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1、关于纯培养和显微技术第1页，讲稿共49张，创作于星期三第一节第一节 微生物的分离和纯培养微生物的分离和纯培养一、无菌技术一、无菌技术t 用于分离、转接、培养微生物的器具事先不含任何微生物；用于分离、转接、培养微生物的器具事先不含任何微生物；t 在分离、转接、培养微生物做到无菌操作在分离、转接、培养微生物做到无菌操作 在分离、转接、纯种培养过程中为保持纯种的在分离、转接、纯种培养过程中为保持纯种的“纯纯洁洁”性而防止被其它微生物污染的技术。性而防止被其它微生物污染的技术。第2页，讲稿共49张，创作于星期三高温干热灭菌高温干热灭菌高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌试管、瓶子、培养皿等试管、瓶子、培养皿等常用
2、的灭菌方法：常用的灭菌方法：1、微生物培养的常用器具及接种室的灭菌、微生物培养的常用器具及接种室的灭菌（1）常用的器具：）常用的器具：第3页，讲稿共49张，创作于星期三紫外线紫外线杀菌效率与照射强度和时间的成积成正比杀菌效率与照射强度和时间的成积成正比化学消毒剂熏蒸灭菌化学消毒剂熏蒸灭菌 霉菌较多先用霉菌较多先用5%石碳酸喷洒，再用甲醛熏蒸石碳酸喷洒，再用甲醛熏蒸细菌较多乳酸和甲醛交替熏蒸细菌较多乳酸和甲醛交替熏蒸超净工作台的灭菌超净工作台的灭菌（2）接种室的空气灭菌）接种室的空气灭菌第4页，讲稿共49张，创作于星期三2、接种操作、接种操作无菌操作：无菌操作：培养基经过高压蒸汽灭菌后，用无菌工
3、具在无菌条件下将培养基经过高压蒸汽灭菌后，用无菌工具在无菌条件下将含菌材料移接于培养基的这一过程。含菌材料移接于培养基的这一过程。火焰附近（酒精灯、煤气灯）进行火焰附近（酒精灯、煤气灯）进行第5页，讲稿共49张，创作于星期三无菌操作：无菌操作：在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行第6页，讲稿共49张，创作于星期三微生物的纯种分离：微生物的纯种分离：从多种混杂的微生物中，经某种技术或方法获得从多种混杂的微生物中，经某种技术或方法获得单一菌株的过程。单一菌株的过程。微生物的纯培养物（微生物的纯培养物（pure culture)：一株菌种或一个培养物中的所有细胞或孢子
4、都是由一株菌种或一个培养物中的所有细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代一个细胞分裂、繁殖而产生的后代 二、微生物的分离纯培养技术二、微生物的分离纯培养技术第7页，讲稿共49张，创作于星期三纯种分离的原理和方法纯种分离的原理和方法第8页，讲稿共49张，创作于星期三1.1.用固体培养基分离纯培养法用固体培养基分离纯培养法原理：原理：使微生物稀释后在固体培养基平板上形成单个使微生物稀释后在固体培养基平板上形成单个菌落菌落方法：方法：稀释倒平板法稀释倒平板法 涂布平板法涂布平板法平板划线法平板划线法厌氧微生物的固体平板分离法厌氧微生物的固体平板分离法第9页，讲稿共49张，创作于星期三1、稀释
5、倒平板法、稀释倒平板法2、涂布平板法、涂布平板法对好氧菌、热敏感对好氧菌、热敏感菌效果不好！菌效果不好！使用较多的常规使用较多的常规方法，但有时涂方法，但有时涂布不均匀！布不均匀！第10页，讲稿共49张，创作于星期三第11页，讲稿共49张，创作于星期三3、平板划线法、平板划线法方法：方法：平行划线法平行划线法 之字形划线法之字形划线法 第12页，讲稿共49张，创作于星期三第13页，讲稿共49张，创作于星期三4、厌氧微生物的分离、厌氧微生物的分离厌氧罐厌氧罐厌氧手套箱厌氧手套箱对严格厌氧微生物的培养采用稀释摇管法进行分离对严格厌氧微生物的培养采用稀释摇管法进行分离第14页，讲稿共49张，创作于星
