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1、基因工程与基因体外表达基因工程与基因体外表达Genetic Engineering and gene expression in vitro第第1313章章重组重组DNA技术的发展史技术的发展史1865年年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验。的豌豆杂交试验。1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。的肺炎球菌转化实验。1973年年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。分子。1977年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组工程公司，专门应用重组DNA技术制造
2、医学上重要的技术制造医学上重要的药物。药物。1980年年 开始建造第一家应用重组开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。技术生产胰岛素的工厂。1997年年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。英国罗林研究所成功的克隆了多莉。19721972年年,P.Berg:,P.Berg:构建第一个构建第一个DNADNA重组分子重组分子19971997年年,动物克隆动物克隆:克隆羊多莉克隆羊多莉19771977年，基因工程产品的出现年，基因工程产品的出现 H.W.BoyerH.W.BoyerH.W.BoyerH.W.Boyer,第一个基因工程产品第一个基因工程产品第一个基因工程产品第一个基因工程产品(
3、SS)(SS)(SS)(SS)19731973年年,S.S.CohenS.S.Cohen:第一个基因克隆实验第一个基因克隆实验 2001年，人类基因组计划年，人类基因组计划一、重组一、重组DNA技术相关概念技术相关概念克隆克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。即无性繁殖。（一）（一）DNA克隆克隆技术水平：技术水平：分子克隆分子克隆(molecular clone)（即（即DNA 克隆）克隆）细胞克隆细胞克隆 个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）
4、应应用用酶酶学学的的方方法法，在在体体外外将将各各种种来来源源的的遗遗传传物物质质（同同源源的的或或异异源源的的、原原核核的的或或真真核核的的、天天然然的的或或人人工工的的DNA）与与载载体体DNA接接合合成成一一具具有有自自我我复复制制能能力力的的DNA分分子子复复制制子子(replicon)，继继而而通通过过转转化化或或转转染染宿宿主主细细胞胞，筛筛选选出出含含有有目目的的基基因因的的转转化化子子细细胞胞，再再进进行行扩扩增增提提取取获获得得大大量量同同一一DNA分分子子，也也称称基基因因克克隆隆或或重重组组DNA(recombinant DNA)。DNA克隆克隆生物技术工程生物技术工程:
5、基因工程、蛋白质工程、酶工基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等。程、细胞工程等。目的：目的：分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程基因工程(genetic engineering)实现基因实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组又称重组DNA工艺学。工艺学。重组重组DNA技术基本原理技术基本原理基本原理基本原理目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体细胞导入受体细胞外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和
6、构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 第一节第一节基因克隆是利用工具酶基因克隆是利用工具酶进行操作进行操作关键步骤一的工具：关键步骤一的工具：关键步骤二的工具：关键步骤二的工具：关键步骤三的工具：关键步骤三的工具：基因的基因的基因的基因的剪刀剪刀剪刀剪刀限制酶限制酶限制酶限制酶基因的基因的基因的基因的针线针线针线针线DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶基因的基因的基因的基因的运载工具运载工具运载工具运载工具运载体运载体运载体运载体工具酶工具酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNA聚合酶聚合酶 逆转录酶逆转录酶 T4DNA连接酶连接酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 末端转移酶末端
