酶的制备及活力测定.pptx

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1、会计学 1酶的制备及活力测定课程标准 课程标准 1 1 研究酶的存在和简单制作方法。研究酶的存在和简单制作方法。2 2 尝试利用酶活力测定的一般原理和方法。尝试利用酶活力测定的一般原理和方法。课标解读 课标解读 1 1 了解酶的合成、作用与分布。了解酶的合成、作用与分布。2 2 理解提取和制备酶的简单方法。理解提取和制备酶的简单方法。3 3 掌握酶活力测定的一般原理、方法及影响因素。掌握酶活力测定的一般原理、方法及影响因素。第1 页/共34 页(1)(1)酶的合成 酶的合成酶是在生物体 酶是在生物体_ _ 中合成的。中合成的。(2)(2)酶的分布 酶的分布多数酶在 多数酶在_ _ 直接参与生物

2、化学反应，少数的酶要分 直接参与生物化学反应，少数的酶要分泌到 泌到_ _ 发挥作用。发挥作用。酶的提取与酶活力的测定方法1酶的提取活细胞细胞内细胞外第2 页/共34 页(3)(3)酶的提取 酶的提取提取细胞内的酶，可用 提取细胞内的酶，可用_ _、_ _ 或 或_ _ 等机 等机械将组织细胞破碎，经 械将组织细胞破碎，经_ _、_ _ 制备成粗酶液；提取 制备成粗酶液；提取分泌到细胞外的酶，如 分泌到细胞外的酶，如_ _、_ _ 等，可 等，可以直接从动物 以直接从动物_ _ 或细胞外的 或细胞外的_ _ 中提取。中提取。(1)(1)酶活力的表示方法 酶活力的表示方法酶的活力通常以单位时间内

3、 酶的活力通常以单位时间内_ _ 或者在单位时 或者在单位时间内 间内_ _ 来表示。来表示。(2)(2)测定酶活力原因 测定酶活力原因在提取过程中，在提取过程中，_ _ 等多种环境条件都可能影 等多种环境条件都可能影响酶的 响酶的_ _，导致酶，导致酶_ _，直至丧失，直至丧失_ _。2酶的活力及测定破碎仪 研磨器 匀浆器过滤 离心唾液淀粉酶 胰蛋白酶分泌物 组织间隙底物的消耗量产物的生成量温度、酸碱性空间结构 变性 活力第3 页/共34 页1 1 酶的分布与提取 酶的分布与提取项目内容分布多数酶直接在细胞内催化相关化学反应的进行，称为胞内酶少数的酶分泌到细胞外面，催化相关化学反应的进行，称

4、为胞外酶，如各种消化酶等提取细胞破碎法：用破碎仪、研磨器或匀浆器等机械将组织细胞破碎，使酶从活细胞中释放出来，进入细胞外的溶液中，经过滤、离心制备成粗酶液直接提取法：直接从动物分泌物或细胞外的组织间隙中提取(如唾液淀粉酶、胰蛋白酶等)第4 页/共34 页分光光度法是通过直接测定溶质对光的吸收能力来确定溶 分光光度法是通过直接测定溶质对光的吸收能力来确定溶液浓度的方法。液浓度的方法。测定过程如下：测定过程如下：配制梯度浓度标准溶液；配制梯度浓度标准溶液；测出标准溶液的吸光值：在分光光度计上，选取特定的 测出标准溶液的吸光值：在分光光度计上，选取特定的波长，测出上述各溶液的吸光值；波长，测出上述各

5、溶液的吸光值；绘制标准曲线：以各种标准溶液的浓度为横坐标，相应 绘制标准曲线：以各种标准溶液的浓度为横坐标，相应的吸光值为纵坐标，在方格坐标纸上绘制标准曲线；的吸光值为纵坐标，在方格坐标纸上绘制标准曲线；测定待测样品的吸光值；测定待测样品的吸光值；查找浓度，计算物质的含量：根据测出的吸光值，在标 查找浓度，计算物质的含量：根据测出的吸光值，在标准曲线上查找它的对应浓度，计算待测物质的含量。准曲线上查找它的对应浓度，计算待测物质的含量。2.酶活力的测定方法分光光度法第5 页/共34 页下列各项能表示酶活性高低的是 下列各项能表示酶活性高低的是()。A A 单位时间、单位体积内反应物的总量 单位时

