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1、基因工程的常规技术一、生物芯片1.基因芯片2.蛋白芯片二、基因文库构建1.基因组文库构建2.cDNA文库构建三、酵母双杂交系统1.酵母双杂交系统的基本原理2.酵母双杂交系统的应用四、DNA测序第1页/共56页一、生物芯片第2页/共56页生物芯片生物芯片：生物芯片是20世纪80年代，随着人类基因组计划的进行而诞生的一项在分子生物学领域中迅速发展起来的技术。它是将细胞、蛋白质、DNA或其他生物组分，通过微加工技术和微电子技术点在一个小的固体芯片表面，以实现对它们的准确、快速、大信息量的检测分析。其包括基因芯片、蛋白芯片、细胞芯片、组织芯片等。第3页/共56页“The use of biochips
2、 in scientific research and drug discovery has become so widespread that its almost impossible now to imagine how we got along without them.”第4页/共56页1.基因芯片基因芯片，也称为DNA芯片，DNA阵列（DNA array），就是在玻片、硅片和薄膜大呢感载体的基质表面上有序地、高密度地排列、固定了大量的靶DNA片段或寡核苷酸片段。这些被固定的DNA分子在基质上形成了高密度的DNA阵列，因此也叫基因微阵列（microarray）。横跨：生命科学、物理学
3、、计算机科学、微电子技术、光电技术、材料科学等现代高科技。第5页/共56页1.基因芯片基因芯片根据固定在玻片上的DNA类型，可分为3种：cDNA芯片、寡核苷酸芯片、基因组芯片。样品核酸分子经过标记（荧光或同位素）作为探针，与固定在载体上的DNA同时进行杂交，杂交信号通过扫描仪输入计算机，用特定的软件分析杂交信号的强弱，判断分子的数量和与探针的同源性，进而获得样品的序列信息而对基因序列及功能进行大规模、高通量地研究。杂交属于固-液杂交，高度集约化和平行处理。第6页/共56页1.基因芯片基因芯片的图象第7页/共56页6400点的基因芯片的图象（12X14mm）1.基因芯片第8页/共56页1.基因芯
4、片基因芯片数据分析第9页/共56页（1）直接将核酸片段“点”至包被过的芯片表面做探针片段；（2）预先合成寡核苷酸，再将其固定至芯片表面作为探针片段；（3）原位合成寡核苷酸探针片段。1.基因芯片基因芯片的制备方法第10页/共56页基因芯片点样仪第11页/共56页运用基因芯片技术研究肿瘤相关基因第12页/共56页基因芯片DNA分子的相互作用1.基因芯片第13页/共56页1.基因芯片基因芯片DNA分子的相互作用第14页/共56页2.蛋白芯片蛋白芯片以蛋白质代替DNA作为检测对象，在基因表达研究中有着更加直接的应用前景。将各种蛋白质有序地固定于载玻片等各种介质载体上成为检测的芯片，然后用标记了有特定荧
5、光的抗体与芯片作用，结合后荧光将指示对应的蛋白质其其表达数量。必须通过一定的方法将蛋白质固定在合适的载体上，同时能够维持蛋白质的天然构象。第15页/共56页Functional protein microarrays are consi-dered critical to progress in proteomics research.And,not surprisingly,academic and industrial researchers alike are expending considerable time and energy to come up with an operab
6、le system.Trends in Biotechnology2.蛋白芯片第16页/共56页基因芯片和蛋白芯片第17页/共56页2.蛋白芯片第18页/共56页二、基因文库的构建第19页/共56页1.基因组文库构建基因库与基因文库第20页/共56页1.基因组文库构建基因文库构建的基本战略第21页/共56页1.基因组文库构建基因文库的完备性第22页/共56页1.基因组文库构建基因文库的质量标准第23页/共56页1.基因组文库构建基因组DNA的制备第24页/共56页1.基因组文库构建基因组DNA的切割第25页/共56页1.基因组文库构建载体和受体的选择第26页/共56页2.cDNA文库的构建cD
7、NA文 库：将 生 物 某 一 组 织 细 胞 中 的 总 mRNA分离出来作为模板，在体外用反转录酶合成互补的双链cDNA，然后连接到合适的载体上，转入宿主细胞后形成的所有克隆就叫cDNA文库。cDNA文库能否构建成功的关键是高质量的mRNA的获得一个好的cDNA文库的特征。包含有足够大量的独立克隆，代表最初的mRNA样品中的所有转录本;克隆中包含接近全长的mRNA.第27页/共56页2.cDNA文库的构建cDNA第一链的合成第28页/共56页2.cDNA文库的构建cDNA第二链的合成之一第29页/共56页2.cDNA文库的构建cDNA第二链的合成之二第30页/共56页2.cDNA文库的构建