7、转移酶 Taq DNA聚合酶聚合酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)限限 制制 性性 核核 酸酸 内内 切切 酶酶(restriction endonuclease,RE)是是识识别别DNA的的特特异异序序列列,并并在在识别位点或其周围切割双链识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H定义：定义：与与甲甲基基化化酶酶共共同同构构成成细细菌菌的的限限制制修修饰饰系统，限制外源系统，限制外源DNA，保护自身，保护自身DNA。、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型
8、）分类：分类：作用：作用：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名：命名：Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome)切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口GGGGA AT TCCCCCCCCT TA
9、AGGGGII型限制性核酸内切酶：型限制性核酸内切酶：能识别能识别DNA分子内部的特异性位点和切割双链分子内部的特异性位点和切割双链DNA，其切割位点的序列可知、固定。其切割位点的序列可知、固定。Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口粘端切口粘端切口来来源源不不同同的的限限制制酶酶，但但能能识识别别和和切切割割同一位点，这些酶称同一位点，这些酶称同功异源酶同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bst同功异源酶：
10、同功异源酶：有有些些限限制制性性内内切切酶酶虽虽然然识识别别序序列列不不完完全全相相同同，但但切切割割DNA后后，产产生生相相同同的的粘粘性性末末端端，称称为为同同尾尾酶酶。这这两两个个相相同同的的粘粘性性末末端端称称为为配配伍未端伍未端(compatible end)。Bam Bam HHBg Bg l l GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A 同尾酶同尾酶名称名称 识别序列及切割位点序列及切割位点名称名称识别序列及切割点序列及切割点切割后切割后产生生突出末端突出末端:BamH 5GGATCC.3GATCC.3Bgl
11、 5AGATCT.3GATCT.3EcoR EcoR 5GAATTC.3AATTC.3Hind Hind 5AAGCTT.3 AGCTT.3 Hpa Hpa 5CCGG.3 CGG.3 Mbo Mbo 5GATC.3 GATC.3 Nde Nde 5GATATG.3TATG.3切割后切割后产生生3突出末端突出末端:Apa 5GGGCCC.3C.3Hae 5PuGCGCPy.3Py.3Kpn 5GGTACC.3C.3Pst 5CTGCAG.3G.3Sph 5GCATGC.3C.3切割后切割后产生平末端生平末端:Alu 5AGCT.3CT.3EcoR 5GATATC.3ATC.3Hae Hae 5
12、GGCC.3CC.3Pvu Pvu 5CAGCTG.3CTG.3Sma Sma 5CCCGGG.3GGG.3 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5磷酸基和磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯羟基末端之间形成磷酸二酯键，使键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比
13、活探针DNA序列分析序列分析填补填补3末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行
14、同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基第二节第二节基因克隆需要特定的载体基因克隆需要特定的载体 基因载体基因载体 定义定义 为携带目的基因，实现其无性繁殖为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。分子。常用载体常用载体质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA克隆载体克隆载体(cloning vector)为为使使插插入入的的外外源源DNA序序列列被被扩扩增增而而特特意意设计的载体称为设计的载体称为克隆载体克隆载体。表达载体表达载体(expression vector)为使插入的外源为使插入的外源DNA
15、序列可转录翻译序列可转录翻译成成 多肽链而特意设计的载体称为多肽链而特意设计的载体称为表达载体表达载体。n载体的选择标准：载体的选择标准：能自主复制；能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；筛选和鉴定；有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNA。1.1.质粒质粒(plasmid)特特点点:能能在在宿宿主主细细胞胞内内独独立立自自主主复复制制；带带有有某某些些遗遗传信息传信息,会赋予宿
