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1、关于实验一质粒的提关于实验一质粒的提取及琼脂糖凝胶电泳取及琼脂糖凝胶电泳现在学习的是第1页，共23页载体构建过程载体构建过程一、质粒一、质粒DNA的提取及电泳检测的提取及电泳检测二、目的基因的二、目的基因的PCR扩增及产物检测扩增及产物检测三、三、DNA的定性定量分析及酶切产物检测的定性定量分析及酶切产物检测质粒双酶切PCR产物双酶切四、酶切产物及四、酶切产物及PCR产物的纯化及检测产物的纯化及检测五、五、DNA的连接及检测的连接及检测六、大肠杆菌的培养和超级感受态细胞的制备六、大肠杆菌的培养和超级感受态细胞的制备七、质粒七、质粒DNA的原核转化和蓝白斑筛选的原核转化和蓝白斑筛选酶切产物+酶切
2、产物T载体+PCR产物现在学习的是第2页，共23页实验学时：实验学时：6学时学时实验类型：综合性实验类型：综合性每组人数：每组人数：4人组人组实验一实验一质粒质粒DNA的提取的提取及及琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测现在学习的是第3页，共23页一、一、实验实验目的目的通通过过本本实验实验学学习习和掌握碱裂解法提和掌握碱裂解法提取取质质粒的技粒的技术术和方法。和方法。一、碱裂解法小量制备质粒一、碱裂解法小量制备质粒DNA现在学习的是第4页，共23页质粒按复制方式分为两种类型：松弛型质粒 20200个拷贝/细胞 严紧型质粒 12个拷贝/细胞实验背景实验背景质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链
3、质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNADNA分子，能稳定地独立存在分子，能稳定地独立存在分子，能稳定地独立存在分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在；大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在；大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子
4、，以超螺旋形式存在；大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在；质粒质粒DNADNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，称为开环两条链中有一条链发生一处或多处断裂，称为开环DNADNA；如果质粒；如果质粒DNADNA的两条链的两条链在同一处断裂，则形成线状在同一处断裂，则形成线状DNADNA。当提取的质粒。当提取的质粒DNADNA电泳时，同一质粒电泳时，同一质粒DNADNA其其超螺旋超螺旋形式的泳动速度要比形式的泳动速度要比开环开环和线状分子的泳动速度快。和线状分子的泳动速度快。现在学习的是第5页，共23页由由pUC18载体改建而成，在载体改建而成，在pUC18载体的载体
5、的MCS处的处的XbaI和和SalI识别位点之间插入了识别位点之间插入了EcoRV识别位点，用识别位点，用EcoRV进行酶切反进行酶切反应后，再在两侧的应后，再在两侧的3端添加端添加“T”而成。因大而成。因大部分耐热性部分耐热性DNA聚合酶进行聚合酶进行PCR反应时都反应时都有有PCR产物的产物的3末端添加一个末端添加一个“A”的特性，的特性，所以使用本制品可以大大提高所以使用本制品可以大大提高PCR产物产物的连接、克隆效率。的连接、克隆效率。复制起点复制起点筛选标记基因筛选标记基因多克隆位点多克隆位点现在学习的是第6页，共23页二、二、实验实验原理原理高碱高碱细菌的细胞壁破裂，内容物释放细菌
6、的细胞壁破裂，内容物释放染色体染色体DNADNA断裂成不同长度的线性双链断裂成不同长度的线性双链DNADNA；线性双链线性双链DNADNA片段中的氢键断裂，双链解离变性。片段中的氢键断裂，双链解离变性。质粒质粒DNADNA不发生断裂，保持双链闭合环状；不发生断裂，保持双链闭合环状；双链双链DNADNA并不完全分离。并不完全分离。高酸高酸中和中和至中至中性性变性的染色体变性的染色体DNADNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物成网络状大分子不溶性沉淀物质粒质粒DNADNA又恢复天然构型，溶解在上清液中又恢复天然构型，溶解在上清液中纯化纯化RNA
