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1、第二章第二章 微生物的纯培养微生物的纯培养和显微技术和显微技术第一节第一节微生物的分离和纯培养微生物的分离和纯培养第二节第二节显微镜和显微技术显微镜和显微技术第三节第三节显微镜下的微生物显微镜下的微生物微生物微生物微生物微生物特点特点特点特点n培养物（培养物（culture）:指在人为规定的条件下培养指在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体。繁殖得到的微生物群体。n纯培养物（纯培养物（pureculture）：微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代，称纯培养。所得培养物成为纯培养物。殖而得到的后代，称纯培养。所得培养
2、物成为纯培养物。有关概念有关概念第一节第一节微生物的分离和纯培养微生物的分离和纯培养一、无菌技术一、无菌技术二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养三、用液体培养基分离纯培养三、用液体培养基分离纯培养(常用稀释法常用稀释法)四、单细胞（孢子）分离四、单细胞（孢子）分离五、选择培养分离五、选择培养分离六、微生物的保藏技术六、微生物的保藏技术一、无菌技术一、无菌技术(aseptictechnique)指在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其指在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术。他微生物污染的技术。n消毒消毒(disinfection)(disinfection)：
3、指采用较温和的理化因素，仅杀死物体指采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌表面或内部一部分对人体有害的病原菌,而对被消毒的物体基本而对被消毒的物体基本无害的措施。无害的措施。(部分杀灭微生物部分杀灭微生物)n灭菌灭菌(sterilization)(sterilization)：指采用强烈的理化因素使任何物体内外指采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。(彻底杀灭微彻底杀灭微生物生物)又可分为：杀菌和溶菌两种。又可分为：杀菌和溶菌两种。n抑菌抑菌(bacteriostasis)(bacte
4、riostasis)：抑制体内或体外细菌的生长繁殖。：抑制体内或体外细菌的生长繁殖。n防腐防腐(antisepsis)(antisepsis)：防止或抑制体外细菌生长繁殖的方法。细：防止或抑制体外细菌生长繁殖的方法。细菌一般不死亡。菌一般不死亡。n无菌无菌(asepsis)(asepsis)：不存在活菌，多是灭菌的结果。：不存在活菌，多是灭菌的结果。1、微生物培养的常用器具及其灭菌、微生物培养的常用器具及其灭菌火焰灼烧法火焰灼烧法干热灭菌法干热灭菌法烘箱内热空气灭菌法烘箱内热空气灭菌法高温灭菌高温灭菌巴氏消毒法巴氏消毒法常压下常压下煮沸消毒法煮沸消毒法间歇灭菌法间歇灭菌法湿热灭菌法湿热灭菌法常
5、规加压灭菌法常规加压灭菌法加压下加压下连续加压灭菌法连续加压灭菌法高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅2、接种操作、接种操作接种工具：接种工具：白金白金or镍铬合金接种针镍铬合金接种针/环环操作环境：操作环境：超净工作台超净工作台双管移植法双管移植法二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养指熔化的固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，指熔化的固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛有固体培养基的平皿。盛有固体培养基的平皿。几几种种菌菌落落用接种环沾少许待分离用接种环沾少许待分离的材料，在培养基表面进行的材料，在培养基表面进行多次平行划线，使微生物细多次平行划线，使微生物细胞分开生长以获得微生物
