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1、 独 创 性 声 明 本人声明，所呈交的学位论文，是在指导教师指导下，通过我的努力取得的成果，并且是自 己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已经作了答谢的地方外，论文中不包含其他人 发表或撰写过的研究成果，也不包含在江西农业大学或其它教育机构获得学位或证书而使用过的 材料。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意。如被査有 严重侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任 . 本人完全了解江西农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即学校有权送交论文的复印件 , 允许论文被査阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制 手段保存论文
2、。 - 学位论文作者 亲笔签名 ： jJL 日期 ： t 论文使用授权的说明 保密，在 _年后解密可适用本授权书。口 不保密，本学位论文厲于不保密 * ( 请 在 方 框 内 打 学位论文作者亲笔签名 : I i 日期 : . / jr 指导教师亲笔签名 : ： M 日期 : 日期 : . I Abstract . II 第一章 文南犬综述 . 1 1乳酸菌的研宄概述 . 1 1.1乳酸菌的定义及研宄近况 . 1 1.2降胆固醇乳酸菌的研宄现状 . 2 1.3乳酸菌的生理功能 . 2 1.3.1维持肠道菌群平衡，治疗肠道功能紊乱 . 2 1.3.2改善产品风味，提高产品的营养价值 . 2 1.
3、3.3抑菌功會泛，延长保质其月 . 3 1.3.4促进营养成分的分解和吸收 . 3 1.3.5降低胆固醇的作用 . 3 1.3.6抗肿瘤的作用 . 4 1.3.7提高免疫力的作用 . 4 1.3.8延缓衰老的作用 . 4 2胆固醇与人体的健康 . 4 2.1胆固醇的生理功能 . 4 2.2高胆固醇对人体健康的危害 . 5 3乳酸菌在泡菜生产中的应用 . 5 3.1泡菜简介及其生产现状 . 5 3.2乳酸菌发酵泡菜的机理及过程 . 6 3.3乳酸菌发酵泡菜的意义 . 7 3.3.1提高泡菜制品的营养价值 . 7 3.3.2改善泡菜制品的风味 . 7 3.3.3防止腐败，延长泡菜的保质期 . 7
4、3.3.4增加泡菜制品的医疗保健作用 . 7 3.3.5降解泡菜中的亚硝酸盐 . 8 3.4发酵方法对泡菜质量的影响 . 8 3.4.1自然发酵对泡菜质量的影响 . 8 3.4.2接种发酵对泡菜质量的影响 . 8 4本课题的研宄目的与内容 . 9 4.1研宄目的 . 9 4.2研宄内容 . 9 第二章泡菜中乳酸菌株的分离、筛选与鉴定 . 10 1 前 . 10 2材料与方法 . 10 2.1实验材料 . 10 2.2主要试剂 . 10 2.3主要仪器与设备 . 11 2.4培养基 . 11 2.5主要溶液的配制 . 12 3实验方法 . 12 3.1样品处理 . 12 3.2菌种的分离纯化 .
5、 12 3.3菌种的复筛 . 12 3.4生理生化鉴定 . 12 3.5乳酸菌 16SrDNA分子鉴定 . 13 3.5.1 16SrDNA 扩增 . 13 3.5.2电泳分析 PCR结果 . 13 3.5.3 16S rDNA测序及分析 . 13 3.6菌株的生物学特性 . 14 4实验结果与分析 . 14 4.1乳酸菌的分离 . 14 4.2生理生化鉴定 . 15 4.3 W菌株的 PCR扩增结果 . 15 4.4 W菌株的测序结果 . 16 4.5 W菌株的生长曲线 . 17 4.6 W菌株产酸曲线 . 18 4.7 W菌株的耐盐性实验 . 18 4.8 W菌株的降胆固醇性能实验 . 1
6、9 5本章结论 . 20 第三章体外降胆固醇能力试验 . 21 1 . 21 2材料与方法 . 21 2.1实验材料 . 21 2.2主要试剂 . 21 目录 2.3主要仪器与设备 . 22 2.4培养基 . 22 2.5主要溶液的配制 . 22 3实验方法 . 22 3.1胆固醇含量的测定 . 22 3.1.1胆固醇标准曲线的制作 . 22 3.1.2发酵液中胆固醇含量的测定 . 23 3.2植物乳杆菌耐胆盐和耐酸能力的测定 . 23 3.2.1耐胆盐能力的测定 . 23 3.2.2耐酸能力的测定 . 23 3.3植物乳杆菌体外降解胆固醇能力的测定 . 23 4实验结果与分析 . 24 4.
