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1、生物化学与分子生物学实验实验学时：8学时实验类型：综合性每组人数：2-3人组实验一 质粒DNA的提取及鉴定实验目的熟悉碱裂解法提取质粒和琼脂糖凝胶电泳的操作过程了解质粒的其他提取方法及质粒在基因工程中的应用掌握碱裂解法提取质粒和琼脂糖凝胶电泳的原理实验背景质粒（质粒（Plasmid)Plasmid)是细菌细胞内一种自我复制的环状双链是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNADNA分分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。染色体上。大多数来自细菌的质粒是大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以
2、超螺旋双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在形式存在；质粒质粒DNADNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，称为开环两条链中有一条链发生一处或多处断裂，称为开环DNADNA；如果质粒；如果质粒DNADNA的两条链在同一处断裂，则形成线状的两条链在同一处断裂，则形成线状DNADNA。当提。当提取的质粒取的质粒DNADNA电泳时，同一质粒电泳时，同一质粒DNADNA其其超螺旋超螺旋形式的泳动速度要比形式的泳动速度要比开环开环和线状分子的泳动速度快。和线状分子的泳动速度快。5质粒plasmid是存在于细菌染色体外的小型闭合环状双链DNA分子，在宿主细胞内可独立自主复制并赋予宿主细胞一定的遗传性
3、状质粒DNA1、部位不同：2、大小不同：质粒分子量较小，大小只有普通细菌染色体DNA的百分之一。基因组DNA分子量较大，细菌基因组约含3000个基因质粒DNA与基因组DNA区别pEGFP-N1质粒筛选标记MCS（多克隆位点）复制原点筛选标记筛选标记多克隆位点多克隆位点复制原点复制原点质粒提取方法的选择决定使用不同的方法质粒的量质粒的纯度要求质粒的大小大量提取质粒：二次扩增细菌，纯化方法要复杂小量提取质粒：单克隆培养，普通碱裂解法质粒纯度：要求高纯度、无内毒素等等，用不同的纯化方法（满足各种转基因实验的要求）质粒过大：温和裂解法质粒大小适中：碱裂解，煮沸法商业化质粒提取试剂盒11二、实验原理高碱
4、细菌的细胞壁破裂，内容物释放染色体DNA断裂成不同长度的线性双链DNA；线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性。质粒DNA不发生断裂，保持双链闭合环状；双链DNA并不完全分离。高酸中和至中性变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中纯化RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质碱裂解法提取质粒的原理1、强碱和SDS裂解细菌，细菌中的质粒或基因组DNA在碱性条件下发生变性。2、怎样去除基因组DNA？当加入酸性物质进行中和时，质粒DNA很快复性，染色体DNA则和变性蛋白质等缠绕在一起难以复性而形成沉淀，经离心随
5、细胞碎片一起去除；3、怎样去除蛋白质？留有质粒DNA的上清，经酚和氯仿去除蛋白质后,用乙醇沉淀质粒DNA，即得到质粒DNA.三、仪器、材料与试剂(一)仪器1恒温培养箱2恒温摇床3台式离心机4高压灭菌锅(二)材料1含连接外源基因质粒的E.coli 21.5mLEppendorf管3吸头、微量移液器SolutionI50mmolL葡萄糖葡萄糖25mmolLTrisHCl(pH8.0)10mmolLEDTA(三)主要试剂溶液：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl组成(保护、缓冲)葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的机械剪切作用,防止破坏质粒(保护作用)EDTA的作用是络合掉镁等二价金属离子
6、,防止DNA酶对质粒分子的降解作用（保护作用）Tris-HCl使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用）SolutionII 0.4mol/LNaOH，2SDS,用前等体积混合用前等体积混合溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与NaOH组成(裂解、变性)SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性（裂解细胞和蛋白质变性作用）NaOH（PH12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变性作用）溶液溶液IIIIII：HAcHAc和和 KAcKAc组成的高盐溶液组成的高盐溶液(复性，分离复性，分离)HAcHAc溶液溶液能中和溶液能中和溶液的碱性，使染色体的碱性，使染色体DNADNA变性
