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1、掌握碱变性法从大肠杆菌中提取质粒DNADNA原理和方法。掌握琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNADNA的技术。一、实验目的第1页/共11页 质粒（plasmid）是一种独立的稳定的遗传因子，存在于细菌等细胞中。它们为双链、闭环的DNA分子，大小从1kb到200kb不等，具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数并表达所携带的DNA基因信息，但其复制和转录要利用宿主细胞编码的一些酶和蛋白质，而宿主在没有质粒时是可以正常生长的。因此，质粒是一种寄生性的自主复制子。细菌质粒是基因工程中常用的基因载体，也是分子生物学中研究基因结构、功能及其复制、表达的好材料。二、实验原理第2页/共11页l碱变性抽
2、提法法是常用的方法之一.l此法基于染色体DNADNA与质粒DNADNA的变性与复性差异而达到分离的目的。l在pHpH高达12.612.6的条件下，染色体DNADNA的氢键断裂、双螺旋解开而变性；质粒DNADNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链未完全分离，当用pH4.8pH4.8的KacKac高盐缓冲液调节pHpH至中性时，变性的质粒DNADNA又恢复到原来的构型，以可溶性状态存在于液相中，而染色体DNADNA不能复性，形成缠绕的网状结构，与不稳定的大分子RNARNA、蛋白质等一起沉淀出来。二、实验原理第3页/共11页抽提中各种因素的影响，质粒DNADNA可能以三种形式存
3、在：1.1.共价闭环DNADNA（covalently closed circular covalently closed circular DNADNA，cccDNAcccDNA），常以超螺旋形式存在；2.2.开环DNADNA（open circular DNAopen circular DNA，ocDNAocDNA），此种质 粒DNADNA的两条链中有一条链发生一处或多处断裂，形成缺刻，可以自由旋转从而消除了张力，形成松弛的环状分子；3.3.线状DNADNA（linear DNAlinear DNA，lDNAlDNA），质粒DNADNA的两条 链在同一处断裂所形成。在电泳时，同一质粒DNA
4、 DNA 的泳动速度根据迁移率从小到达分别为开环，线形 和超螺旋DNADNA。cccDNAcccDNA含量越高，表明制备的质粒DNADNA质量越好。第4页/共11页三、操作步骤三、操作步骤 1.取取2ml细菌培养液于细菌培养液于2ml Eppendorf离心管中，离心管中，4，5000rpm，离心，离心5min，弃上清（将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体尽可能流尽），保留菌体沉淀。弃上清（将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体尽可能流尽），保留菌体沉淀。2.沉淀悬浮于沉淀悬浮于100ul预冷的试剂预冷的试剂（TEG缓冲液）中，混匀（置混合器振缓冲液）中，混匀（置混合器振 荡），冰上置荡），冰上置10m
5、in。3.加入新配制的试剂加入新配制的试剂（碱裂解液）（碱裂解液）200ul，加盖，轻轻颠倒，加盖，轻轻颠倒34次，冰上置次，冰上置 10 min。4.加入预冷的试剂加入预冷的试剂（乙酸钾溶液）（乙酸钾溶液）150ul，盖紧管盖，颠倒数次，冰上置，盖紧管盖，颠倒数次，冰上置10 min。12000rpm，4，离心，离心10min，以除去细胞碎片及大部分细菌染色体，以除去细胞碎片及大部分细菌染色体DNA。5.上清液移入另一干净离心管中，加入等体积的平衡酚轻摇，上清液移入另一干净离心管中，加入等体积的平衡酚轻摇，12000rpm，4，离心，离心10min。6.取上层水相置于另一离心管中，加入等体积