16、主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。多克隆位点多克隆位点ori复制起始点复制起始点遗传标记遗传标记AmpAmppolylinker基因载体基因载体 噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）2.2.噬菌体噬菌体(phage)M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因）M13mp系列系列 pUC系列系列DNAProtein coatcoscosNonessential regionLong(left)armshort(right)armEx
17、ogenous DNA(20-23 kb)phagephage12bp 替换型载体（取代型载体）替换型载体（取代型载体）替换型载体（取代型载体）替换型载体（取代型载体）外源外源DNADNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体取代噬菌体染色体中对于噬菌体的感染和复制非必要的片段的感染和复制非必要的片段(20 kb)(20 kb)高感染效率高感染效率(10(109 9 转化株转化株/ug/ug 载体载体 DNA,DNA,比质比质粒高粒高100-100-倍倍)e.g.EMBL3,DASH凯伦噬菌体载体凯伦噬菌体载体既有插入型；又有替换型既有插入型；又有替换型在基因工程实验中的用途十分广泛在基因工程实验中的用
18、途十分广泛承受外源承受外源DNADNA的能力：几个的能力：几个kbkb到到23kb23kb3.粘性质粒粘性质粒(cosmid):适合克隆大的适合克隆大的DNA片片段段 柯斯质粒载体的特点柯斯质粒载体的特点1.具有具有噬菌体的特性；噬菌体的特性；2.具有质粒载体的特性；具有质粒载体的特性；3.具有较高容量的克隆能力；具有较高容量的克隆能力；4.具有与同源性序列的质粒进行重组的能力具有与同源性序列的质粒进行重组的能力柯斯质粒柯斯质粒pHC79pHC79系由质系由质粒粒pBR322pBR322和噬和噬菌体菌体的的coscos位位点的一段点的一段DNADNA构成全长构成全长4.3kb4.3kb整合型（
19、整合型（integratedintegrated）载体）载体：即外源基因通过这种病毒载体与宿主细胞的染色体整合，外源基因随宿主细胞基因组的复制而扩增。这类载体的代表是 SV40PSV系列和逆转录病毒逆转录病毒表达载体pLPGHL、pMSV 等。游离型游离型(transient)(transient)或称病毒颗粒型载体或称病毒颗粒型载体，这类载体携带外源基因后，本质上仍然是一种完整或缺损的病毒，能够以病毒颗的形式在宿主内自行复制或在辅助病毒存在下进行复制。这类载体有痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒。4.病毒载体病毒载体病毒载体病毒载体优点：优点：1 1、利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高；、利用
20、病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高；2 2、复杂的装配过程由细胞完成；、复杂的装配过程由细胞完成；3 3、不同的病毒载体具有不同的表达特点、不同的病毒载体具有不同的表达特点。存在的问题：存在的问题：1 1、安全性、安全性2 2、靶向性、靶向性3 3、有效性、有效性细胞毒性细胞毒性染色体毒性染色体毒性免疫毒性免疫毒性转导靶向性转导靶向性转录靶向性转录靶向性转导效率转导效率靶向性靶向性基因表达水平和持续时间基因表达水平和持续时间表达的可调控性表达的可调控性常用的病毒载体的特点：常用的病毒载体的特点：酵母人工染色体酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome,YAC)细
21、菌人工染色体细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome,BAC)动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）1.5.其他其他表达载体表达载体 指用来在受体细胞中表达外源基因的载指用来在受体细胞中表达外源基因的载体称为体称为表达载体表达载体。表达载体除具有克隆载体。表达载体除具有克隆载体所具备的性质外，还带有所具备的性质外，还带有转录和翻译所必需转录和翻译所必需的的DNADNA序列序列。根据受体细胞不同，表达载体。根据受体细胞不同，表达载体多种多样，如原核表达载体、真核表达载体。