6、纯胞分开生长以获得微生物纯培养的过程。培养的过程。a:用用接种环接种环取一滴或少量取一滴或少量待培养物在待培养物在1处划线，接种处划线，接种环灭环灭菌后菌后,转动平板在转动平板在2处处划线划线,再对接种环灭菌后在再对接种环灭菌后在3处处划线。划线。b:对平板培养后各处的菌落情况。对平板培养后各处的菌落情况。2 2、倾注平板法（、倾注平板法（pour platepour plate）先将待分离的材料用无菌水做一系列的稀释先将待分离的材料用无菌水做一系列的稀释(如如110、1100、11000、110000等等等等)，然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并，然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至
7、冷却至50左右的琼脂培养基混合，摇匀后，左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。菌落。又称稀释倒平板法又称稀释倒平板法(对一些热敏感菌和严格好氧菌不利对一些热敏感菌和严格好氧菌不利)3 3、涂布平板法（、涂布平板法（spread platespread plate）先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的某一稀无菌平板，冷却凝固后，将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平
8、板表面，再用无菌玻释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经面，经培养后挑取单个菌落。培养后挑取单个菌落。倾注平板法倾注平板法涂布平板法涂布平板法先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在琼脂熔化后冷却并保持在50左右，将待分离左右，将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇匀，的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空气隔开。培养固体石蜡的混合物，将
9、培养基和空气隔开。培养后，菌落形成在琼脂柱的中间。后，菌落形成在琼脂柱的中间。稀释摇管法稀释摇管法-稀释倒平板法的一种变通形式稀释倒平板法的一种变通形式三、用液体培养基分离纯培养三、用液体培养基分离纯培养(常用稀释法常用稀释法)四、单细胞（孢子）分离四、单细胞（孢子）分离 采用显微分离法从混杂群体中直接分采用显微分离法从混杂群体中直接分离离单个细胞单个细胞或或单个个体单个个体进行培养以获得纯进行培养以获得纯培养，称为单细胞分离法。培养，称为单细胞分离法。这种方法对操作技术要求较高，多限这种方法对操作技术要求较高，多限于于高度专业化高度专业化的的科学研究科学研究中使用。中使用。采用显微分离法从混
10、杂群体中直接分离单个细胞或单采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜下进行。下进行。毛细管法：毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。显微操作仪：显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养。获得纯培养。小液滴法：小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯
11、培养物的分离。五、选择培养分离五、选择培养分离六、微生物的保藏技术六、微生物的保藏技术菌种保藏方法菌种保藏方法n连续移接连续移接n改变条件（干燥、低温、缺氧、缺乏营养等）改变条件（干燥、低温、缺氧、缺乏营养等）使菌株的代谢水平降低，乃至完全停止，达到使菌株的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得到保藏，有的可保藏几十年或更长的时间。到保藏，有的可保藏几十年或更长的时间。n在需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物在需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活力。恢复活力。1、传代培养保藏、传代培养保藏n是微生物保存的基本方
12、法。是微生物保存的基本方法。n琼脂斜面、半固体琼脂柱和液体培养等。琼脂斜面、半固体琼脂柱和液体培养等。n橡皮塞封口或用石蜡覆盖，并放置低温保存。橡皮塞封口或用石蜡覆盖，并放置低温保存。n4保存。保存。2、冷冻保藏、冷冻保藏n代谢作用停止。代谢作用停止。n细胞体积大者要比小者对低温更敏感，而无细胞壁者则比细胞体积大者要比小者对低温更敏感，而无细胞壁者则比有细胞壁敏感。其原因是低温会使细胞内水分形成冰晶，有细胞壁敏感。其原因是低温会使细胞内水分形成冰晶，从而引起细胞，尤其是细胞膜的损伤。从而引起细胞，尤其是细胞膜的损伤。n速冻及快速解冻可减少损伤；还可加一些保护剂，如速冻及快速解冻可减少损伤；还可