6、间、单位体积内反应物的总量B B 一段时间后生成物的总量 一段时间后生成物的总量C C 一段时间后，一定体积中消耗的反应物的量 一段时间后，一定体积中消耗的反应物的量D D 单位时间内、单位体积中反应物的减少量或产物的增 单位时间内、单位体积中反应物的减少量或产物的增 加量 加量解析 解析 酶活性的高低可以用在一定条件下，酶所催化的某 酶活性的高低可以用在一定条件下，酶所催化的某一化学反应的反应速率表示，而酶反应速率是指单位时间 一化学反应的反应速率表示，而酶反应速率是指单位时间内、单位体积中反应物的减少量或产物的增加量。内、单位体积中反应物的减少量或产物的增加量。答案 答案 D D【巩固1】

7、第6 页/共34 页植物淀粉酶的制备及活力测定 植物淀粉酶的制备及活力测定(1)(1)提取酶液：称取 提取酶液：称取2 g 2 g 萌发的 萌发的_ _ 种子，加 种子，加1 g _ 1 g _，研磨成匀浆，倒入 研磨成匀浆，倒入25 mL 25 mL 的 的_ _ 中，加 中，加_ _ 稀释 稀释定容至 定容至25 mL 25 mL，在，在_ _ 下放置 下放置15 15 20 min 20 min，然后以，然后以3 000 3 000 r/min r/min 离心 离心5 min 5 min，取出上清液，取出上清液(内含淀粉酶 内含淀粉酶)。将其中一部。将其中一部分上清液在 分上清液在_

8、_，使酶失活。，使酶失活。(2)(2)滴加酶液：取 滴加酶液：取4 4 支试管，编号 支试管，编号1 1、2 2、3 3、4 4。向。向1 1、2 2 号试 号试管中各加入 管中各加入_1 mL _1 mL；向；向3 3、4 4 号试管中 号试管中加 加入 入_ 1 mL _ 1 mL。酶的制备与活力测定的过程水稻 石英砂刻度试管 蒸馏水室温沸水中水浴加热未煮过的新鲜酶液已煮过的失活酶液第7 页/共34 页(3)(3)恒温处理：将 恒温处理：将4 4 支试管 支试管_ _ 放入 放入_ _ 恒温水浴锅中保温 恒温水浴锅中保温15 min 15 min，再向各试管分别加入，再向各试管分别加入_

9、_ 下预热的质量分数为 下预热的质量分数为1%1%的淀粉溶液 的淀粉溶液2 mL 2 mL，摇匀后立即放入，摇匀后立即放入_ _ 水浴中保温 水浴中保温5 min 5 min。(4)(4)钝化处理：取出试管，向各试管同时加入 钝化处理：取出试管，向各试管同时加入4 mL 0.4 mol/L 4 mL 0.4 mol/L的质量浓度为 的质量浓度为0.4 mol/L _ 4 mL 0.4 mol/L _ 4 mL，以钝化，以钝化_ _ _ _，使反应，使反应_ _。(5)(5)测定吸光值：从 测定吸光值：从4 4 支试管中各取 支试管中各取2 mL 2 mL 溶液，分别放入 溶液，分别放入25 2

10、5 mL mL 具塞 具塞_ _ 中，再加入 中，再加入2 mL_ 2 mL_ 试剂，试剂，混匀、煮沸、冷却后用蒸馏水稀释至 混匀、煮沸、冷却后用蒸馏水稀释至25 mL 25 mL 混匀。分别移入 混匀。分别移入4 4支 支_ _，用，用_ _ 在波长 在波长_ nm _ nm 处进行 处进行_ _，记，记录 录_ _ 并记算平均值。并记算平均值。同时404040NaOH 溶液酶的活终止 性刻度试管3，5 二硝基水杨酸比色杯 分光光度计520比色 吸光值第8 页/共34 页(6)(6)绘制 绘制_ _。(7)(7)查找 查找_ _ 含量。含量。(8)(8)计算淀粉酶的活力。计算淀粉酶的活力。标