22、多种多样，如原核表达载体、真核表达载体。原核表达载体原核表达载体 在原核表达载体中除含有复制起始点、抗性基在原核表达载体中除含有复制起始点、抗性基因、多克隆位点等与克隆载体一样之处外，还必需因、多克隆位点等与克隆载体一样之处外，还必需含有含有启动子、核糖体结合位点、转录终止序列启动子、核糖体结合位点、转录终止序列等表等表达元件。达元件。原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有：原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有：Lac(乳糖启动子乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的双启动子乳糖和色氨酸的双启动子)、P PL L(噬菌体的左向启动子噬菌体的左向启动子)、
23、T7噬菌体启动子等。噬菌体启动子等。真核表达载体至少要含两类序列：真核表达载体至少要含两类序列：原核质粒的序列原核质粒的序列，包括在大肠杆菌中起作用的复制起始序包括在大肠杆菌中起作用的复制起始序列、能用在细菌中筛选克隆的抗药性基因标志等，以便插入列、能用在细菌中筛选克隆的抗药性基因标志等，以便插入真核基因后能先在很方便操作的大肠杆菌系统中筛选获得目真核基因后能先在很方便操作的大肠杆菌系统中筛选获得目的重组的重组DNADNA克隆、并复制繁殖得到足够使用的数量。克隆、并复制繁殖得到足够使用的数量。在真核宿主细胞中表达重组基因所需要的元件，在真核宿主细胞中表达重组基因所需要的元件，包括启动包括启动子
24、、增强子、转录终止和加子、增强子、转录终止和加poly-Apoly-A信号序列、信号序列、mRNAmRNA剪接信号剪接信号序列、能在宿主细胞中复制或增殖的序列，能用在宿主细胞序列、能在宿主细胞中复制或增殖的序列，能用在宿主细胞中筛选的标志基因、以及供外源基因插入的单一限制性内切中筛选的标志基因、以及供外源基因插入的单一限制性内切酶识别位点等。酶识别位点等。选用质粒（最常用）做载体的选用质粒（最常用）做载体的4点要求：点要求：选分子量小的质粒，即小载体（选分子量小的质粒，即小载体（11.5kb）不易损不易损 坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；一般使用
25、松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10 个以上的拷贝，而严谨型质粒个以上的拷贝，而严谨型质粒10个。个。必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指 多位多位Ampr。第三节第三节 基因克隆的过程基因克隆的过程1、制备目的基因和相关载体、制备目的基因和相关载体2、将目的基因和有关载体进行连接、将目的基因和有关载体进行连接3、将重组本、将重组本DNA导入受体细胞导入受体细胞4、DNA重组体的筛选和鉴定重组体的筛选和鉴
26、定5、DNA重组体的扩增、表达和其他研究重组体的扩增、表达和其他研究 目的基因目的基因基因载体基因载体重组体重组体分切接转筛表总总体体技技术术路路线线 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程1.化学合成法化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列氨基酸序列。2.基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)3.cDNA文库文库(cDNA library)4.聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)一、目的基因序列的来源和分离一、目的基因序
27、列的来源和分离化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。序列。人工化学合成法使用于：人工化学合成法使用于：较短的基因（较短的基因（较短的基因（较短的基因（60-80bp60-80bp）用途：用途：用途：用途：PCR PCR引物引物引物引物 测序引物测序引物测序引物测序引物 定点突变定点突变定点突变定点突变 核酸杂交探针核酸杂交探针核酸杂交探针核酸杂交探针组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组D
28、NA文库文库存在于转化细胞内存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNA的集合的集合从基因组从基因组DNA文文库获取目的基因库获取目的基因限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文库基因文库用随
29、机切割的真核生物染色体用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库片段构建基因文库 cDNA文库文库 将将某一时间某一种类细胞某一时间某一种类细胞中所有的中所有的cDNA的的混合体与载体进行连接，使每一个混合体与载体进行连接，使每一个cDNA分子都分子都与一个载体分子拼接成重组与一个载体分子拼接成重组DNA，将所有重组，将所有重组DNA分子引入宿主细胞并进行扩增，得到分子分子引入宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的混合体称为克隆的混合体称为cDNA文库。文库。mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制 从
