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1、实验一 质粒提取及酶切鉴定P158 基因工程（genetic engineering）是指采用人工方法将不同来源的DNA进行重组，并将重组后的DNA引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程。相关基础知识相关基础知识目的基因工具酶载体基因工程相关物质质粒质粒uu 存在于细菌细胞内、染色体外、共价闭合的存在于细菌细胞内、染色体外、共价闭合的 小型小型环状环状DNADNA分子分子(covalent closed circular(covalent closed circular(covalent closed circular(covalent closed circular DNA)DNA)DNA)DN
2、A)。uu具有具有自我复制自我复制功能。功能。uu带有抗性基因及表型识别等带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物遗传性标记物uu经改造后具有经改造后具有多克隆位点多克隆位点。质粒质粒 (plasmid)(plasmid)特点特点 能能在在宿宿主主细细胞胞内内独独立立自自主主复复制制；带带有有某某些遗传信息些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状会赋予宿主细胞一些遗传性状限制性核酸内切酶：限制性核酸内切酶：-基因工程的手术刀基因工程的手术刀 是是分分子子生生物物学学研研究究中中的的一一种种工工具具酶酶，能能识识别别DNADNA的的特特异异序序列列,并并在在识识别别位位点点或或其周围切割双链其周围切割
3、双链DNADNA的一类内切酶。的一类内切酶。如：如：EcoREcoR和和HindHind的识别序列和切口是：的识别序列和切口是：EcoREcoR：GAATTCGAATTC Hind Hind：AAGCTTAAGCTT概念概念与与甲甲基基化化酶酶共共同同构构成成细细菌菌的的限限制制修修饰饰系系统统（restriction-restriction-modification modification systemsystem），限限制制外外源源DNADNA，保护自身保护自身DNADNA。作用作用分类分类酶结构、作用、识别及切割特异性的不同分为、，基因工程技术中常用型型酶具有限制和DNA修饰作用，且识
4、别及切割位点不同（下游100-1000bp）型酶具有限制和DNA修饰作用，识别及切割位点不同（相距较近）（1）识别及切割位点相同（2）识别序列通常为48bp的回文结构；（3）切割可产生两类切口，三种末端。型限制酶特点型限制酶特点型酶识别序列特点型酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome)(palindrome)切口切口 ：平端切口、粘端切口平端切口、粘端切口GGGGA AT TCCCCCCCCT TA AGGGGBam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口粘端切口粘端切口钝性末端钝性末端粘
5、性末端粘性末端掌握质粒掌握质粒DNA提取的原理与方法提取的原理与方法 了解了解DNA限制性核酸内切酶酶切限制性核酸内切酶酶切鉴定原理鉴定原理 质粒提取原理质粒提取原理质粒的提取质粒的提取主要是利用共价闭合环状质主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异：粒与线性染色质在拓扑学上的差异：在在碱性环境中，线性的大分子细菌染色体碱性环境中，线性的大分子细菌染色体DNADNA变性，而共价闭环质粒变性，而共价闭环质粒DNADNA仍为自然仍为自然状态；状态；溶菌酶溶菌酶可破坏菌体细胞壁，可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate,SDSSodi
6、um dodecyl sulfate,SDS）可使细胞）可使细胞壁裂解。细菌经溶菌酶和阴离子去污剂壁裂解。细菌经溶菌酶和阴离子去污剂（SDSSDS）处理后，细菌）处理后，细菌DNADNA缠绕附着在细胞壁缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNADNA则则留在上清液中。再经酒精沉淀、洗涤处理，留在上清液中。再经酒精沉淀、洗涤处理，可得到质粒可得到质粒DNADNA。由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。线形、开环、闭环超螺旋。Relaxed circleLinearized formSup
7、er-coiled form与DNA分子量标准物（Marker）比较能大概判断未知DNA的分子量质粒DNA为环状，在酶切彻底的情况下，DNA片段数与酶切位点数目相同质粒质粒DNADNA酶切鉴定的原理酶切鉴定的原理MarkerMarker质粒质粒DNADNA过夜酶切过夜酶切操作步骤操作步骤(Methods)(Methods)分组：4人/组，每组提取两种质粒（空载及重组质粒）1.质粒的提取（1）接种一个单菌落（single colony）于5 mL含相应抗生素的LB培养基中，37振荡培养至饱和状态（A）或过夜。（教师准备）（2 2）取取1.5 mL1.5 mL离心管一支，加入离心管一支，加入1.4
8、 mL1.4 mL菌液，菌液，13 000 r/min13 000 r/min离心离心1 min1 min去掉上清液。加入去掉上清液。加入150 L 150 L 的溶液的溶液，充分混悬细菌，在室温，充分混悬细菌，在室温下放置下放置10 min10 min。（3 3）加入加入200 L200 L新配制的溶液新配制的溶液。加盖，。加盖，颠倒颠倒5 5次使之混匀。冰上放置次使之混匀。冰上放置5 min5 min。（4 4）加加150 L150 L预冷的溶液预冷的溶液，加盖后颠倒，加盖后颠倒5 5次混匀，冰上放置次混匀，冰上放置15 min15 min。13 000 r/min13 000 r/min
9、离离心心5 min5 min，取，取400 L400 L上清液移入另一离心管上清液移入另一离心管中。中。（5 5）向上清液中加入等体积苯酚向上清液中加入等体积苯酚/氯仿，震荡混匀，氯仿，震荡混匀，13 000 r/min13 000 r/min离心离心2 min2 min，300 L300 L上清液转移至新上清液转移至新的离心管中。的离心管中。（6 6）向上清液中加入等体积无水乙醇，混匀，室向上清液中加入等体积无水乙醇，混匀，室温放置温放置2 min2 min。离心。离心5 min5 min，倒去上清乙醇溶液，将，倒去上清乙醇溶液，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。（7 7）加入加入1 mL 70%1 mL 70%乙醇，震荡并离心，乙醇，震荡并离心，13 000 13 000 r/minr/min离心离心2 min2 min，倒去上清液，晾干，加入，倒去上清液，晾干，加入20 L20 L的的 TETE缓冲液，使缓冲液，使 DNADNA完全溶解，待用。完全溶解，待用。2.质粒DNA的酶切鉴定取一只1.5mL EP管加入以下试剂：酶切混合液：15 LL 质粒质粒DNADNA：5 L5 L 混匀后，置混匀后，置37 37 过夜保温，反应结束后4 放置备用。