7、RNA酶消化除去酶消化除去RNARNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质，并用酚抽提法除去残留的蛋白质现在学习的是第7页，共23页三、三、仪仪器、材料与器、材料与试剂试剂(一)仪器 1恒温培养箱 2恒温摇床 3台式离心机 4高压灭菌锅(二二)材料材料1含连接外源基因质含连接外源基因质粒的粒的E.coli 21.5mLEppendorf管管3吸头、微量移液器吸头、微量移液器现在学习的是第9页，共23页SolutionI50mmolL葡萄糖葡萄糖25mmolLTrisHCl(pH8.0)10mmolLEDTA(三三)主要试剂主要试剂溶液溶液：由葡萄糖、：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl组成组成(保
8、护、缓冲保护、缓冲)葡萄糖葡萄糖的作用是增加溶液的粘度的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的减少抽提过程中的机械剪切作用机械剪切作用,防止防止破坏质粒破坏质粒(保护作用保护作用)EDTA的作用是络合掉镁等二价金属离子的作用是络合掉镁等二价金属离子,防止防止DNA酶对质粒分子的降解酶对质粒分子的降解作用（保护作用）作用（保护作用）Tris-HCl使溶菌液维持溶菌作用的最适使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用）范围（缓冲作用）现在学习的是第10页，共23页SolutionII 0.4mol/LNaOH，2SDS,用前等体积混合用前等体积混合溶溶液液II：由由SDS（十十二二烷烷基基硫硫酸
9、酸钠钠）与与NaOH组组成成(裂裂解解、变变性性)SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性（裂解的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性（裂解细胞和蛋白质变性作用）细胞和蛋白质变性作用）NaOH（PH12）的作用是破坏氢键，使）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（分子变性（DNA变变性作用）性作用）现在学习的是第11页，共23页 溶液溶液溶液溶液IIIIII：HAcHAc和和和和 KAcKAc组成的高盐溶液组成的高盐溶液组成的高盐溶液组成的高盐溶液(复性，分离复性，分离复性，分离复性，分离)HAcHAc溶液溶液溶液溶液能中和溶液能中和溶液能中和溶液能中和溶液的碱性，使染色体的碱性
10、，使染色体的碱性，使染色体的碱性，使染色体DNADNA变性而发生缠绕，变性而发生缠绕，变性而发生缠绕，变性而发生缠绕，并使质粒并使质粒并使质粒并使质粒DNADNA复性。复性。复性。复性。KAcKAc会与会与会与会与SDSSDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀而除形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀而除形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀而除形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀而除去；溶液中的去；溶液中的去；溶液中的去；溶液中的DNADNA也会与蛋白质也会与蛋白质也会与蛋白质也会与蛋白质-SDS-SDS复合物缠绕成大分子而与小复合物缠绕成大分子而与小复合物缠绕成大分子而与小复合物缠绕
11、成大分子而与小分子质粒分子质粒分子质粒分子质粒DNADNA分离。分离。分离。分离。SolutionIII5molL乙酸钾乙酸钾60mL冰乙酸冰乙酸115mL水水285mL 现在学习的是第12页，共23页TE缓缓冲液冲液10mmo1LTrisHCl1mmo1LEDTA(pH8.0)胰胰RNA酶酶溶液溶液将将RNA酶酶溶于溶于10mmo1/LTrisHCl(pH75)和和15mmo1/LNaCl中，配成中，配成10mg/mL的的浓浓度，于度，于100加加热热15min，缓缓慢冷却至室温，慢冷却至室温，保存于保存于-20。现在学习的是第13页，共23页四、四、实实验验步步骤骤加加加加1.5ml1.5