13、加一些保护剂，如0.5%左右的甘油或二甲亚砜可透入细胞，并通过降低强左右的甘油或二甲亚砜可透入细胞，并通过降低强烈的脱水作用而保护细胞；烈的脱水作用而保护细胞；n大分子物质因此在采用冷冻法保藏菌种时，一般应加入各大分子物质因此在采用冷冻法保藏菌种时，一般应加入各种保护剂以提高培养物的存活率。种保护剂以提高培养物的存活率。3、干燥保藏法、干燥保藏法n沙土管保存和冷冻真空干燥保藏沙土管保存和冷冻真空干燥保藏是最常用的二项微生物干燥保藏是最常用的二项微生物干燥保藏技术。技术。沙土管保存沙土管保存n一般将菌种接种至斜面，培养至长出大量的孢一般将菌种接种至斜面，培养至长出大量的孢子后，洗下孢子制备孢子悬
14、浮液，加入无菌沙子后，洗下孢子制备孢子悬浮液，加入无菌沙土试管中，减压干燥，直至将水分抽干，最后土试管中，减压干燥，直至将水分抽干，最后用石蜡、橡胶塞等封闭管口，置冰箱保存。此用石蜡、橡胶塞等封闭管口，置冰箱保存。此法主要适用于产孢子的微生物，如芽孢杆菌、法主要适用于产孢子的微生物，如芽孢杆菌、放线菌等，保藏时间相对较长。放线菌等，保藏时间相对较长。冷冻真空干燥保藏冷冻真空干燥保藏n是将加有保护剂的细胞样品预先冷冻，使其冻结，然后在是将加有保护剂的细胞样品预先冷冻，使其冻结，然后在真空下通过水的升华作用除去水分。达到干燥的样品可在真空下通过水的升华作用除去水分。达到干燥的样品可在真空或惰性气体
15、的密闭环境中置低温保存，从而使微生物真空或惰性气体的密闭环境中置低温保存，从而使微生物处于干燥、缺氧及低温的状态，生命活动处于休眠，可以处于干燥、缺氧及低温的状态，生命活动处于休眠，可以达到长期保藏的目的。达到长期保藏的目的。n用水升华的方式除去水分，手段比较温和，细胞受损伤的用水升华的方式除去水分，手段比较温和，细胞受损伤的程度相对比较小，存活率及保藏效果均不错，是目前使用程度相对比较小，存活率及保藏效果均不错，是目前使用最普遍，也是最重要的微生物保藏方法。最普遍，也是最重要的微生物保藏方法。第二节第二节显微镜和显微技术显微镜和显微技术一、显微镜的种类及其原理一、显微镜的种类及其原理二、显微
16、观察样品的制备二、显微观察样品的制备三、显微镜下的微生物三、显微镜下的微生物n分辨率分辨率:指能辨别两点之间最小距离的能力。指能辨别两点之间最小距离的能力。n反差反差:指样品区别于背景的程度。指样品区别于背景的程度。波长与分辨率波长与分辨率分辨率分辨率(最小可分辨距离最小可分辨距离)=0.5nsin=2NA一、显微镜的种类及原理一、显微镜的种类及原理1.普通光学显微镜普通光学显微镜(复式显微镜)机械装置机械装置:镜座、支架、载物台、调焦螺旋等镜座、支架、载物台、调焦螺旋等光学系统光学系统:物镜、目镜、聚光镜等物镜、目镜、聚光镜等n使用油镜时加镜油的目的使用油镜时加镜油的目的:(1)增加照明亮度
17、增加照明亮度(2)增加显微镜的分辨率增加显微镜的分辨率光学显微镜光学显微镜2.暗视野显微镜暗视野显微镜主要用于观察主要用于观察生活细菌生活细菌的的运动运动性。性。3.相差显微镜相差显微镜通过环状光阑和相差板，利用光的干涉现象，通过环状光阑和相差板，利用光的干涉现象，将光的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差将光的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差(明暗明暗差差)，从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差，从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强。异，对比度增强。4.荧光显微镜荧光显微镜在紫外线的照射下，发荧光的物体会在黑暗的背在紫外线的照射下，发荧光的物体会在黑暗的背景景下表现为光亮的有色
18、物体。下表现为光亮的有色物体。5.透射电子显微镜透射电子显微镜(TEM)6.扫描电子显微镜扫描电子显微镜(SEM)7.扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜(STM)二、显微观察样品的制备二、显微观察样品的制备1、光学显微镜的制样、光学显微镜的制样(1)活体观察活体观察压滴法压滴法将菌悬液滴于载玻片上将菌悬液滴于载玻片上,加盖盖玻片后立即进行显加盖盖玻片后立即进行显微镜观察。微镜观察。悬滴法悬滴法在盖玻片中央加一小滴菌悬液后反转置于特制的凹在盖玻片中央加一小滴菌悬液后反转置于特制的凹载玻片上后进行显微镜观察。载玻片上后进行显微镜观察。菌丝埋片法菌丝埋片法将无菌小块玻璃纸铺于平板表面将无菌小块玻璃纸铺于平