6、的氯仿（氯仿：异戊醇取上层水相置于另一离心管中，加入等体积的氯仿（氯仿：异戊醇=24：1）抽提，抽提，12000rpm，4，离心，离心10min。7.取上层水相置于另一离心管中，加入取上层水相置于另一离心管中，加入2倍体积的预冷的无水乙醇，混匀后倍体积的预冷的无水乙醇，混匀后 置置20过夜（至少要放置过夜（至少要放置2h以上）。以上）。8.12000rpm，4，离心，离心10min，弃上清，将管口倒置于纸巾上使所有液体尽，弃上清，将管口倒置于纸巾上使所有液体尽 可能流出。可能流出。9.加入加入1ml70%乙醇洗沉淀一次。乙醇洗沉淀一次。12000rpm，4，离心，离心10min。10.弃上清，
7、将管口倒置于纸巾上使液体流尽，放置干燥或真空干燥，即得质粒弃上清，将管口倒置于纸巾上使液体流尽，放置干燥或真空干燥，即得质粒 DNA制品。制品。11.将沉淀溶于将沉淀溶于20ulTE缓冲液，（临用前加入缓冲液，（临用前加入1u 或或20ug/ml RNaseA）待用。）待用。第5页/共11页50 mM 葡萄糖25 mM Tris-HCl10 mM EDTA-Na2200 mM NaOH 1%（W/V）SDS3 M NaAC省去25 min30 min 以上实验步骤第6页/共11页l 不同的DNADNA片段由于其电荷、分子量大小及构型的不同，在电泳时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带。l
8、 核酸构型不同，在凝胶中的电泳速度差别较大。同一质粒DNADNA的泳动速度次序为：共价闭环DNADNA开环DNADNA线状DNADNA。l溴化乙锭可插入到DNADNA分子的双链中。在波长254nm254nm紫外光照射下插入溴化乙锭的DNADNA显橙红色荧光，所以溴化乙锭可以作荧光指示剂指示DNADNA含量和位置。四、DNA的琼脂糖凝胶电泳原理第7页/共11页 1.1.琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶的的制制备备：本本实实验验采采用用1.0%1.0%的的琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶。称称取取0.3g0.3g琼琼脂脂糖糖放放入入锥锥形形瓶瓶，加加入入30ml30ml电电泳泳缓缓冲冲液液，置置于于微微波波炉炉使使其其充
9、充分分融融化化。室室温温放放置置至至6060左左右右，加加入入EBEB使使其其终终浓浓度度为为0.5ug/ml0.5ug/ml，混匀，倒胶板（，混匀，倒胶板（30ml/30ml/板）。板）。2.2.凝胶板的制作：凝胶板的制作：用用1cm1cm宽的胶带纸沿平板电泳槽模板两宽的胶带纸沿平板电泳槽模板两端边缘围成高端边缘围成高4mm4mm的墙，在其一端放置样品梳。将准备好的模的墙，在其一端放置样品梳。将准备好的模板置于水平台上，迅速将上面板置于水平台上，迅速将上面胶液倒在模板的中央，让胶液自胶液倒在模板的中央，让胶液自由流向四周。待胶液充分冷却凝由流向四周。待胶液充分冷却凝固，将胶纸围墙慢慢取下，制
10、备固，将胶纸围墙慢慢取下，制备好的凝胶板放入电泳槽中，加电好的凝胶板放入电泳槽中，加电泳缓冲液直至没过胶面约泳缓冲液直至没过胶面约1mm1mm深，深，取出样品梳。取出样品梳。五、琼脂糖凝胶电泳操作步骤第8页/共11页3.3.加样：加样：10 ul TE 10 ul TE 溶解溶解+4 ul+4 ul 上样上样缓冲液，取缓冲液，取10 ul10 ul点样点样4.4.电泳：电泳：l电压：电压：120V120Vl电泳时间：电泳时间：45 min45 minl电泳终止：指示剂距离凝胶前电泳终止：指示剂距离凝胶前沿约沿约1cm1cm处处5.5.检测：检测：取出胶板，用紫外检测仪取出胶板，用紫外检测仪观察
11、结果。纯的质粒观察结果。纯的质粒DNADNA只有超螺只有超螺旋旋DNADNA一条带。一条带。6.6.凝胶处理：凝胶处理：鉴定后的凝胶应放在鉴定后的凝胶应放在指定的地方，待干燥后烧毁，不能指定的地方，待干燥后烧毁，不能倒在垃圾中，以防倒在垃圾中，以防EBEB污染。污染。五、琼脂糖凝胶电泳操作步骤第9页/共11页六、实验报告要求一、原理二、操作三、结果（铅笔绘图：正负极，条带数目、名称、强弱、距离）四、结果说明五、思考题1 1、分离提取DNADNA的过程中哪些因素会引起链的断裂?2 2、本实验为了质粒DNADNA纯度和分子的完整性，采用了哪些措施？第10页/共11页感谢您的观看！第11页/共11页