6、期三个别细胞较大细菌个别细胞较大细菌 固体平板不能长菌落固体平板不能长菌落 原生动物、藻类原生动物、藻类接种物用液体培养基顺序梯度稀释法分离接种物用液体培养基顺序梯度稀释法分离:2、用液体培养基分离纯培养、用液体培养基分离纯培养 第15页，讲稿共49张，创作于星期三培养物在液体培养基中进行顺序梯度稀释，使每一稀培养物在液体培养基中进行顺序梯度稀释，使每一稀释度都含有很多平行试管，如果同一个稀释度的大多释度都含有很多平行试管，如果同一个稀释度的大多数（一般应超过数（一般应超过95%）平行试管中没有微生物生长，）平行试管中没有微生物生长，有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。有微生物生长
7、的试管得到的培养物可能就是纯培养物。第16页，讲稿共49张，创作于星期三3、单细胞（孢子）分离法、单细胞（孢子）分离法t 一般采用显微操作仪，在显微镜下进行；一般采用显微操作仪，在显微镜下进行；t 操作难度与细胞或个体的大小成反比；操作难度与细胞或个体的大小成反比；解剖显微镜下用吸管挑选单细胞（孢子）解剖显微镜下用吸管挑选单细胞（孢子）第17页，讲稿共49张，创作于星期三4、选择培养分离法、选择培养分离法t 抑制大多数其它非目的微生物；抑制大多数其它非目的微生物；t 使待分离的目的微生物成为优势菌；使待分离的目的微生物成为优势菌；原理：原理：t创造适于目的微生物生长条件；创造适于目的微生物生长
8、条件；第18页，讲稿共49张，创作于星期三方法：方法：1、利用选择培养基直接分离目的微生物、利用选择培养基直接分离目的微生物2.富集培养富集培养第19页，讲稿共49张，创作于星期三1、利用选择培养基直接分离目的微生物、利用选择培养基直接分离目的微生物抑制性选择培养基（抑制性选择培养基（selective medium）:根据某种微生物的特殊营养要求或对某化学、物理因根据某种微生物的特殊营养要求或对某化学、物理因素的抗性而设计，只允许特定微生物生长，而同时素的抗性而设计，只允许特定微生物生长，而同时抑制抑制或阻止或阻止其它微生物生长的培养基。其它微生物生长的培养基。第20页，讲稿共49张，创作于
9、星期三例一：从土壤中分离筛选蛋白酶产生细菌例一：从土壤中分离筛选蛋白酶产生细菌第21页，讲稿共49张，创作于星期三含牛奶选择培养基目的菌的平板含牛奶选择培养基目的菌的平板第22页，讲稿共49张，创作于星期三例二：从土壤中分离筛选产高温淀粉酶（例二：从土壤中分离筛选产高温淀粉酶（65）细菌）细菌第23页，讲稿共49张，创作于星期三2.富集培养富集培养从自然界中分离到所需的特定微生物从自然界中分离到所需的特定微生物特定的条件特定的条件使目的微生物旺盛生长使目的微生物旺盛生长待分离微生物在群体中成为优势菌待分离微生物在群体中成为优势菌第24页，讲稿共49张，创作于星期三富集培养是分离微生物菌种最强有
10、力的技术手段之一。富集培养是分离微生物菌种最强有力的技术手段之一。根据微生物的特殊要求，从自然界分离出各类特异的微生物；根据微生物的特殊要求，从自然界分离出各类特异的微生物；例：从土壤中分离能降解利用对羟基苯甲酸的细菌例：从土壤中分离能降解利用对羟基苯甲酸的细菌第25页，讲稿共49张，创作于星期三5、二元培养物、二元培养物 培养物中只含有二种微生物，而且是有意识的培养物中只含有二种微生物，而且是有意识的保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。t 病毒和宿主细胞；病毒和宿主细胞；第26页，讲稿共49张，创作于星期三菌落（菌落（colony）：）
