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1、关于关于实验重重组质粒提粒提取及双取及双酶切切鉴定定现在学习的是第1页，共36页实验目的实验目的掌握掌握质粒提纯的原理和方法质粒提纯的原理和方法;掌握掌握核酸内切酶切割核酸内切酶切割质粒的原理并质粒的原理并学会学会运用内切酶运用内切酶.现在学习的是第2页，共36页预习：基因克隆示意图现在学习的是第3页，共36页基因克隆基因克隆操作过程：操作过程：分分分离载体分离载体和目的基因和目的基因 切切限制限制酶切载体酶切载体与目的基因与目的基因接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体菌转入受体菌 筛筛筛选重组体筛选重组体 现在学习的是第4页，共36页基因载体（gene vector）什么是基因载体什么是基
2、因载体 把一个有用的目的把一个有用的目的把一个有用的目的把一个有用的目的DNADNADNADNA片段通过重组片段通过重组片段通过重组片段通过重组DNADNADNADNA技术，送进受技术，送进受技术，送进受技术，送进受体细胞中去进行复制和表达的工具体细胞中去进行复制和表达的工具体细胞中去进行复制和表达的工具体细胞中去进行复制和表达的工具基因载体的作用基因载体的作用基因载体的作用基因载体的作用为目的基因提供进入受体细胞的转移能力为目的基因提供进入受体细胞的转移能力为目的基因提供进入受体细胞的转移能力为目的基因提供进入受体细胞的转移能力为目的基因提供在受体细胞中的复制（或整为目的基因提供在受体细胞中
3、的复制（或整为目的基因提供在受体细胞中的复制（或整为目的基因提供在受体细胞中的复制（或整合）和合）和合）和合）和表达表达表达表达所需条件所需条件所需条件所需条件现在学习的是第5页，共36页基因载体应具备特点基因载体应具备特点1.1.1.1.具有具有具有具有独立独立独立独立复制能力复制能力复制能力复制能力，在细胞中能大量繁殖在细胞中能大量繁殖，从而使目的基因大量，从而使目的基因大量，从而使目的基因大量，从而使目的基因大量扩增扩增扩增扩增2.2.作为表达载体应能利用宿主的酶系统，作为表达载体应能利用宿主的酶系统，表达目的基因表达目的基因（表达能力）（表达能力）3.3.3.3.具有适当的限制性内切具
4、有适当的限制性内切具有适当的限制性内切具有适当的限制性内切酶识别和切割位点（酶识别和切割位点（酶识别和切割位点（酶识别和切割位点（酶切位点）酶切位点）酶切位点）酶切位点）4.4.细胞内稳定性高（细胞内稳定性高（持续表达和复制）持续表达和复制）5.5.5.5.具有供筛选用的（具有供筛选用的（具有供筛选用的（具有供筛选用的（遗传标记）遗传标记）遗传标记）遗传标记）6.6.相对分子量小（相对分子量小（一定的容量）一定的容量）6现在学习的是第6页，共36页基因载体类型基因载体类型质粒(plasmid)粘粒（cosmid）噬菌体(phage)病毒(virus)DNA染色体（BAC/YAC）7现在学习的是
5、第7页，共36页一一.质粒质粒DNA的制备的制备1 关于质粒的概念a.什么是质粒（plasmid）？b.质粒的本质是什么？c.质粒有哪些构型？c.质粒有哪些特点？d.质粒的用途有哪些？8现在学习的是第8页，共36页(1)(1)质粒的定义质粒的定义 质粒是存在于细菌体内、独立于染色体的、可以自主复制的一类双链环状DNA，在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋(supercoil)形式存在。9现在学习的是第9页，共36页 超螺旋超螺旋DNA(SCDNA)(2)(2)质粒的三种构型质粒的三种构型10现在学习的是第10页，共36页 开环开环DNA(opencircularDNA,OCDNA)如果两条链中有一
6、条的一处或多处断裂，分子就发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。11现在学习的是第11页，共36页 线状线状DNA(linearDNA,LDNA):如果两条链均断开，即为线状DNA。电泳时，三者泳动速度大小关系（？）电泳时，三者泳动速度大小关系（？）12现在学习的是第12页，共36页(3)(3)质粒质粒DNADNA的一般特性：的一般特性：质粒是细菌内的共生型遗传因子,有相对独立性。它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型。它是双链闭合环状DNA，分子量大小不等。13(4)(4)提取质粒提取质粒DNADNA的目的与意义（？）的目的与意义（？）基因载体基因载体/基因克隆基因克隆/基因工程