7、1胆固醇标准曲线 . 24 4.2耐胆盐能力测定结果 . 24 4.3耐酸能力测定结果 . 25 4.4体外降解胆固醇能力的测定结果 . 26 5本章结论 . 26 第四章植物乳杆菌在发酵泡菜中的应用 . 28 1 前 . 28 2材料与方法 . 28 2.1实验材料 . 28 2.2主要试剂 . 28 2.3主要仪器与设备 . 29 2.4培养基 . 29 2.5主要溶液的配制 . 29 3实验方法 . 30 3.1泡菜的制作 . 30 3.1.1自然发酵泡菜的制作 . 30 3丄 2发酵剂的制取 . 30 3丄 3接种发酵泡菜的制作 . 30 3.2感官评定方法 . 30 3.3泡菜齒 P
8、H值的测定方法 . 31 3.4乳酸菌计数 . 31 3.5耐胆盐乳酸菌计数 . 31 m _ 目录 _ 3.6亚硝酸盐的测定 . 32 3.6.1亚硝酸盐标准曲线的制作 . 32 3.6.2泡菜样品中亚硝酸盐的测定 . 32 4结果与分析 . 32 4.1泡菜感官评定结果 . 33 4.2泡菜齒 PH值 . 33 4.3乳酸菌的数量 . 34 4.4耐胆盐的乳酸菌数量 . 35 4.4.1亚硝酸盐标准曲线 . 35 4.4.2泡菜样品中亚硝酸盐含量的测定结果 . 36 5本章结论 . 37 结论与展望 . 38 1论文主要结论 . 38 2研宄展望 . 38 参考文献 . 39 致谢 . 4
9、4 IV 摘要 摘要 胆固醇摄入过量带来的高脂血症和肥胖症，目前己经成为危害人体健康的重要 原因，如何降低人体血清胆固醇含量日益受到人们关注。近年来许多研宄表明发酵 制品及其乳酸菌具有调节血脂代谢、降低人体血清胆固醇的作用。泡菜是我国一种 传统而独特的发酵蔬菜制品，主要由乳酸菌发酵而成。本研究旨在从自然发酵的泡 菜中筛选出具有耐胆盐、耐酸和高降胆固醇能力的乳酸菌，对分离菌株进行生理生 化和分子生物学鉴定，进一步研宄其耐胆盐、耐酸和降胆固醇的能力，并初步考察 其作为发酵剂发酵泡菜及对泡菜品质的影响，为优良泡菜发酵剂和血脂代谢益生菌 调节剂的开发研究提供基础数据。研究的主要内容与结论如下： (1)
10、 从市售自然发酵的泡菜中，用改良的 MRS培养基筛选到 15株乳酸菌，然 后转接于MRS固体培养基进行复筛，最后筛选出 1株无芽孢、杆状、耐胆盐的乳 酸菌，命名为 W菌株。经生理生化及 16SrDNA鉴定， W菌株为植物乳杆菌。 (2) W菌株在含 0.3%胆盐的培养基中 37 C条件下培养，生长良好，培养 24 h 后活菌浓度达 107 cfu/mL;在 pH1.5的环境下培养 24 h， 活菌数仍能达到 106 cfu/mL 以上，说明该菌株具有较强的耐受胆盐和低 pH值的性能，预示其具有潜在的耐受 人体胃酸环境和肠道胆盐的能力。体外降解胆固醇的实验结果表明，在不含胆盐的 胆固醇液体培养基
11、中 37 C培养 24 h， W菌株降解胆固醇百分率达 29%;而在含胆 盐 0.2%的胆固醇液体培养基中，其胆固醇降解率提高至 33.6%;当进一步提高胆盐 的含量，胆固醇降解率下降，其降胆固醇的具体机理有待进一步深入研宄。 (3) 以自然发酵泡菜为对照，以 W菌株作为发酵剂，考察不同接种量对发酵泡 菜的影响。结果表明，菌种接种量在 1.8xl04cfu/mL 1.8xl05cfu/mL的浓度范围， 随着接种量的增大，泡菜的感官评定总分增加，泡菜卤 pH值降低的速度加快，在 发酵的第 4 d即降低至 pH 3.4;而自然发酵对照组在第 7 d pH值下降至 3.4,最终 各组泡菜 pH值均稳
12、定在 3.3左右。泡菜中乳酸菌总数，实验组在第 4 d即达到峰值， 浓度达 lxKTcfu/mL以上，其中能耐受 0.3%胆盐作用的乳酸菌数量占乳酸菌总数 约为 40%;而对照组则于第 5 d乳酸菌总数达 lxl097cfu/mL峰值，其中耐受 0.3% 胆盐作用的乳酸菌数量占乳酸菌总数低于 10%。对照组泡菜中的亚硝酸盐峰值出现 在第 3d，为 26.4mg/kg， 至发酵第 6d基本稳定在 0.5mg/kg;而实验组泡菜中亚硝 酸盐峰值出现在第 2 d， 约 10 mg/kg， 第 3 d则低于 0.5 mg/kg。 以上结果表明，添 加 W菌株作为发酵剂可以缩短泡菜发酵时间，提高泡菜中乳
13、酸菌尤其是耐胆盐乳 酸菌数量，降低亚硝酸盐含量，提升泡菜的食用品质。 关键词 ： 泡菜；乳酸菌；分离鉴定；降胆固醇；降亚硝酸盐 I Abstract Abstract Hyperlipidemia and obesity caused by excessive intake of cholesterols has become an important factor affecting peoples health. How to lower down the amount of cholesterols in human beings serum has attracted the publ
14、ic attention. In decades, many researches proved that fermented food and the lactobacillus in it have good effect in regulating the lipid metabolism and lowering down the amount of cholesterols in human beings serum. Pickle is a traditional fermented food in China. The researcher screens lactobacill