12、ml1.5ml1.5ml培养物于培养物于培养物于培养物于EPEPEPEP管，管，管，管，12000g12000g12000g12000g30S30S30S30S 除去上清，加入冰的除去上清，加入冰的除去上清，加入冰的除去上清，加入冰的200 200 200 200 l l l l 溶液溶液溶液溶液I I I I，剧烈振荡，剧烈振荡，剧烈振荡，剧烈振荡EPEPEPEP管，室温管，室温管，室温管，室温3min3min3min3min 加入加入加入加入300300300300 l l l l 溶液溶液溶液溶液IIIIIIII，快速颠倒数次，冰浴，快速颠倒数次，冰浴，快速颠倒数次，冰浴，快速颠倒数次，
13、冰浴3min3min3min3min 加入加入加入加入400400400400 l l l l 冰冰冰冰溶液溶液溶液溶液IIIIIIIIIIII，温和振荡，温和振荡，温和振荡，温和振荡10s10s10s10s，冰浴，冰浴，冰浴，冰浴5min5min5min5min，12000g12000g12000g12000g5min5min5min5min转移上清到新转移上清到新转移上清到新转移上清到新EPEPEPEP管，加入等体积管，加入等体积管，加入等体积管，加入等体积酚酚酚酚/氯仿氯仿氯仿氯仿(1:1)(1:1)(1:1)(1:1)，温和振荡，冰浴，温和振荡，冰浴，温和振荡，冰浴，温和振荡，冰浴3m
14、in3min3min3min，12000g12000g12000g12000g5min5min5min5min 上层水相转移到新上层水相转移到新上层水相转移到新上层水相转移到新EPEPEPEP管管管管，加入，加入，加入，加入2 2 2 2倍体积倍体积倍体积倍体积无水乙醇无水乙醇无水乙醇无水乙醇，颠倒混匀，颠倒混匀，颠倒混匀，颠倒混匀，-20 -20 -20 -20 冰箱中放置冰箱中放置冰箱中放置冰箱中放置15min15min15min15min，12000g12000g12000g12000g 10min10min10min10min 弃上清，沉淀中加弃上清，沉淀中加弃上清，沉淀中加弃上清，沉
15、淀中加1ml 1ml 1ml 1ml 70%70%70%70%乙醇乙醇乙醇乙醇，12000g12000g12000g12000g5min 5min 5min 5min 去上清，管平放室温静置去上清，管平放室温静置去上清，管平放室温静置去上清，管平放室温静置10min10min10min10min，20 20 20 20 l TE l TE l TE l TE 溶解溶解溶解溶解DNADNADNADNA 现在学习的是第14页，共23页一、一、实验实验目的目的通通过过本本实验实验学学习琼习琼脂糖凝胶脂糖凝胶电电泳泳检测检测DNA的方的方法和技法和技术术。2.琼琼脂糖凝胶脂糖凝胶电电泳泳检测检测DNA
16、现在学习的是第15页，共23页DNA分子在分子在琼琼脂糖凝胶中泳脂糖凝胶中泳动时动时有有电电荷效荷效应应和和分子分子筛筛效效应应,DNA分子在高于等分子在高于等电电点的点的pH溶液中溶液中带负电带负电荷，荷，在在电场电场中向正极移中向正极移动动。由于糖。由于糖磷酸骨架在磷酸骨架在结结构上的构上的重复性重复性质质，相同数量的双，相同数量的双链链DNA几乎具有等量的几乎具有等量的净电净电荷，因此它荷，因此它们们能以同能以同样样的速度向正极方向移的速度向正极方向移动动。在一定。在一定的的电场电场强强度下，度下，DNA分子的迁移速度取决于分子分子的迁移速度取决于分子筛筛效效应应，即，即DNA分子本身的
17、大小和构型。具有不同的相分子本身的大小和构型。具有不同的相对对分子分子质质量的量的DNA片段泳片段泳动动速度不一速度不一样样，可，可进进行分离。行分离。DNA分子的迁移速度与相分子的迁移速度与相对对分子分子质质量的量的对对数数值值成反比成反比关系。关系。二、二、实验实验原理原理现在学习的是第16页，共23页凝胶凝胶电电泳不泳不仅仅可分离可分离不同相不同相对对分子分子质质量的量的DNA，也可以分离也可以分离相相对对分子分子质质量相同，但量相同，但构型不同的构型不同的DNA分子分子。如上次如上次实验实验提取的提取的质质粒粒DNA，有，有3种构型种构型,这这3种构型的种构型的质质粒粒DNA分分子在凝