11、：单个（或一团相同）微生物在适宜的固体培养基表面或内部单个（或一团相同）微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细生长、繁殖到一定程度形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体胞生长群体众多菌落连成一片众多菌落连成一片菌苔（菌苔（lawn）第二节第二节 微生物观察技术微生物观察技术1.微生物群体肉眼观察微生物群体肉眼观察第27页，讲稿共49张，创作于星期三不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征（形状、颜色等），可以成为对该微都具有稳定的特征（形状、颜色等），可以成为对该
12、微生物进行分类、鉴定的重要依据。生物进行分类、鉴定的重要依据。第28页，讲稿共49张，创作于星期三第29页，讲稿共49张，创作于星期三同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落第30页，讲稿共49张，创作于星期三2、显微镜个体观察技术显微镜个体观察技术放大倍数放大倍数 分辨率分辨率 反差反差能辨别两点之间最小距离的能力能辨别两点之间最小距离的能力被观察物区别于背景的程度被观察物区别于背景的程度一、显微技术：一、显微技术：用显微镜进行观察的技术用显微镜进行观察的技术显微镜的自身特点有关显微镜的自身特点有关也取决于显微观察时对显微镜的正确使用也取决于显
13、微观察时对显微镜的正确使用良好的标本制作和观察技术良好的标本制作和观察技术评价显微镜性能的指标评价显微镜性能的指标第31页，讲稿共49张，创作于星期三二、光学显微镜的种类及原理二、光学显微镜的种类及原理1.1.普通光学显微镜普通光学显微镜第32页，讲稿共49张，创作于星期三光学显微镜的一般配置光学显微镜的一般配置如何实现光学显微镜一般配置的最佳观察效果？如何实现光学显微镜一般配置的最佳观察效果？目镜：目镜：10 15 ；物镜：；物镜：100 ；总放大倍数；总放大倍数10001500 ；第33页，讲稿共49张，创作于星期三 l l分辨率（最小可分辨距离）分辨率（最小可分辨距离）=2n sin q
14、 q：可见光波长：可见光波长 n：玻片与物镜间介质的折射：玻片与物镜间介质的折射率率：物镜镜口角的半数：物镜镜口角的半数 n sin：物镜的数值口径值：物镜的数值口径值第34页，讲稿共49张，创作于星期三提高普通光学显微镜分辨率的技术措施：提高普通光学显微镜分辨率的技术措施：使用波长较短的可见光（使用波长较短的可见光（450nm的蓝光）；的蓝光）；使用油浸物镜使用油浸物镜增大反差（色差）的技术措施：增大反差（色差）的技术措施：对微生物细胞或特殊结构染色对微生物细胞或特殊结构染色 第35页，讲稿共49张，创作于星期三2、特殊的光学显微镜、特殊的光学显微镜相差显微镜相差显微镜暗视野显微镜暗视野显微
15、镜荧光显微镜荧光显微镜第36页，讲稿共49张，创作于星期三相差显微镜的原理：相差显微镜的原理：当光线通过透明的活细胞时，由于细胞内各部当光线通过透明的活细胞时，由于细胞内各部分结构密度的差异（或折射率的不同分结构密度的差异（或折射率的不同)，而使光，而使光波的相位发生变化，形成相位差，但人的眼睛波的相位发生变化，形成相位差，但人的眼睛分辨不出相位差异，相差显微镜就是根据光波分辨不出相位差异，相差显微镜就是根据光波干涉利用特殊的干涉利用特殊的环状光阑和相差板环状光阑和相差板将相位差转变为将相位差转变为振幅差，从而使原来透明的物体表现出明显的明暗振幅差，从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对