11、准曲线麦芽糖第9 页/共34 页1 1 酶的制备 酶的制备名称 方法步骤制备植物淀粉酶称量研磨稀释定容离心取上清液制备过氧化氢酶称量切碎研磨离心取上清液特别提醒 萌发的水稻种子或小麦种子都是制备植物淀粉酶的一些好材料。制备过氧化氢酶时，选取新鲜的动物肝脏、马铃薯块茎或萝卜块根均可。第10 页/共34 页(1)(1)原理 原理淀粉酶活力的大小与产生的麦芽糖的量成正比。麦芽糖与 淀粉酶活力的大小与产生的麦芽糖的量成正比。麦芽糖与3 3，5 5 二硝基水杨酸试剂反应，生成黄褐色产物。用标准 二硝基水杨酸试剂反应，生成黄褐色产物。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用分光光度法测定淀粉 浓度的麦芽糖溶

12、液制作标准曲线，用分光光度法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的麦芽糖的量，以单位重量样品在一 酶作用于淀粉后生成的麦芽糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。(2)(2)活动程序 活动程序 提取酶液 提取酶液 滴加酶液 滴加酶液 恒温处理 恒温处理(注意保温温度和时间 注意保温温度和时间)2用分光光度法测定淀粉酶活力第1 1 页/共34 页 钝化处理：用 钝化处理：用0.4 mol/L NaOH 0.4 mol/L NaOH 处理。处理。测定吸光值 测定吸光值(注意加入的试剂以及呈现的颜色 注意加入的试剂以及呈现的颜色)。绘制标准曲线 绘制标

13、准曲线(用分光光度计在波长 用分光光度计在波长520 nm 520 nm 处进行比色，处进行比色，记录吸光值，以吸光值为纵坐标、麦芽糖含量为横坐标，记录吸光值，以吸光值为纵坐标、麦芽糖含量为横坐标，绘制标准曲线 绘制标准曲线(其中 其中0.0 mL 0.0 mL 管为空白对照 管为空白对照)。第12 页/共34 页式中：式中：A A 为淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖量 为淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖量(在标准曲线上查 在标准曲线上查得，得，mg)mg)；A A 为淀粉酶的对照管中的麦芽糖量 为淀粉酶的对照管中的麦芽糖量(mg)(mg)；V V 为比色 为比色时所用样品液体积 时所用样品液体积(mL)

14、(mL)；t t 为酶促反应时间 为酶促反应时间(min)(min)。特别提醒 特别提醒 需将提取的一部分酶液进行灭活处理，即取一部 需将提取的一部分酶液进行灭活处理，即取一部分上清液在沸水中水浴加热，使其中的酶失活，以备对照。分上清液在沸水中水浴加热，使其中的酶失活，以备对照。原理：过氧化氢酶可以催化 原理：过氧化氢酶可以催化H H2 2O O2 2分解为水和氧，其反应如下：分解为水和氧，其反应如下：3用高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶的活力第13 页/共34 页如果在反应系统中加入适当过量的过氧化氢溶液，经过酶 如果在反应系统中加入适当过量的过氧化氢溶液，经过酶促反应后，在酸性条件下，用标准高

15、锰酸钾溶液滴定多余 促反应后，在酸性条件下，用标准高锰酸钾溶液滴定多余的 的H H2 2O O2 2，反应如下：，反应如下：5H 5H2 2O O2 2 2KMnO 2KMnO4 4 4H 4H2 2SO SO4 45O 5O2 2 2KHSO 2KHSO4 4 8H 8H2 2O O 2MnSO 2MnSO4 4根据消耗的 根据消耗的H H2 2O O2 2的量计算出过氧化氢酶的活力。的量计算出过氧化氢酶的活力。酶活力用每克鲜重样品 酶活力用每克鲜重样品1 min 1 min 内分解 内分解H H2 2O O2 2的毫克数表示。的毫克数表示。第14 页/共34 页式中：式中：A A 为对照

16、为对照KMnO KMnO4 4滴定毫升数 滴定毫升数(mL)(mL)，B B 为酶反应后 为酶反应后KMnO KMnO4 4滴定毫升数 滴定毫升数(mL)(mL)；V VT T为提取酶液总量 为提取酶液总量(mL)(mL)；V VS S为 为反应时所用酶液量 反应时所用酶液量(mL)(mL)，W W 为样品鲜重 为样品鲜重(g)(g)；t t 为反应时间 为反应时间(min)(min)；1.7 1.7 为换算系数，即每消耗 为换算系数，即每消耗1 mL 1 mL 物质的量浓度为 物质的量浓度为0.1 mol/L 0.1 mol/L 的高锰酸钾溶液，相当于样品中含有 的高锰酸钾溶液，相当于样品中含有1.7 mg 1.7 mg H H2 2O O2 2。第15 页/共34 页