30、从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）TA克隆系统由Invitrogen公司（San Diego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR产物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。二、载体的选择与制备二、载体的选择与制备 噬菌体和粘性质粒适用于构建基因组
31、文库，噬菌体和粘性质粒适用于构建基因组文库，pUC系列等质粒适合构建系列等质粒适合构建cDNA文库和克隆一些较小的文库和克隆一些较小的DNA片段，片段，M13噬菌体则用于克隆一些待测序的噬菌体则用于克隆一些待测序的DNA片段。片段。选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的基因是要表应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的基因是要表达的，则要选择合适的表达载体。达的，则要选择合适的表达载体。三、重组体的连接三、重组体的连接1 1、粘性末端的连接、粘性末端的连接2 2、利用人工接头连接、利用人工接头连接3 3、加入
32、同聚物尾连接、加入同聚物尾连接4 4、平端连接、平端连接方式：方式：(1)(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接(2)(2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接 配伍末端连接配伍末端连接 非配伍末端连接非配伍末端连接1.粘性末端连接粘性末端连接Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用目的基因用 Bam H切割切割载体载体DNA用用Bam H切割切割重组体重组体载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端
33、）的连接Eco R切割位点切割位点Bg l切割位点切割位点+EcoR+Bg l双酶切双酶切Eco R+Bg l双酶切双酶切T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体配伍末端的配伍末端的连接情况和同一连接情况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似。接相似。2.平端连接平端连接 限制性内切酶切割产生的平端限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端适用于：适用于：目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连在在末末端端转转移移酶酶(terminal tra
34、nsferase)的的作作用用下下，在在DNA片片段段末末端端加加上上同同聚聚物物序序列列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。制造出粘性末端，再进行粘端连接。3.同聚物加尾连接同聚物加尾连接5335载体载体DNA5335目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3 353 A(A)nA A(A)nA 35-核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+dATP末端转移酶末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体5由平端加上新的酶切位
35、点，再用限制由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。4.人工接头人工接头(linker)连接连接人工接头及其应用人工接头及其应用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R受体菌条件：受体菌条件：安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态(competent)导入方式：导入方式：转化转化(transformation)转染转染(transfection)感染感染(infection)四、重组四、重组DNA导入受体菌导入受体菌将重组体将重组体DNA分子导入宿