16、比度增强。差异，对比度增强。用途：活细胞运动情况和微细结构的观察用途：活细胞运动情况和微细结构的观察第37页，讲稿共49张，创作于星期三暗视野显微镜原理：暗视野显微镜原理：聚光系统加以改造，实现斜射照明，给样品照明的光聚光系统加以改造，实现斜射照明，给样品照明的光不直接穿过物镜，而是由样品反射或折射后在进入物不直接穿过物镜，而是由样品反射或折射后在进入物镜，所以样品是一个暗背景下显现亮的物象。镜，所以样品是一个暗背景下显现亮的物象。暗视野显微镜的分辨率很高暗视野显微镜的分辨率很高荧光显微镜的原理：荧光显微镜的原理：在紫外线的照射下，发荧光的物体会在黑暗的背景在紫外线的照射下，发荧光的物体会在黑
17、暗的背景下表现为光亮的有色物体下表现为光亮的有色物体第38页，讲稿共49张，创作于星期三第39页，讲稿共49张，创作于星期三光学显微镜的特性光学显微镜的特性第40页，讲稿共49张，创作于星期三二、电子显微镜的种类及原理二、电子显微镜的种类及原理 1、透射电镜（、透射电镜（transmission electron microscope,TEM）电磁波作电磁波作“光源光源”高速电子透射样品，电子束通过电磁场产生偏转、汇集高速电子透射样品，电子束通过电磁场产生偏转、汇集或发散等复杂的螺旋式运动，聚集成像，用荧光屏或感或发散等复杂的螺旋式运动，聚集成像，用荧光屏或感光胶片做记录。光胶片做记录。电磁波
18、波长短，分辨率高：光学显微镜电磁波波长短，分辨率高：光学显微镜m级，电镜级，电镜nm级。级。第41页，讲稿共49张，创作于星期三2、扫描电镜（、扫描电镜（scanning electron microscope,SEM）电子束做电子探针在样品表面扫描时激电子束做电子探针在样品表面扫描时激发出二次电子，二次电子产生的多少与发出二次电子，二次电子产生的多少与样品表面立体形貌有关。对二次电子处样品表面立体形貌有关。对二次电子处理，在荧光屏呈现放大样品表面立体图理，在荧光屏呈现放大样品表面立体图像。像。第42页，讲稿共49张，创作于星期三第43页，讲稿共49张，创作于星期三3、扫描隧道显微镜、扫描隧道
19、显微镜原理：原理：当金属探针可以接触到样品表面的电子云时，当金属探针可以接触到样品表面的电子云时，在探针和样品之间加零点几伏的电压将有隧道电在探针和样品之间加零点几伏的电压将有隧道电流产生，该电流对针尖及样品间的距离非常敏感，流产生，该电流对针尖及样品间的距离非常敏感，保持探针扫描样品时的电压和高度恒定，通过记保持探针扫描样品时的电压和高度恒定，通过记录电压或电流的变化了解样品的表面形貌。录电压或电流的变化了解样品的表面形貌。4、原子力显微镜原子力显微镜用激光装置监测探针随样品表面的升降变化来获取用激光装置监测探针随样品表面的升降变化来获取样品表面形貌的信息样品表面形貌的信息第44页，讲稿共49张，创作于星期三第45页，讲稿共49张，创作于星期三三、显微观察样品的制备三、显微观察样品的制备（1）光学显微镜制样）光学显微镜制样有活体直接观察和染色观察有活体直接观察和染色观察 悬滴法悬滴法 活体观察活体观察 压滴法压滴法 菌丝包埋法菌丝包埋法 第46页，讲稿共49张，创作于星期三（2）细菌染色法）细菌染色法:种类种类第47页，讲稿共49张，创作于星期三步骤：步骤：固定（加热固定、化学剂固定）固定（加热固定、化学剂固定）染色染色第48页，讲稿共49张，创作于星期三感感谢谢大大家家观观看看第49页，讲稿共49张，创作于星期三