开冷凝水（注意不要过快过猛，以免水溢出），酒精灯加热蒸馏，当观察到猛，以免水溢出），酒精灯加热蒸馏，当观察到锥形瓶中的
13、溶液由紫变绿时（约锥形瓶中的溶液由紫变绿时（约23min），开始），开始计时，蒸馏计时，蒸馏3min，移出锥形瓶，使冷凝器下端离，移出锥形瓶，使冷凝器下端离开液面约开液面约1cm，同时用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外，同时用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外侧，继续蒸馏侧，继续蒸馏1min，取下锥形瓶，用表面皿覆盖，取下锥形瓶，用表面皿覆盖瓶口。瓶口。生物化学实验技术 蒸馏蒸馏完毕后，应立即清洗反应室，方法见完毕后，应立即清洗反应室，方法见蒸馏器的洗涤。打开自由夹蒸馏器的洗涤。打开自由夹3，将水放出，再，将水放出，再加热，再清洗，如此反复加热，再清洗，如此反复35次。最后将自由次。最后将自由夹夹1、3同时打开
14、，将蒸汽发生器内的全部废水同时打开，将蒸汽发生器内的全部废水换掉。关闭夹子，再使蒸汽通过整个装置数分换掉。关闭夹子，再使蒸汽通过整个装置数分钟后，继续下一次蒸馏。钟后，继续下一次蒸馏。待待样品和空白消化液均蒸馏完毕，同时进样品和空白消化液均蒸馏完毕，同时进行滴定。行滴定。生物化学实验技术5、滴定、滴定 全部全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨，滴定终点为指示剂溶液由锥形瓶中收集的氨，滴定终点为指示剂溶液由绿变为淡紫色。绿变为淡紫色。生物化学实验技术五、结果与五、结果与计算计算(N)样品样品中总氮的质量分数；中总氮的质量分数；c标准标准盐酸溶液摩尔浓度；盐酸溶液摩尔浓度；V1滴定滴定样品所消耗标准盐酸溶液平均体积；样品所消耗标准盐酸溶液平均体积；V2滴定滴定空白瓶所消耗标准盐酸溶液平均体积；空白瓶所消耗标准盐酸溶液平均体积；m样品样品质量（质量（g）；）；14氮氮的相对原子质量。的相对原子质量。样品中蛋白质含量可据此计算样品中蛋白质含量可据此计算：（蛋白质）（蛋白质）=(N)6.25