7、变性而发生缠绕，并使质粒而发生缠绕，并使质粒DNADNA复性。复性。KAcKAc会与会与SDSSDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀而除去；溶液中的成沉淀而除去；溶液中的DNADNA也会与蛋白质也会与蛋白质-SDS-SDS复复合物缠绕成大分子而与小分子质粒合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNADNA分离。分离。SolutionIII5molL乙酸钾乙酸钾60mL冰乙酸冰乙酸115mL水水285mL TE缓冲液10mmo1LTrisHCl1mmo1LEDTA(pH8.0)胰RNA酶溶液将RNA酶溶于10mmo1/LTrisHCl(pH75)和15mmo1/LN
8、aCl中，配成10mg/mL的浓度，于100加热15min，缓慢冷却至室温，保存于-20。四、实验步骤加加加加1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml培养物于培养物于培养物于培养物于EPEPEPEP管，管，管，管，12000g2min12000g2min12000g2min12000g2min 除去上清，加入冰的除去上清，加入冰的除去上清，加入冰的除去上清，加入冰的200 200 200 200 l l l l 溶液溶液溶液溶液I I I I，剧烈振荡，剧烈振荡，剧烈振荡，剧烈振荡EPEPEPEP管，室温管，室温管，室温管，室温3min3min3min3min 加入加入加入加入30030030
9、0300 l l l l 溶液溶液溶液溶液IIIIIIII，快速颠倒数次，冰浴，快速颠倒数次，冰浴，快速颠倒数次，冰浴，快速颠倒数次，冰浴3min3min3min3min 加入加入加入加入400400400400 l l l l 冰冰冰冰溶液溶液溶液溶液IIIIIIIIIIII，温和振荡，温和振荡，温和振荡，温和振荡10s10s10s10s，冰浴，冰浴，冰浴，冰浴5min5min5min5min，12000g5min12000g5min12000g5min12000g5min转移上清到新吸附柱，加入漂洗转移上清到新吸附柱，加入漂洗转移上清到新吸附柱，加入漂洗转移上清到新吸附柱，加入漂洗液液液液
10、，12000g1min12000g1min12000g1min12000g1min（反复（反复（反复（反复)吸附柱开盖室温静置吸附柱开盖室温静置吸附柱开盖室温静置吸附柱开盖室温静置1min1min1min1min，加入加入加入加入50-100 50-100 50-100 50-100 l l l l洗脱缓冲液回收纯化的质粒洗脱缓冲液回收纯化的质粒洗脱缓冲液回收纯化的质粒洗脱缓冲液回收纯化的质粒DNA DNA DNA DNA 取10 l的质粒DNA加2 l上样液混匀。加到1%琼脂糖凝胶的加样孔内。电泳条件：100V40min。电泳结束后照像保存，结果分析。质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳21 质粒DN
11、A的浓度测定计算公式：1.0OD260nm=50ug/mlDNA质粒DNA(ug/ml)=50OD260nm稀释倍数22一、实验目的通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。琼脂糖凝胶电泳检测DNADNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应,DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子
12、的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。二、实验原理溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物，使DNA在紫外光下发射很强的荧光。在溴化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于DNA的含量，这样就可以检测DNA的浓度。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如上次实验提取的质粒DNA，有3种构型,这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同