7、基因工程现在学习的是第13页，共36页2 提取质粒DNA的常规方法:2.1 2.1 核酸分离纯化的总原则：核酸分离纯化的总原则：保证核酸一级结构完整 排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、糖、有机溶剂、金属离子、其他DNA、RNA等）现在学习的是第14页，共36页3.2 3.2 分离纯化质粒分离纯化质粒DNA DNA 的主要步骤的主要步骤培养细菌使质粒扩增（培养细菌使质粒扩增（DNA的扩增与选择）的扩增与选择）细菌的收集与裂解细菌的收集与裂解收集收集高速离心的方法高速离心的方法质粒质粒DNA的纯化的纯化所所有有纯纯化化方方法法都都是是利利用用了了质质粒粒DNA相相对对较较小小及及共共价价闭闭合合环
8、环状状的的性性质。质。现在学习的是第15页，共36页3.SDS-3.SDS-碱裂解法提取质粒碱裂解法提取质粒DNADNA3.1 3.1 实验原理：实验原理：在在有有EDTAEDTA及及去去污污剂剂（SDSSDS）存存在在的的条条件件下下，用用碱碱处处理理细细菌菌，可可以以使使细细菌菌的的细细胞胞壁壁破破裂裂，释释放放出出细细胞胞内内容容物物（染染色色体体DNADNA、质质粒粒DNADNA、蛋蛋白白质质和和RNARNA等）；处理过程中，染色体等）；处理过程中，染色体DNADNA断裂成不同长度的双链断裂成不同长度的双链DNADNA。16现在学习的是第16页，共36页强碱环境（pH12.0-12.6
9、）时：宿主菌的线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性，而质粒DNA共价闭合环状的双链并不完全分离；当加入高浓度酸性盐，pH值恢复至中性时：变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物；而质粒DNA又恢复天然构型，能溶解在上清液中，这样通过离心可以把染色体DNA、蛋白质-SDS复合物等一起除去。17现在学习的是第17页，共36页如果要提高DNA的纯度，则可以用RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质。18现在学习的是第18页，共36页3.2 3.2 主要试剂及作用主要试剂及作用溶液溶液：由葡萄糖、：由葡萄糖、EDTAEDTA、TrisTrisClC
10、l组成组成.葡萄糖葡萄糖的作用是增加溶液的粘度的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的减少抽提过程中的机械机械剪切作用剪切作用,防止破坏质粒防止破坏质粒.(保护作用保护作用)EDTA的作用是络合掉镁等二价金属离子的作用是络合掉镁等二价金属离子,防止防止DNA酶对质粒分子的酶对质粒分子的降解作用。（保护作用）降解作用。（保护作用）TrisCl能使溶菌液维持溶菌作用的最适能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用）范围（缓冲作用）19现在学习的是第19页，共36页溶液溶液IIII：由：由SDSSDS（十二烷基硫酸钠）与（十二烷基硫酸钠）与NaOHNaOH组成组成 SDSSDS的作用是解聚核蛋白
11、并与蛋白质分子结合使之的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之 变性（裂解细胞和蛋白质变性作用）变性（裂解细胞和蛋白质变性作用）NaOHNaOH（PH12PH12）的作用是破坏氢键，使）的作用是破坏氢键，使DNADNA分子变性（分子变性（DNADNA变性作用）变性作用）20现在学习的是第20页，共36页溶液溶液IIIIII：HACHAC和和KACKAC组成的高盐溶液组成的高盐溶液(复性作用复性作用)HACHAC溶液溶液能中和溶液能中和溶液的碱性，使染色体的碱性，使染色体DNA DNA 变性而发生缠绕并使质粒变性而发生缠绕并使质粒DNADNA复性。复性。KACKAC会与会与SDSSDS溶解度很低
12、的盐，并与蛋白质形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成 沉淀而除去；溶液中的沉淀而除去；溶液中的DNADNA也会与蛋白质也会与蛋白质-SDS-SDS 复合物缠绕成大分子而与小分子质粒复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNADNA分离。分离。现在学习的是第21页，共36页实实验验步步骤骤及及注注意意事事项项加加1.4ml培养物于培养物于EP管，管，12000rpm30S除去上清，再取除去上清，再取1.4ml离心离心30s除去上清，加入冰的除去上清，加入冰的100l溶液溶液I，颠倒，颠倒EP管，混匀管，混匀加入加入200l溶液溶液II，温和混匀，冰浴，温和混匀，冰浴35min加入加入150l冰溶液冰溶液