15、us which can resist bile salts and acid, lower down the amount of cholesterols from the fermented pickles. After physiological and biochemical experiment and molecular biology identification, the researcher moves on to study lactobacilluss ability of resisting bile salts, acid and lowering down chol
16、esterols and its effect on the quality of fermented pickles as a starter. In all, this research can provide basic data for studying or developing good starters for fermented pickles and good regulators of blood fat metabolism probiotics. The main research content and summary are as the follows: (1)
17、The researcher first screened 15 positive strains from the pickles in market, and then inoculated them to MRS solid medium. After the second time screening, the researcher isolated one rod-shaped which can resist bile salts with no spores and signed it as W strain. After gram staining, microscopic e
18、xamination, physiological and biochemical experiment and 16SrDNA identification, this strain W was identified as a lactobacillus plantarum strain. (2) The strain W grows well at 0.3 percent of bile salt solid medium after 24 hours, the number of viable bacteria grows up to 107 cfu/ml. The viability
19、still reaches 106 cfu/ml at pH 1.5 after 24 hours. All the above means that the strain W can survive low pH value and resist the effects of bile acids in humans gastrointestinal tract. The experiment results of lowering the amount of cholesterol in vitro showed that cholesterol lowers about 29% in a
20、mount in solid medium with no bile salts after 24 hours, and it lowers 33.6% in solid medium with 0.2 percent of bile salt. Too high, lactic acid bacteria cannot thrive which will then affect their ability of lowering cholesterol, the specific mechanism of lowering cholesterol needs further research
21、. (3) Controlled with naturally fermented pickles, strain W was used as lactic starter to study the effects of different inoculums on fermented pickles. The results showed that when inoculum concentrations were in the range of 1.8xl04 cfu/mL 1.8xl05cfu/mL, with the increase of inoculum, the sensory