8、双链平头cDNA的克隆第31页/共56页2.cDNA文库的构建第32页/共56页三、酵母双杂交系统第33页/共56页1.酵母双杂交系统的基本原理酵母双杂交系统是由Fields和song 在20世纪90年代建立起来研究蛋白质相互作用的技术手段。基本原理：真核生物的转录激活子一般是由两个结构上分开的、功能上相互独立的结构域组成，即一个DNA结合域（BD）和一个转录激活域（AD）。BD为识别位于靶基因上游的一个特定区段，并与之激活；AD则同其他成分结合来启动下游基因的转录。一般情况下它们是同一种蛋白质的两个组成部分，是激活基因转录的必要条件，分开单独存在时仍具有其原来的功能，但不能其始转录。第34页
9、/共56页1.酵母双杂交系统的基本原理这个方法主要由4个部分组成：AD、BD、报告基因和诱惑基因组成。AD和BD可来自同一个转录激活子的两个结构域，也可来自两种不同转录因子结构域的不同部分，但在体内其他蛋白质相互作用下都可以重新连接成转录因子，并具有转录功能，激活下游报告基因的表达。常见的AD和BD来自于Gal4和LexA，下游报告基因的表达产物一般会引起荧光或显色反应，易于检测。第35页/共56页1.酵母双杂交系统的基本原理第36页/共56页1.酵母双杂交系统的基本原理第37页/共56页1.酵母双杂交系统的基本原理第38页/共56页1.酵母双杂交系统的基本原理两种载体在构建融合基因时，测试蛋
10、白基因与结构基因必须在阅读框内融合，融合基因的表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。Gal4-BD具有核定位信号；Gal4-AD无，故在其氨端或羧端克隆有来自SV40的T抗原一段序列作为核定位序列。常用的BD基因有：LexA和Gal4的BD编码序列；常见的AD基因有：VP-16和Gal4。第39页/共56页2.酵母双杂交系统的应用（1）鉴定已知蛋白质之间是否相互作用将两个待测蛋白的基因分别同BD或AD结构域融合，共转酵母后，如果两个蛋白能相互作用，那么它们的结合会导致两个结构域的结合，从而启动报告基因的转录。第40页/共56页（2）筛选与已知蛋白质相互作用的克隆从cDNA文库中筛选编码
11、与已知靶蛋白特异作用的克隆，发现与已知蛋白相互作用的蛋白或提示其功能。利用酵母双杂交系统，已经从许多cDNA文库中筛选出了很多编码蛋白质的新基因。2.酵母双杂交系统的应用第41页/共56页2.酵母双杂交系统的应用（3）用于药物的筛选如利用酵母双杂交系统筛选出了同人视网膜母细胞瘤Rb蛋白结合的肽类物质。对于引发疾病反应的蛋白质相互作用可以采用药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。第42页/共56页2.酵母双杂交系统的应用（4）鉴定不同突变子与靶蛋白的反应能力许多P53蛋白突变后丧失了与SV40 T细胞的抗原结合能力。其基因的改变与肿瘤的发生有关，某些序列的变化会导致抑癌功能的完
12、全丧失。第43页/共56页2.酵母双杂交系统的应用（5）在细胞内研究抗原和抗体的作用酶联反应和免疫沉淀技术是利用细胞外环境下抗原和抗体的免疫反应研究抗原和抗体的相互作用，在细胞内抗原和抗体的反应则可以通过酵母双杂交进行检测。第44页/共56页3.酵母双杂交系统存在的问题（1）双杂交分析蛋白相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白质的相互作用依赖于翻译后修饰如磷酸化和二硫键的形成等，而这些反应在核内无法进行；（2）有些蛋白本身具有转录激活作用，容易产生假阳性。第45页/共56页四、DNA测序第46页/共56页双脱氧末端终止测序法的基本原理1.Sanger双脱氧链终止法第47页/共56页1.Sanger
13、双脱氧链终止法双脱氧末端终止测序法的基本操作第48页/共56页1.Sanger双脱氧链终止法双脱氧末端终止测序法的基本反应第49页/共56页2.Maxam-Gilbert化学修饰法1977年，美国哈佛大学的Maxam和Gilbert发展出了一种以化学切割为基础的DNA序列分析方法，称为Maxam-Gilbert DNA序列分析法。基本原理：用特殊的化学试剂处理具有末端放射标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割，由此产生一组不同长度的DNA片段，然后用电泳分离分析断裂片段的大小，放射自显影，读胶确定DNA序列。第50页/共56页2.Maxam-Gilbert化学修饰法Maxam-Gilbert化学修饰法的基本原理第51页/共56页2.Maxam-Gilbert化学修饰法肼作用于T和C，高盐条件下选择性破坏C第52页/共56页2.Maxam-Gilbert化学修饰法硫酸二甲酯作用于A和G，控制温度和时间只作用于G第53页/共56页3.测序技术的发展第54页/共56页3.测序技术的发展人类基因组概貌第55页/共56页感谢您的观看！第56页/共56页