13、III，温和混匀，冰浴，温和混匀，冰浴35min，12000rpm5min转移上清到新转移上清到新EP管，加入等体积酚和氯仿管，加入等体积酚和氯仿/异戊醇异戊醇(1:1)，12000rpm5min转移上清到新转移上清到新EP管，加入等体积氯仿管，加入等体积氯仿/异戊醇，异戊醇，12000rpm5min 上层水相转移到新上层水相转移到新EP管管，加入，加入2倍体积无水乙醇，颠倒混匀，倍体积无水乙醇，颠倒混匀，-20冰箱中放置冰箱中放置20min，12000 5min 弃上清，沉淀中加弃上清，沉淀中加1ml70%乙醇，乙醇，12000rpm5min 去上清，管平放室温静置去上清，管平放室温静置10
14、15min，20lTE溶解溶解DNA现在学习的是第22页，共36页注意事项：注意事项：1、加样枪正确使用；2、标记自己所提取的质粒类型（pUC119-U6）；3、废液倒在水池中，枪头扔到垃圾桶中；4、加不同溶液要换枪头；5、离心前把管擦干；6、转移上清时不要吸到沉淀；7、吸取酚时枪头伸到下层溶液中，注意不要沾到 皮肤。现在学习的是第23页，共36页二、限制性内切酶切割重组质粒二、限制性内切酶切割重组质粒 1 关于限制性核酸内切酶 （restriction endonuclease）定义 能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性DNA片段。主要存在于细菌体内。切割不同
15、来源的DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。24现在学习的是第24页，共36页作用作用与与甲甲基基化化酶酶共共同同构构成成细细菌菌的的限限制制修修饰饰系统，限制外源系统，限制外源DNA，保护自身保护自身DNA。分类分类、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）现在学习的是第25页，共36页第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名命
16、名Hin d属属系系株株序序Haemophilusinfluenzaed株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶现在学习的是第26页，共36页类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome)切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口GGATCCCCTAGG现在学习的是第27页，共36页Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口粘端切口粘端切口现在学习的是第28页，共36页影响限制酶活性的因素影响限制酶活性的因素1）“星星”活性活性酶的特异性改变或特异性降低而
17、呈现的活性。酶的特异性改变或特异性降低而呈现的活性。EcoR：GAATTCGAATTCEcoR*：AATT2 2）甲基化甲基化识别序列中某些碱基甲基化后会阻碍酶活性。识别序列中某些碱基甲基化后会阻碍酶活性。识别序列中某些碱基甲基化后会阻碍酶活性。识别序列中某些碱基甲基化后会阻碍酶活性。3 3）底物性状）底物性状）底物性状）底物性状4）试剂：缓冲系统）试剂：缓冲系统现在学习的是第29页，共36页pUC18/19酶切位点的分布示意图现在学习的是第30页，共36页2BamHI、Hind酶切重组质粒及鉴定酶切重组质粒及鉴定1 实验原理：利用限制性内切酶特异的识别DNA特异的核苷酸序列，并切割DNA,产
18、生一定长度的DNA片段，通过电泳对酶切前后产物分析可以鉴别目的基因（重组质粒DNA）31现在学习的是第31页，共36页重组质粒重组质粒BamHIHindIII双酶切双酶切电泳检测电泳检测5-GAATTC-33-CTTAAG-5BamHI5-AAGCTT-33-TTCGAA-5 HindIII现在学习的是第32页，共36页2 实验材料:重组质粒;BamHI、Hind 限制性内切酶;反应缓冲液;琼脂糖凝胶电泳所需试剂和设备。33现在学习的是第33页，共36页3 实验步骤:A 建立反应体系B 酶切反应（温育1-3h）C 电泳鉴定34现在学习的是第34页，共36页4、双酶切体系（0.2mlEP管）：质粒DNA 10l 10M buffer 2l BamH 1l Hind 1l ddH2O 6l 35合计合计20l酶切混合液酶切混合液10l同学自己加同学自己加37，12h*剩余质粒交给老师，连同酶切产物下次电泳鉴定剩余质粒交给老师，连同酶切产物下次电泳鉴定现在学习的是第35页，共36页感谢大家观看现在学习的是第36页，共36页