22、evaluation scores of pickles rised, the pH of pickle brine dropped more quickly, lowering to pH 3.4 at the fourth day of the fermentation, while the pH of control test dropped to 3.4 at the seventh day and the final pH values of each group were stable at about 3.3. The total number of lactic acid ba
23、cteria in experimental group and control group peaked respectively at the 4d and 5d, with II Abstract concentration above lxl010cfu/mL and lxl097cfu/mL. Lactic acid bacteria which could tolerate 0.3% of bile salt concentration represented approximately 40% of the total in the experimental group whil
24、e less than 10% of the total in control group. In the experimental group, peak of nitrite content was lOmg/kg appearing at the 2d and the content was stable at 0.5mg/kg at the 3d. In the control group, peak of nitrite content was 26.4mg/kg appearing at the 3d and the content was stable at 0.5mg/kg a
25、t the 6d. These results indicated that the addition of strain W could shorten the fermentation time, increase the number of lactic acid bacteria especially which could resist bile salt, reduce the content of nitrite, improve the edible quality of pickles. Key words: Pickle; Lactic acids bacteria; Is
26、olation and identification; Lowering cholesterol; Degradation nitrite m 第一章文献综述 第一章文献综述 近十多年来，随着社会生产力及科学技术的快速发展，人们的生活水平得到了 显著的提高，人们对膳食营养和健康问题也日益关注，作为广泛应用于食品行业中 的乳酸菌更是人们关注的热点。乳酸菌广泛存在于自然界中，种类繁多，也是人和 动物肠道内的优势正常菌群。乳酸菌作为一种益生菌对人和动物的健康起着促进作 用，从而成为食品行业应用最为广泛、种类最多的益生菌菌种。随着乳酸菌诸多有 益功能的不断开发，对乳酸菌及其发酵制品的应用在国内外发展迅
27、速，销量逐 年递 增。 我国人民早于公元前 3世纪在不知不觉中就学会利用自然界中的乳酸菌制作泡 菜，经过几千年的历史充分证明了乳酸菌及其发酵制品食用的安全性和可靠性 1。 目前，乳酸菌及其发酵制品被广泛应用于食品、工业、农业及医药保健等各个领域。 近年研宄表明，乳酸菌具有调节肠道菌群平衡和降解胆固醇的功能，具有预防高血 脂和肥胖症的功效，日益受到人们的重视。因此，对降解胆固醇乳酸菌的分离筛选、 功能特性和应用研宄开始受到学者的关注和重视 2。 1乳酸菌的研宄概述 1.1乳酸菌的定义及研究近况 乳酸菌最早于 1857年被发现，距今已有一百多年的历史。乳酸菌是一类可发 酵糖类以乳酸为主要产物并且无
28、芽孢，不能还原硝酸盐，不运动，厌氧或兼性厌氧 的革兰氏阳性细菌的通称 M， 它可以调节肠道菌群平衡、降低血液中胆固醇的含量、 抑制肠道内腐败菌的生长繁殖并预防致病菌感染、增强机体免疫力、降解亚硝酸盐、 预防肿瘤及抗肿瘤等作用 4_1(5。这类细菌在自然界中分布及其广泛而且种类繁多、 资源丰富，已被广泛应用于工业、农业和医药保健等与人类生活息息相关的一些领 域中，特别是在食品行业中乳酸菌的应用更为广泛。 目前，许 多国家的学者对自然分离的乳酸菌进行了深入的研宄并且将已分离得 到多种优势乳酸菌运用到工业生产中，获得了很高的经济效益。 Gardner等人 11将 植物乳杆菌、肠膜明串珠菌及乳酸片球菌冻干后重新配制，用于一些混合蔬菜的发 酵，最早是作为直投式乳酸菌发酵剂在泡菜中使用。 Tolonena等人 12使用诸多种类 的乳酸菌发酵泡菜，使金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等的增殖受到抑制，从而提高了 发酵食品的安全性 。 Lye