13、。三、仪器、材料与试剂(一)仪器1微波炉2琼脂糖凝胶电泳系统3移液器4凝胶成像系统(二)试剂1（1）5TBE(50倍体积的TBE贮存液）配1000mL5TBETris54g硼酸27.5g0.5molLEDTA20mLpH8.0或（2）50TAE(50倍体积的TAE贮存液）Tris242g乙酸57mL0.5molLEDTA100mLpH8.02凝胶加样缓冲液(6x)3琼脂糖4溴化乙锭溶液(EB)0.5ugmL琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是一种海藻多糖，结构单元是D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖。通过改变琼脂糖凝胶的浓度，可以分离200到50,000bp大小的DNA片断。28琼脂糖凝胶缓冲液适用于双链
14、DNA的电泳缓冲液uTris-Tris-乙酸盐和乙酸盐和EDTAEDTA缓冲液（缓冲液（TAETAE）uTris-Tris-硼酸盐缓冲液硼酸盐缓冲液(TBE)(TBE)uTris-Tris-磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液(TPE)(TPE)29DNADNA分子在碱性缓冲液中带分子在碱性缓冲液中带负电荷负电荷，在外加电，在外加电场作用下向场作用下向正极正极泳动。泳动。不同不同DNADNA的的分子量大小及构型分子量大小及构型不同，电泳时的不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带泳动率就不同，从而分出不同的区带。DNA DNA 分子的分子的迁移速度迁移速度与分子量的对数值成反比与分子量的对数值成反比
15、关系。关系。30琼脂糖凝胶操作步骤1.根据电泳需要，配置合适浓度的电泳及制胶缓冲液。取0.5g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入50mL0.5xTAE缓冲液（配1%）2.根据制胶量及凝胶浓度，在加有一定量的电泳缓冲液的三角锥瓶中，加入准确称量的琼脂糖粉。注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相同的。注意：总液体量不宜超过三角锥瓶的50%容量。注意：必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电泳图像模糊不清。注意：加热时如胶液剧烈沸腾发泡，停止加热。微波炉中加热时间不宜过长。注意：由于蒸发作用，溶解前在容量瓶上作一个记号，溶解后用三蒸水补足。u3.在微波炉中加热溶解琼脂糖。324.使溶液冷却至60
16、左右，如需要可在此时加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5ug/ml，并充分混匀。5.将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子。凝胶厚度一般在35mim之间。注意：溴化乙锭是一种致癌物质。使用含有溴化乙锭的溶液时，请戴用手套。溴化乙锭在可见光下会分解。注意：不要产生气泡，影响电泳效果。336.在室温下使胶凝固（大约30分钟），然后放置于电泳槽中进行电泳。注意：凝胶不立即使用时，用保鲜膜将凝胶包好在4下保存，或者放在制胶的缓冲液中，一般可保存25天。电泳缓冲液刚好没过凝胶1mm为好，太多则电流加大，凝胶发热。347.LoadingDNAsamples(加样)用移液枪缓慢将用移液枪缓
17、慢将DNADNA样品样品垂直加入加样孔直至开口下方。垂直加入加样孔直至开口下方。1.1.DNAsamplesDNAsamples：10l10l2.2.LoadingLoadingbufferbuffer(6X)(6X)：2l2l3.DNAmarkers3.DNAmarkers：6l6l Total12l358.电泳接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极，DNA片段从负极向正极移动)。保持电压60-80V。当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。36五、五、实验结果果在紫外灯在紫外灯(360nm或或254nm)下下观察染色后的察染色后的电泳泳凝胶。凝胶。DNA存在存在处应显出桔出桔红色
18、色荧光条光条带(在紫外灯下在紫外灯下观察察时应戴上防戴上防护眼眼镜，紫外，紫外线对眼睛有眼睛有伤害作用害作用)。M 1 五五.问题与讨论：问题与讨论：1.1.简要叙述溶液简要叙述溶液、溶液、溶液和溶液和溶液的作用，以及的作用，以及实验中分别加入上述溶液后，反应体系出现的现实验中分别加入上述溶液后，反应体系出现的现象及其成因象及其成因?2.2.简要叙述酚简要叙述酚-氯仿抽提氯仿抽提DNADNA体系后出现的现象及其体系后出现的现象及其成因成因?3.3.沉淀沉淀DNADNA时为什么要用无水乙醇及在高盐、低温条时为什么要用无水乙醇及在高盐、低温条件下进行？件下进行？4.4.若提取的质粒电泳为单一一条条带，如何判断其若提取的质粒电泳为单一一条条带，如何判断其构型？构型？