36、主细胞分子导入宿主细胞1、转化、转化 指将质粒或其它外源指将质粒或其它外源DNA导入感受态的宿主细胞，导入感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。并使其获得新的表型的过程。2、感染、感染 以以噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当细胞，并在细胞内扩增。噬菌体颗粒，才能感染适当细胞，并在细胞内扩增。3、转染、转染 指真核细胞主动摄取或被动导入外源指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而片段而获得新的表型的过程。获得新的表型的过程。
37、特殊处理受体细胞细胞膜特性改变CaCl2处理受体细菌受体细菌受体细菌受体细菌50-100mmol/LCaCl2 感受态感受态感受态感受态细菌细菌细菌细菌重组体转入重组体转入重组体转入重组体转入细菌细菌细菌细菌直接选择法直接选择法(1)抗药性标记选择抗药性标记选择(2)标志补救标志补救(marker rescue)(3)分子杂交法分子杂交法原位杂交原位杂交Southern印迹印迹免疫学方法免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等五、重组体的筛选五、重组体的筛选转化后的克隆群体转化后的克隆群体：1 1、采用遗传学方法筛选特定的重组、采用遗传学方法筛选特定的重组DNAD
38、NA(1)抗药性标记选择抗药性标记选择(2)标志补救标志补救(marker rescue)(插入失活法插入失活法)抗药性标记选择抗药性标记选择目目 录录组氨酸缺陷组氨酸缺陷型大肠杆菌型大肠杆菌无组氨酸无组氨酸的培养基的培养基酵母咪唑甘油磷酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因酸脱水酶基因促进组氨酸合成促进组氨酸合成DNADNA重组体重组体标志补救标志补救目目 录录若克隆基因的表达产物与宿主菌的营养缺陷互补,那么就可以利用营养突变菌株进行筛选,这就是标志补救.互互补补的的检检测测目目 录录2、免疫学方法、免疫学方法利用特异性抗体检测表达产物利用特异性抗体检测表达产物3 3、核酸杂交法筛选特定、核酸杂交法筛选
39、特定DNADNA鸡的鸡的肌球蛋白的克隆和免疫学检测方法肌球蛋白的克隆和免疫学检测方法目目 录录原原位位杂杂交交目目 录录Southern印迹印迹目目 录录4 4、PCRPCR技术对特定技术对特定DNADNA进行直接鉴定进行直接鉴定5 5、利用限制性内切酶酶切图谱鉴定、利用限制性内切酶酶切图谱鉴定DNADNA hMLCK重组质粒酶切图谱分析1未酶切质粒 2.EcoR酶切 3.Hind 酶切 4EcoR/Hind 双酶切 5.250bpDNA Ladder重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为：技术操作过程可形象归纳为：小结小结分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切
40、目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体细胞转入受体细胞筛筛筛选重组体筛选重组体 重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交第四节第四节 真核细胞基因转染真核细胞基因转染u磷酸钙共沉淀法u电穿孔法uDEAE-葡聚糖法u脂质体法
41、u显微注射法1、利用、利用TK-细胞突变株进行筛选细胞突变株进行筛选转染细胞利用抗性标记筛选转染细胞利用抗性标记筛选TK-细胞TK+细胞HAT培养液不能存活能存活A：氨基蝶呤是核苷酸从头合成的抑制物，H：次黄嘌呤可以作为补救合成dATP、dCTP 的底物T：胸苷它必需在TK（胸苷激酶）作用下生成胸苷一磷酸。2、药物筛选：新霉素抗性基因、药物筛选：新霉素抗性基因 G418是一种氨基糖苷类抗生素,它的结构和新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞产生毒素。当neo基因（新霉素抗性基因）被整合进真核细胞DNA后,获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶氨基糖苷磷酸转
42、移酶,使细胞获得抗性而能在含有418的选择性培养基中生长。第五节第五节 利用重组利用重组DNADNA技术可对技术可对 基因进行改造基因进行改造基因定点诱变基因定点诱变 指将基因的某一个或某些位点进行人工替换或删除的过程,称为基因定点诱变基因定点诱变.1、通过基因定点诱变可以改变蛋白质编码序列的个别密码子，可以改造蛋白质的结构与功能；2、通过改变具有调控功能的序列，可以确定DNA特定的功能区域；3、构建新的载体或嵌合基因。一、带突变位点的寡核苷酸可介导定点诱变一、带突变位点的寡核苷酸可介导定点诱变二、二、KunkelKunkel法法三、三、PCRPCR技术适合进行基因的定点诱变技术适合进行基因的
43、定点诱变55335533abcd5335变性、退火5533加klenow DNA聚合酶5353加入引物a、d5353353利用基因定点诱变可改变基因工程蛋白的特性利用基因定点诱变可改变基因工程蛋白的特性 自然界的蛋白质常具有一定的可塑性，当某种蛋白自然界的蛋白质常具有一定的可塑性，当某种蛋白质中的一些氨基酸被改变或删除后，其理化性质发生了质中的一些氨基酸被改变或删除后，其理化性质发生了改变，但仍能保存其原有生物活性。同时一些蛋白质相改变，但仍能保存其原有生物活性。同时一些蛋白质相互融合后仍保持各自成分的活性。互融合后仍保持各自成分的活性。因此，通过因此，通过基因突变基因突变而引起而引起蛋白质结
