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1、2 纯培养和显微技术2.1 微生物的分离和纯培养一. 无菌技术(aseptic technique) 在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为无菌技术。 灭菌：分离、培养微生物的器具不含任何微生物 无菌操作技术：转接时防止其它微生物污染，也防止污染环境1、微生物培养的常用器具及其灭菌常用的器具：试管、瓶子、培养皿等常用的灭菌方法：（具体方法见“微生物生长”）2、无菌操作：火焰附近（酒精灯、煤气灯）进行；在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行 无菌操作三要点：静、轻、快二. 用固体培养基分离纯培养培养物(culture)：在一定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体纯培养(pure
2、 culture)：只有一种微生物的培养物。微生物学中通常将由一个细胞生长、繁殖所形成的群体称为纯培养。纯培养技术：把某种特定的（目标）微生物从自然混杂存在的状态中分离、纯化出来，以便被研究和利用。菌落（colony）: 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。菌苔（lawn）:当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征（形状、颜色等），可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。1.稀释倒平板法（pour plate method）：对好氧菌和热敏感菌效果
3、不好即可定性，又可定量，用途广泛2.涂布平板法（spread plate method）：使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀即可定性，又可定量，用途广泛 3.平板划线法（streak plate method）：l 画完一个区域后，应将接种环灼烧后，再进行划线l 一般AB C D，且各区夹角一般为1204.稀释摇管法（shake tube method）：厌氧微生物的分离纯培养三. 用液体培养基分离纯培养顺序稀释，高度稀释，使一支试管中分配不到一个微生物。采用稀释法进行液体分离，必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。 分离出混杂微生物群体中占数量优势的种
4、类 四. 单细胞（孢子）分离用显微操作仪，在显微镜下进行。难度与细胞或个体的大小成反比，限于高度专业化的科学研究中采用。 五. 选择培养分离：根据某种微生物的生长需要，设计一套特定环境条件使之特别适合这种微生物的生长，以便能够从自然界混杂的微生物群体中把这种微生物选择培养出来，这种通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离。1. 利用选择平板进行直接分离（1）待分离的微生物生长，其它微生物的生长被抑制t 例：高温下培养：分离嗜热细菌 培养基中不含N：分离固氮菌 培养基加抗生素：分离抗性菌 （2）待分离的微生物的生长特征明显不同于其它微生物例：酪素平板：分离蛋白酶产生菌 刚果红平板：
5、分离纤维素酶产生菌 淀粉平板：分离淀粉酶产生菌2. 富集培养：“投其所好”（液体培养）利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。 2.2 显微技术一. 显微镜种类及其原理1. 普通光学显微镜 (light microscope)：各种情况下染色样品或活细胞个体形态的观察。1) 物镜0.5 分辨率（最小可分辨距离）= n sin 数值孔径值（Numerical Aperture，NA）: n sin n：玻片与物镜间介质的折射率:为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径
6、和工作距离u 用香柏油取代空气的作用： 增加视野照明度，改善观察效果； 提高显微镜的分辨率人眼的分辨能力在0.2 mm左右，因此光学显微镜的最大有效放大倍数（使用油镜）是1,000到1,500。2) 目镜目镜的作用只是将物镜放大的实象进一步放大形成能见的虚象,目镜不可以提高分辨率光学显微镜一般配置的最大放大倍数：目镜：10 15 ；物镜： 100 ；总放大倍数 10001500 ；2. 暗视野显微镜 (dark-field microscope)：主要用于明视野显微镜下不易看清的活细胞的观察；不易被染色或易被染色过程破坏的细胞的观察；观察活细胞的运动性。3. 相差显微镜(phase-contr
7、ast microscope)：活细胞及其内部结构的观察4 荧光显微镜(fluorescent microscope)经荧光染料染色或荧光抗体处理的样品在紫外线照射下激发出各种波长的可见光，在黑暗的背景中形成明亮的彩色物像。5.透射电子显微镜：对病毒颗粒或通过超薄切片处理对细胞的内部结构进行观察 6.扫描电子显微镜 ：一般用于观察样品的表面立体结构二. 显微观察样品的制备1.活体观察: 压滴法；悬滴法；菌丝埋片法；插片法；小培养法（适用于放线菌、霉菌）2.染色观察：细菌菌体(等电点一般pH 2-5)在中性碱性或弱酸性溶液中带负电荷,易于碱性染料(正电荷)进行结合,所以常用碱性染料进行染色.如果用酸性染料,染液的pH必须低于菌体的等电点,使菌体带有负电荷。常见碱性染料:结晶紫，番红，美蓝，孔雀绿；中性红等。常见酸性染料:刚果红，伊红，品红等。思考题：1、 何谓无菌技术？试述具体实验操作环节和注意事项。2、 那些固体培养基分离技术可以被用来获得目的微生物的纯培养？它们的适用范围和特定如何？3. 什么是选择性分离培养？试举例说明。4. 使用油镜时为何要滴加香柏油？