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1、第第8章章基基因因工工程程基因工程基因工程1、基因工程？、基因工程？在宿主细胞中克隆特定的基因并使其表在宿主细胞中克隆特定的基因并使其表达，以获得基因表达的产物，也可定向达，以获得基因表达的产物，也可定向改造细胞或生物个体。改造细胞或生物个体。2、基因克隆？、基因克隆？又叫分子克隆。即将特定的又叫分子克隆。即将特定的DNA片段通片段通过载体导入宿主细胞，在受体细胞中复过载体导入宿主细胞，在受体细胞中复制、扩增，以获得单一制、扩增，以获得单一DNA分子的大量分子的大量拷贝。拷贝。2、基因工程的意义、基因工程的意义1)获得大量的有应用价值的酶：纤维素酶获得大量的有应用价值的酶：纤维素酶2）得到有药
2、用价值的生物制品：尿激酶）得到有药用价值的生物制品：尿激酶3）改造工业用微生物）改造工业用微生物4）可对一些疾病进行基因治疗）可对一些疾病进行基因治疗3、基因工程的基本环节、基因工程的基本环节1）目的基因的获得）目的基因的获得2）目的基因克隆）目的基因克隆3）导入宿主细胞）导入宿主细胞4）表达）表达原核基因工程各环节浅析原核基因工程各环节浅析1、目的基因的获得、目的基因的获得1）提取基因组）提取基因组DNA，经，经PCR扩增获得扩增获得2）提取总）提取总RNA，经，经RT-PCR获得获得3）化学合成）化学合成4）从基因组文库或）从基因组文库或cDNA文库中调取文库中调取 2、DNA重组重组1）
3、DNA分子重组技术分子重组技术在体外把特定的在体外把特定的DNA片段插入核酸载体中并形片段插入核酸载体中并形成磷酸二酯键连接，从而组合成一个新的成磷酸二酯键连接，从而组合成一个新的DNA分子。分子。2）载体：基因的渡船）载体：基因的渡船一个可结合特定一个可结合特定DNA片段并把它转运进细胞中片段并把它转运进细胞中的物质。常用的载体有质粒，噬菌体和病毒等。的物质。常用的载体有质粒，噬菌体和病毒等。载体的特点载体的特点能在宿主细胞中复制繁殖，复制能力越高能在宿主细胞中复制繁殖，复制能力越高越好。越好。容易进入宿主细胞，效率越高越好。容易进入宿主细胞，效率越高越好。容易插入外来核酸片段，插入后不影响
4、其容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要求进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要求载体载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位上要有合适的限制性核酸内切酶位点。点。容易从宿主细胞中分离纯化出来容易从宿主细胞中分离纯化出来有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。胞都能容易被辨认和分离出来。克隆载体为了基因克隆而用于携带克隆载体为了基因克隆而用于携带DNADNA片段进入宿主细胞的自动自我复制的遗片段进入宿主细胞的自动自我复制的遗传成
5、分。常用的载体是细菌质粒与修饰传成分。常用的载体是细菌质粒与修饰过的噬菌体基因组。过的噬菌体基因组。常用的克隆载体：常用的克隆载体：1）质粒）质粒（10kb)2）噬菌体噬菌体(9-23kb)：以多克隆位点与：以多克隆位点与筛选标记代替费必需区。筛选标记代替费必需区。3）粘性质粒）粘性质粒(40-50kb)：带有：带有cos区的载区的载体体表达载体携带基因或表达载体携带基因或c DNA c DNA 进入恰当的宿进入恰当的宿主细胞主细胞,并引导编码蛋白合成的经修饰的质并引导编码蛋白合成的经修饰的质粒或病毒。一般带可被宿主细胞识别的有基粒或病毒。一般带可被宿主细胞识别的有基因表达调控元件：启动子，核