44、构与功能的改变蛋白质结构与功能的改变是可行的。是可行的。、定点诱变可制备长效胰岛素、定点诱变可制备长效胰岛素将人胰岛素链将人胰岛素链27位的位的Thr改为改为Arg，将链羧基端氨基化和将链羧基端氨基化和链位链位Asn改为改为Gly后，后，其胰岛素的等电点从其胰岛素的等电点从5.4移至移至6.8，在生理，在生理pH条件下结晶，条件下结晶，从而延迟吸收其在血浆中的半衰期可延长至从而延迟吸收其在血浆中的半衰期可延长至35.3小时小时、定点诱变可制备快速吸收的胰岛素、定点诱变可制备快速吸收的胰岛素 胰岛素在治疗糖尿病时，吸收非常慢，在注射后胰岛素在治疗糖尿病时，吸收非常慢，在注射后1.5至至2小时，小
45、时，体内胰岛素还未达到高峰，而且在体内胰岛素还未达到高峰，而且在3-5小时后，其水平仍继续上升。小时后，其水平仍继续上升。决定胰岛素在注射部位吸收速度决定于决定胰岛素在注射部位吸收速度决定于胰岛素结合状态胰岛素结合状态。胰岛。胰岛素在体内吸收是以单体形式吸收的。而普通的胰岛素在中性情况下素在体内吸收是以单体形式吸收的。而普通的胰岛素在中性情况下多数是与锌结合成六聚体，单体形式非常少。多数是与锌结合成六聚体，单体形式非常少。研究发现多聚体之间形成与其研究发现多聚体之间形成与其B链的链的B8、9、12、13、16、23-28位残基有关，因此通位残基有关，因此通过基因突变改变上述位置的氨基酸残基，过
46、基因突变改变上述位置的氨基酸残基，可减少多聚体形成，提高吸收率可减少多聚体形成，提高吸收率。3 3、通过基因诱变能增加胰岛素与受体的亲和力、通过基因诱变能增加胰岛素与受体的亲和力 通过对胰岛素结构模型分析，发现胰岛素与受体的结合通过对胰岛素结构模型分析，发现胰岛素与受体的结合是有特定空间结构的，因此通过基因诱变，改变一些氨基是有特定空间结构的，因此通过基因诱变，改变一些氨基酸残基的组成，会酸残基的组成，会增加其与受体的亲和力增加其与受体的亲和力。第六节第六节 克隆基因在适当宿主细胞内表达克隆基因在适当宿主细胞内表达一、在大肠杆菌表达系统一、在大肠杆菌表达系统（一）、在大肠杆菌系统表达外源基因需
47、要一些基本要素（一）、在大肠杆菌系统表达外源基因需要一些基本要素 1、来自真核细胞目的基因需要改造、来自真核细胞目的基因需要改造 2、必须选择用大肠杆菌载体、必须选择用大肠杆菌载体 3、注意目的基因连接在起始密码子之后：表达产物有融合蛋白、注意目的基因连接在起始密码子之后：表达产物有融合蛋白 和非融合蛋白两种（和非融合蛋白两种（Nde：CATATG；Nco：CCATGG）4、选择适当的受体菌株和诱导条件、选择适当的受体菌株和诱导条件1 1、融合蛋白较稳定；、融合蛋白较稳定；2 2、如果载体携带的一段编码信号肽的基因片段，可产生、如果载体携带的一段编码信号肽的基因片段，可产生分泌型产物；分泌型产
48、物；、可利用融合蛋白中原核蛋白制备的单抗进行亲和层、可利用融合蛋白中原核蛋白制备的单抗进行亲和层析，便于纯化；析，便于纯化；、可利用融合蛋白中原核部分与表达蛋白之间加入的、可利用融合蛋白中原核部分与表达蛋白之间加入的蛋白酶切位点，可切除原核部分。蛋白酶切位点，可切除原核部分。表达融合蛋白优点表达融合蛋白优点：（二）、提高外源基因表达水平（二）、提高外源基因表达水平1、提高外源基因表达水平：启动子结构；调整、提高外源基因表达水平：启动子结构；调整SD序列序列 与与ATG之间距离；用点突变的方法改变某些碱基；增加之间距离；用点突变的方法改变某些碱基；增加mRNA的稳定性的稳定性2、将细菌生长与外源
49、基因的表达在时间上分开：减轻、将细菌生长与外源基因的表达在时间上分开：减轻细胞的代谢负荷细胞的代谢负荷 3、采用不同措施提高表达蛋白的稳定性：表达融合蛋、采用不同措施提高表达蛋白的稳定性：表达融合蛋白；采用某种突变菌株；表达分泌蛋白；白；采用某种突变菌株；表达分泌蛋白；二、真核表达系统二、真核表达系统利用真核细胞作宿主表达系统的优点是：利用真核细胞作宿主表达系统的优点是：真核细胞能够识别和除去外源基因中的内含子，剪真核细胞能够识别和除去外源基因中的内含子，剪接加工形成成熟的接加工形成成熟的mRNAmRNA。真核细胞将表达的蛋白糖基化，而大肠杆菌表达的真核细胞将表达的蛋白糖基化，而大肠杆菌表达的
50、蛋白是没有糖基化的，糖基化对某些表达蛋白的免疫蛋白是没有糖基化的，糖基化对某些表达蛋白的免疫原性影响很大。原性影响很大。真核细胞作宿主表达系统尚存在以下几个问题：真核细胞作宿主表达系统尚存在以下几个问题：选择标记及选择系统只有少数几个；选择标记及选择系统只有少数几个；转化效率低，一般只有转化效率低，一般只有1010-6-61010-4-4；外源基因转移并整合到细胞染色体外源基因转移并整合到细胞染色体DNADNA上带有一定的上带有一定的自自发性和盲目性发性和盲目性，整合的拷贝数和位置都还不能控制；，整合的拷贝数和位置都还不能控制；细胞培养及细胞的挑选要求比较高，手续繁琐费时。此细胞培养及细胞的挑