18、胶子在凝胶电电泳中的迁移率不同。泳中的迁移率不同。溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物，使DNA在紫外光下发射很强的荧光。在溴化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于DNA的含量，这样就可以检测DNA的浓度。因此电泳后呈因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为泳动最快，其次为线状线状DNA，最慢的为开环质粒，最慢的为开环质粒DNA。现在学习的是第17页，共23页三、三、仪仪器、材料与器、材料与试剂试剂(一一)仪仪器器1微波炉微波炉2琼琼脂糖凝胶脂糖凝胶电电
19、泳系泳系统统3移液器移液器4凝胶成像系凝胶成像系统统现在学习的是第18页，共23页(二二)试剂试剂1（1）5TBE(50倍体倍体积积的的TBE贮贮存液）配存液）配1000mL5TBETris54g硼酸硼酸27.5g0.5molLEDTA20mLpH8.0或（或（2）50TAE(50倍体倍体积积的的TAE贮贮存液）存液）Tris242g乙酸乙酸57mL0.5molLEDTA100mLpH8.02凝胶加凝胶加样缓样缓冲液冲液(6x)3琼琼脂糖脂糖4溴化乙溴化乙锭锭溶液溶液(EB)0.5ugmL现在学习的是第19页，共23页四、实验步骤四、实验步骤(一一)、称取、称取0.5g0.5g琼脂糖，放入锥形
20、瓶中，加入琼脂糖，放入锥形瓶中，加入50 mL 0.5xT50 mL 0.5xTA AE E缓冲液，缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，温度降至置微波炉或水浴加热至完全溶化，温度降至60 60 左右时加入少许左右时加入少许EBEB溶溶液，摇匀，则为液，摇匀，则为1 1琼脂糖凝胶液。琼脂糖凝胶液。(二二)胶板的制胶板的制备备 1 1将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样样品梳子。品梳子。2 2将冷到将冷到6060左右的左右的琼琼脂糖凝胶液，加入脂糖凝胶液，加入EBEB后，后，缓缓缓缓倒入有机玻璃倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一内槽，直至有机玻璃板
21、上形成一层层均匀的胶面均匀的胶面(不要形成气泡不要形成气泡)。注意：注意：溴化乙溴化乙锭为锭为致癌物，致癌物，须须戴一次性塑料薄膜手套操作，并小心戴一次性塑料薄膜手套操作，并小心污污染染环环境。境。3 3待胶凝固后，取出梳子，放在待胶凝固后，取出梳子，放在电电泳槽内。泳槽内。4 4加入加入电电泳泳缓缓冲液至冲液至电电泳槽中。泳槽中。现在学习的是第20页，共23页(三三)加加样样用移液用移液枪枪将已加入上将已加入上样缓样缓冲液的冲液的DNA样样品加品加入加入加样样孔孔(记录记录点点样顺样顺序及点序及点样样量量)。(四四)电电泳泳1 1接通接通接通接通电电电电泳槽与泳槽与泳槽与泳槽与电电电电泳泳泳
22、泳仪仪仪仪的的的的电电电电源源源源(注意正注意正注意正注意正负负负负极，极，极，极，DNADNA片片段从段从负负极向正极移极向正极移动动)。DNADNA的迁移速度与的迁移速度与电压电压成成正比，最高正比，最高电压电压不超不超过过5V/cm5V/cm。2 2当溴酚当溴酚当溴酚当溴酚蓝蓝蓝蓝染料移染料移染料移染料移动动动动到距凝胶前沿到距凝胶前沿到距凝胶前沿到距凝胶前沿1 12cm处处处处，停止，停止，停止，停止电电电电泳。泳。泳。泳。现在学习的是第21页，共23页五、五、实验结实验结果果在紫外灯在紫外灯(360nm或或254nm)下下观观察染色后的察染色后的电电泳泳凝胶。凝胶。DNA存在存在处应显处应显出桔出桔红红色色荧荧光条光条带带(在紫外灯下在紫外灯下观观察察时应时应戴上防戴上防护护眼眼镜镜，紫外，紫外线对线对眼睛有眼睛有伤伤害作用害作用)。M 1 现在学习的是第22页，共23页感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第23页，共23页