19、板表面,涂布放线菌涂布放线菌或霉菌孢子悬液或霉菌孢子悬液,经培养取下玻璃纸置于载玻片上经培养取下玻璃纸置于载玻片上,用显微镜对用显微镜对菌丝的形态进行观察。菌丝的形态进行观察。特点特点:可以避免一般染色制样时的固定作用对微生物细胞结构可以避免一般染色制样时的固定作用对微生物细胞结构的破坏的破坏,并可用于专门研究微生物的并可用于专门研究微生物的运动能力运动能力、摄食特性摄食特性及生及生长过程中的长过程中的形态变化形态变化。(2)染色观察染色观察n染色前固定样品的目的染色前固定样品的目的:n杀死细菌并使菌体黏附于玻片上；杀死细菌并使菌体黏附于玻片上；n增加其对染料的亲和力。增加其对染料的亲和力。n
20、常用酒精灯火焰加热和化学固定两种方法。常用酒精灯火焰加热和化学固定两种方法。第三节第三节显微镜下的微生物显微镜下的微生物不不同同光光镜镜照照片片(用四种不同技术制得的纤毛虫用四种不同技术制得的纤毛虫)a:明视野显微镜明视野显微镜;b:暗视野显微镜暗视野显微镜;c:相差显微镜相差显微镜;d:Nomarski显微镜显微镜微分干涉相衬显微镜光镜照片光镜照片(啤酒酵母属面包酵母细胞啤酒酵母属面包酵母细胞)a:明视野显微镜明视野显微镜b:相差显微镜相差显微镜c:暗视野显微镜暗视野显微镜光镜照片光镜照片(正在大量繁殖面包酵母细胞正在大量繁殖面包酵母细胞)a:明视野显微镜明视野显微镜b:暗视野显微镜暗视野显
21、微镜光镜照片(纤毛虫的活细胞)a:明视野显微镜(x100);b:暗视野显微镜(x110);c:相差显微镜(x100)光光镜镜照照片片(a:两端生鞭毛的大肠杆菌两端生鞭毛的大肠杆菌;暗视野显微镜暗视野显微镜;b:紫色红螺菌紫色红螺菌;相差显微镜相差显微镜)电电镜镜照照片片(淋巴细胞淋巴细胞)(a:透射电镜透射电镜;淋巴细胞薄片二维内部结构淋巴细胞薄片二维内部结构;b:扫描电镜扫描电镜;三维表面结构三维表面结构)电镜与光镜照片电镜与光镜照片(正在进食的纤毛虫正在进食的纤毛虫)n一、填空一、填空n1、无菌技术包括、无菌技术包括_、_无菌和无菌和_技术。技术。n2、最常用的灭菌方法有、最常用的灭菌方法
22、有_、_和和_等。等。n3、纯种分离方法通常用、纯种分离方法通常用_、_、_、_，其中，要测定食品中细菌的总数时，被测样品加入培养皿，其中，要测定食品中细菌的总数时，被测样品加入培养皿时应采用时应采用_方法。方法。n4、通常采用、通常采用_和和_方法来分离自然界中混杂微生方法来分离自然界中混杂微生物中只占少数的特定有用微生物，其原理是根据物中只占少数的特定有用微生物，其原理是根据_。n5、微生物菌种保藏的原理是在、微生物菌种保藏的原理是在_、_、_、_、_等环境条件下，使其处于代等环境条件下，使其处于代谢不活泼状态。谢不活泼状态。n6、_和和_是决定显微观察效果的一个重要因素，是决定显微观察效
23、果的一个重要因素，而而_又是决定物镜性能的最重要指标。又是决定物镜性能的最重要指标。n7、显微技术除了显微镜的特性外，还取决于、显微技术除了显微镜的特性外，还取决于_、_和和_。n8、用油镜观察时，需在载玻片与镜头之间加滴、用油镜观察时，需在载玻片与镜头之间加滴_，其作用，其作用_和和_。n二、是非题二、是非题n1、光学显微镜的分辨率与所用波长所正比。、光学显微镜的分辨率与所用波长所正比。（）n2、荧光显微技术原理是在紫外光的照射下，发荧光的物体会在、荧光显微技术原理是在紫外光的照射下，发荧光的物体会在黑暗的背景下表现为光亮的有色物体。（黑暗的背景下表现为光亮的有色物体。（）n3、明视野显微镜
24、观察到的微生物是透明的，而暗视野显微镜观、明视野显微镜观察到的微生物是透明的，而暗视野显微镜观察到的微生物是亮的。（察到的微生物是亮的。（）n4、透射电镜可以观察样品的表面结构，而扫描电镜可观察样品、透射电镜可以观察样品的表面结构，而扫描电镜可观察样品的内部结构。（）的内部结构。（）n三、名词解释三、名词解释n1、Pureculture：2、Colny：3、单孢子分离法：、单孢子分离法：4、灭菌：、灭菌：5、消毒：消毒：n四、问答题四、问答题n1、要想提高显微镜的分辨率和反差，从显微镜的设计要考虑哪、要想提高显微镜的分辨率和反差，从显微镜的设计要考虑哪几个主要因素？并举例说明。几个主要因素？并举例说明。n2、简述平板稀释法测定活菌数的操作过程，并分析该法成败的、简述平板稀释法测定活菌数的操作过程，并分析该法成败的关键。关键。n3、引起菌种退化的根本原因是什么？如何防止菌种退化？、引起菌种退化的根本原因是什么？如何防止菌种退化？