6、糖体结合位点，因表达调控元件：启动子，核糖体结合位点，转录终止序列。转录终止序列。质粒载体质粒载体常用的重组方法常用的重组方法1）粘性末端连接）粘性末端连接2）加上同聚体的尾部）加上同聚体的尾部3）加人工接头）加人工接头4）平末端连接）平末端连接目的基因与载体重组目的基因与载体重组3、把重组、把重组DNA导入宿主细胞导入宿主细胞1)转化：将质粒或其他转化：将质粒或其他DNA导入宿主细胞，并使导入宿主细胞，并使其获得新的表型。其获得新的表型。采取一些方法处理细胞，经处理后的细胞就容易采取一些方法处理细胞，经处理后的细胞就容易接受外界接受外界DNA，称为感受态细胞，再与外源，称为感受态细胞，再与外
7、源DNA接触，就能提高转化效率。接触，就能提高转化效率。例：冷例：冷CaCl处理制备感受态细胞处理制备感受态细胞 用高电压脉冲短暂作用于细菌也能显著提高转化用高电压脉冲短暂作用于细菌也能显著提高转化效率，这称为电穿孔转化法效率，这称为电穿孔转化法2）感染：噬菌体感染细菌）感染：噬菌体感染细菌3）转染：重组的噬菌体）转染：重组的噬菌体DNA也可象质粒也可象质粒DNA的的方式进入宿主菌，进入感受态细菌的噬菌体方式进入宿主菌，进入感受态细菌的噬菌体DNA可以同样复制和繁殖，这种方式称为转染。可以同样复制和繁殖，这种方式称为转染。4、转基因后的鉴定、转基因后的鉴定1）根据重组载体的标志作筛选）根据重组
8、载体的标志作筛选2）核酸杂交法）核酸杂交法3）PCR法法4）DNA限制性内切酶图谱分析限制性内切酶图谱分析5）核苷酸序列测定）核苷酸序列测定6）基因的表达产物鉴定）基因的表达产物鉴定免疫印迹（免疫印迹（Western-blot）克隆基因的表达克隆基因的表达原核常用表达体系：大肠杆菌原核常用表达体系：大肠杆菌E.coli ori+抗性基因抗性基因+E.coli启动子启动子+SD序列序列+克隆位点克隆位点+终止信号终止信号表达产物表达产物基因表达的鉴定基因表达的鉴定非融合蛋白非融合蛋白融合蛋白融合蛋白原核基因工程流程图原核基因工程流程图提取基因组提取基因组DNA或或RNA目的基因的获得目的基因的获
9、得与载体重组与载体重组导入宿主细胞导入宿主细胞克隆的筛选与鉴定克隆的筛选与鉴定表达产物的鉴定表达产物的鉴定真核基因工程各环节浅析真核基因工程各环节浅析1、目的基因的获得、目的基因的获得2、DNA重组重组表达载体：穿梭质粒表达载体：穿梭质粒E.coli ori+抗性基因抗性基因+真核启动子真核启动子/增强子增强子+克隆位点克隆位点+终止信号终止信号+尾尾DNA的扩增的扩增重组质粒转化大肠杆菌，挑出成功的克重组质粒转化大肠杆菌，挑出成功的克隆，大量培养培养，获得重组的质粒。隆，大量培养培养，获得重组的质粒。导入真核宿主细胞导入真核宿主细胞常用方法：常用方法：磷酸钙共沉淀磷酸钙共沉淀电穿孔电穿孔脂质体脂质体显微注射法显微注射法克隆的筛选克隆的筛选导入成功克隆的筛选导入成功克隆的筛选1、抗性基因与药物筛选、抗性基因与药物筛选G418与与neor基因基因2、绿色荧光蛋白、绿色荧光蛋白真核表达真核表达常用的真核表达系统：常用的真核表达系统：1、昆虫表达系统：例，果蝇、昆虫表达系统：例，果蝇S2细胞细胞2、杆状病毒表达系统：例，、杆状病毒表达系统：例，Sf9细胞系细胞系3、酵母的表达系统、酵母的表达系统有些时候会采用哺乳动物细胞有些时候会采用哺乳动物细胞基因表达的鉴定基因表达的鉴定mRNA的检测的检测蛋白的检测蛋白的检测文献的阅读与分析文献的阅读与分析